异种移植软组织植入物及制造和使用的方法

异种移植软组织植入物及制造和使用的方法
【专利摘要】本申请涉及用于在人体植入中使用的包括软组织的植入物领域。优选从异种移植物来源获得本申请的软组织植入物。本申请提供了中和、去除或基本减少来自异种移植植入物的抗原以及灭菌和/或强化异种移植植入物的化学方法。本发明技术产出了具有优异的结构、机械和/或生化完整性的软组织植入物。本申请也涉及用于处理包括软组织如肌腱和韧带的异种移植植入物的方法，并且涉及由这些方法生产的植入物。
【专利说明】异种移植软组织植入物及制造和使用的方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请涉及并要求于2012年5月11日提交的题为"异种移植软组织植入物及制 备和使用方法"的美国临时专利申请序列号61/646, 229的优先权。该229临时申请通过引 用将其整体结合于此。
[0003] 联邦政府资助的研究或开发
[0004] [不适用]

【技术领域】
[0005] 本申请涉及用于移植，优选移植至人体的组织植入物和组织植入物处理领域。组 织植入物优选是异种移植软组织植入物，但是本申请某些方面可以适用于骨组织或硬组 织，以及更复杂的结构，如结合骨或硬组织植入物或者甚至来自同种异体移植（allograft) 或异种移植来源的器官。本申请提供了中和、去除或基本减少来自异种移植植入物 (xenograft implants)的抗原并且灭菌和/或强化异种移植植入物的化学方法。本发明技 术产出了具有优异结构、机械和/或生化完整性的软组织植入物。本申请还涉及用于处理 包括软组织如肌腱和韧带的异种移植植入物的方法，并且涉及由这些方法生产的植入物。

【背景技术】
[0006] 当病人面对骨科创伤时，如前交叉韧带（ACL)的损伤，对这种疾病的理想的解决 方法是修复这种结构或以重建损伤前的形态的方式增加自然愈合过程。遗憾的是，目前ACL 修复和再生已经显示是基本不成功的，这是由于缺少天然组织自然地愈合/再生；因此，全 置换（total r印lacement)已经成为了护理的标准。已经证明通过捐赠者的遗体（即，同 种异体移植）肌腱的ACL置换是有效的选择，使患者可以回到他们受伤前的生活质量。然 而，由于原材料具有巨大的可变性以及有限的可获得性，同种异体移植的选择背负着挑战。 外科医生通过限制捐赠者的标准（例如，只接受来自45岁以下捐赠者的移植物）努力减轻 移植的可变性；然而，这类限制也加剧了可获得性的挑战。
[0007] 因此，目标是发现具有相似的基因、物理的和生理属性的捐赠者组织的充足的库， 这可以减轻或消除上面的问题。这可以通过利用异种移植组织完成。用异种移植组织来 源，通过育种和群落管理，可以选择和控制供体的基因组成，可以监视和控制生产以确保最 佳的健康和肌肉张力，并且可以计划和选择供体的年龄。这类供体因此具有用于创建高质 量的移植物的优越的生物机械结构，这些移植物可以在它们的巅峰年龄恢复。
[0008] 包括软组织的植入物可以植入受体中以置换和/或修复存在的软组织。例如，遗 传缺陷、疾病、和/或创伤可以损坏软组织，使得置换和/或修复合乎需要。这些植入物可 以是同种异体移植物、自体移植物或异种移植物，而受体可以是人、哺乳动物、或动物受体。 经常使用植入物，其中，受体是人类患者。包括人类患者在内，已使用包括软组织的植入物 来置换心脏瓣膜、韧带、肌腱和皮肤等其他组织中。
[0009] 期望的是处理植入物，特别是自体移植物、同种异体移植物、和异种移植物以中 和、去除或基本减少一种或多种不需要的组分和/或逐渐获得（instill) -种或多种需要 的组分。例如，可以钝化植入物或处理植入物以去除或灭活细菌、病毒、真菌以及其他病原 体和抗原组分。
[0010] 可以用清洁剂和/或Y射线处理包括软组织的植入物。然而，现有技术受到一个 或多个缺点的制约。不期望的来自辐射的结果可包括自由基、氢和低分子量烃的形成；升高 的不饱和度；褪色和氧化。一些化学灭菌剂（例如，戊二醛）的使用增加了引发毒性反应的 危险。此外，一些化学灭菌剂（例如，过氧化物）可以破坏植入物，尤其是软组织，某种程度 上，其倾向于比骨和硬组织更脆弱。关于包括软组织的植入物的钝化的特别关注是处理的 软组织可能经受增加的松弛、降低的硬度、降低的强度或降低的生物相容性，其可以导致植 入物可变的性能。包括用于钝化的方法在内，期望具有不引起过度的松弛或软组织的硬度 或强度或生物相容性下降的处理方法。
[0011] 为了确保破坏病原体，如人免疫缺陷病毒（HIV)，已经使用剂量的γ辐射， 其导致组织的破坏（如，3. 5Mrad ;参见例如，Rasmussen, et al.，J. Arthroscopic and Related Surgery,10(2):188-197, (1994) ；Goertzen, et al.,British Soc. of Bone and Joint Surg.,77:204-211 (805) ；Loty,et al., International Orthopaedics, 14:237-242, (1990))。已经发现使用环氧乙烧导致植入物产生 炎症反应（Kudryk,et al.,J. Biomedical Materials,26:1477-1488, (1992); Thoren, et al. , Clin. Orthopaedics, 318:259-263, (199 5) ； Simonian, et al., Clin.Orthopaedics, 302:290-296, (1994) ；Jackson,et al., Am.J.Sports Medicine, 18:1-9,（1990))。标准的化学溶液处理，虽然能有效地对与引入的化学溶液接触 的表面灭菌，但是倾向于不能充分渗透至其中可能残留潜在的致病生物的组织间隙中。有 关软组织的灭菌，通过辐射、环氧乙烷或化学溶液处理对软组织破坏的潜力尤其受到关注， 因为软组织比骨组织更容易被破坏。甚至更温和的灭菌剂，如过氧化物，由于组织的肿胀以 及残留的反应副产物的存在可以引起损伤。
[0012] 期望的处理过程包括一个或多个下列特征：有效地去除或灭活各种各样的细菌、 病毒和真菌病原体；无移植毒性；保留或改善期望的组织特征，如生物机械强度或生长诱 导特性；对各种各样的操作修改和/或用于多种多样的组织类型的有效性；在最终的植入 物组织容器中终止过程的能力，以确保用于移植的灭菌包装和运输；应用自动化控制和监 视系统以及开发自动化和有效过程的能力。
[0013] 与开发异种移植植入物相关的挑战是充分去除外来的异种抗原。这类表位，特别 是Galal_3Gal_l -4GlcNAc-R(通常称为α-gal)的存在对于中和、去除或基本上降低是重 要的，因为人体具有特异性靶向这类复合糖的抗体。来自外来异种移植来源的移植物，其包 括这种异种抗原，一旦植入，就会被人体剧烈排斥。


【发明内容】

[0014] 一方面，本申请涉及用于人类患者使用的异种移植组织植入物。
[0015] 本申请进一步涉及软组织植入物，优选用于ACL置换，优选设计自异种移植组织。 异种移植来源材料是受控的并且没有牛海绵状脑病（BSE)，或可能对人类受体造成威胁的 其他异种移植特异性或非特异性疾病。处理后获得的移植物在人类受体中是生物兼容的， 没有由于异种基因抗原引起的实质上有害的免疫反应或排斥。在一些实施方式中处理后获 得的移植物是有生物活性的，具有改善的愈合、重塑和结合。
[0016] 本申请另外涉及用于制造包括更适合用于受体植入的软组织的植入物的方法。根 据本发明技术处理的软组织（如，肌腱和韧带），通过与清洁剂，如包含任何氧化灭菌剂（例 如，过氧化氢）、一种或多种去污剂、盐水、碳水化合物、醇、酸或碱组分和/或它们的组合的 溶液接触而完全或部分钝化。优选获得自异种移植来源的组织用于人体移植。在一些实施 方式中，使用至少一种碳水化合物（如，糖）的处理步骤是优选的。
[0017] 优选的方法包括在各种清洁溶液的存在下，含有植入物材料的室中的压力振荡， 可选的使用超声。进行特定的处理步骤以中和、去除或基本减少异种抗原，同时还增强机械 特性并且优选改善植入物的愈合速度。获得的植入物甚至可以比天然组织更强壮，具有降 低的生物负荷水平，并且相比其他可用的组织移植物，还具有更快的植入后的结合。
[0018] 在某些实施方式中，加工（处理，processing)可以发生在开放或封闭的容器中。 例如，本申请的某些方面可以完全或部分在具有光滑边缘的金属、玻璃或聚合物烧杯或皿 中进行用于缓和处理组织以及在容器中注入和排出化学药品。本申请的某些方面还可以使 用具有螺纹或压缩安装盖（其拧紧或卡入以提供封闭来阻止在组织的加工、处理、运输或 储存中的溅出或污染）的容器实施。加工的一些或全部元件可以在具有或不具有压力循 环，以及具有或不具有超声下进行。
[0019] 可以预期，组织可以原地保留，而不同的化学药品或化学药品溶液通过注入或流 过器皿或超过或流过组织，或通过在开放或封闭的器皿、室或容器中加入和去除溶液或处 理化学药品被引入而接触。可以预期，在一个或多个加工步骤之前、之间或之后容器从开放 改变到封闭，以及在任何一个或多个加压步骤之前、之间或之后，可以应用或从处理中去除 加压循环、张力（tension)或超声。进一步预期，组织可以穿过或置于溶液中，随后从溶液 中去除或穿过并且进入另一溶液中用于加工中的下一步骤。
[0020] 进一步预期，本申请的某些实施方式可以应用至或结合至不要求或不设计围绕任 何特定存储或处理器皿的加工场景（processing scenarios)，依赖处理化学剂流过包括骨 或硬组织和肌腱或其他组织的组织的方法，发生在开放或封闭的超声浴中的方法，用于组 织的清创的方法，以及前述的各种组合，如以下那些教导的，例如，在美国专利6, 837, 907、 6, 024, 735、5, 977, 432、5, 977, 034、5, 976, 104、5, 820, 581、5, 797, 871 和 5, 556, 379 中，其 全部结合于此。
[0021] 特别地，应该注意，对于多种组织类型的异种移植物的生产，可以实施涉及受控的 异种抗原的去除或降低的本申请的加工方法，并且该方法对于多种组织类型的异种移植物 的生产是有用的，这些移植物包括软组织移植物，如肌腱、韧带、皮肤、硬脑膜物质、筋膜和 其他结缔组织，并且还包括硬组织移植物，如骨和骨衍生的组分，如皮质骨、松质骨、脱钙骨 基质，组装的骨移植物和天然存在的或硬组织和软组织装配组合的移植物，如骨-肌腱或 骨-肌腱-骨植入物。
[0022] 本申请的方法提供用于植入物加工，凭借此，骨髓、血液、蛋白质和颗粒物质充分 中和、去除或基本减少，使得残留的基本是组织基质、钝化的组织基质、生物惰性组织基质 或生物活性组织基质，其中可以达到任何形式的内源材料和可用的组织的降低。如以下更 详细的描述，优选通过采用引起有效地互相渗透基质的各种清洁和灭菌溶液的压力循环或 振荡的方法实现。通过重复的循环和改变清洁溶液，基本上清堵和净化任何多孔基质通 道。使用定义的程序化的（可选的，预定义的、预程序化）清洗循环，优选用同时超声处理 (concurrent sonication)(也称为超声轰击）以达到植入物的穿透灭菌。应该相信，震荡 液压和超声能量的组合加速了溶液互相渗透以及内源物质的去除。
[0023] 另外地，在处理中使用渗透梯度，其在组织内外产生流。这还称为渗透循环（从低 渗溶液转换至高渗溶液）。这是另一种方法，通过该方法可以有效中和、去除或基本减少骨 髓、血液、蛋白质、异种抗原和颗粒物质。
[0024] 优选的方法包括在清洁过程中使用运动学限制。将运动学限制（优选张力）施加 至植入物，而它与清洁剂（如，例如，去污剂、醇、或过氧化物等）接触可以生产更有效的清 洁，并且减少由于清洁剂引起的任何损害。
[0025] 优选的方法也可以包括将移植物的最终pH增加至碱性水平（pH大于7,优选8左 右）的步骤。不希望被理论束缚，具有碱性PH的软组织移植物可以有助于移植物加强的愈 合。应该相信，至少部分是由于碱性环境增加成骨细胞活性的事实。在一些实施方式中还 可以考虑，可以去掉增加 pH的步骤。没有增加步骤的移植物的pH是在5与7之间、优选约 6〇
[0026] 优选的植入物在表现出至少一种异种抗原的约60%的受控下降，小于约10%的 胰蛋白酶消化，以及大于或等于约1800N的基于分选数据的预测的极限抗拉力（UTF)。
[0027] 在其他实施方式中，植入物表现出至少一种异种抗原的大于或等于约55%的受控 下降，小于约10%的胰蛋白酶消化，以及于大于或等于约2020N的基于分选数据预测的极 限抗拉力（UTF)。
[0028] 在一些实施方式中，本申请以有效和经济的方式提供了用于生产安全和有效的软 组织（优选异种移植物）的方法。在一些实施方式中，本申请提供了用于清洁、灌注或钝化 植入材料的方法，同时，不危害起始植入材料的期望的生物学性能。在一些实施方式中，本 申请生产了降低的抗原性的植入材料，以及优选加强的生物活性的植入物。
[0029] 本申请的一个实施方式是包括用糖溶液处理的异种移植肌腱的异种移植肌腱植 入物，与可比较的同种异体移植植入物或自体移植植入物相比，其表现出加强的术后愈合 和/或强度。
[0030] 该异种移植植入物可以由大量可接受的异种移植来源获得。例如，植入物可以是 牛来源的。植入物可以取自圣热特鲁迪斯牛（santa gertrudi s cow)中。
[0031] 异种移植肌腱可以选自存在于体内的多种不同的肌腱。例如，植入物可以包括 前伸肌腱（anterior extensor tendon)。例如，植入物可以包括指内伸肌（Extensor Digitorum Medialis)〇
[0032] 在植入前，异种移植肌腱可以表现出可以接受的pH。例如，在植入前，植入物可以 表现出pH为约8。可替换地，在植入前植入物可以表现出约8的pH。
[0033] 糖可以是任何可以接受的糖。这类糖的实例包括葡萄糖、右旋糖、结晶葡萄糖、醛 糖、酮糖、半缩醛、吡喃糖、呋喃糖、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、 木糖、来苏糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、蔗糖和果糖。
[0034] 在一个实施方式中，植入物表现出至少一种异种抗原的约60%的受控减少，小于 约10%的胰蛋白酶消化，和大于或等于约1800N的基于分选数据的预测的UTF。减少的异 种抗原可以是a-Gal。在可替换的实施方式中，植入物表现出至少一种异种抗原的约60% 的受控减少，小于约10%的胰蛋白酶消化，和大于或等于约2020N的基于分选数据的预期 的 UTF。
[0035] 本申请的一个实施方式是加工异种移植肌腱的方法，包括：从肌腱中去除异种抗 原，增强肌腱的强度、肌腱灭菌、化学漂洗肌腱、可选地分解来自肌腱的残留的过氧化物以 及可选地提高（促进，promoting)肌腱的碱性。这些步骤可以以这种顺序或另外的顺序进 行。
[0036] 该方法可以进一步包括一个或多个使特定的处理化学溶液接触肌腱的步骤。
[0037] 异种抗原去除的一个阶段或多个阶段可以具有大于或等于约1的水与化学药品 比率（WCR)。分子强度增强的一个阶段或多个阶段可以具有小于约1的水与化学药品比率 (WCR)。灭菌的一个阶段或多个阶段可以具有小于或等于约1的水与化学药品比率（WCR)。 整个方法可以具有大致约〇. 90的水与化学药品比率（WCR)。
[0038] 本申请的一个实施方式是牛肌腱置换移植物（graft)，包括回收自以下的经加工 的（经处理的，processed)前伸肌腱：（1)纯种的圣热特鲁迪斯（Santa Gertrudis)、婆罗 门（Brahman)、安格斯（Angus)(即，100%的这些中的仅一种）；（2)具有25%至100%的圣 热特鲁迪斯牛、婆罗门或安格斯或这些的组合的杂交种；（3)具有50%至100%的圣热特鲁 迪斯牛、婆罗门或安格斯或这些的组合的杂交种；或（4)包括选自圣热特鲁迪斯牛、婆罗门 或安格斯的至少一个祖先的任何杂交种；移植物回收自年龄在约18个月至约36个月之间 的、并且在回收前至少约200kg热标准胴体重（HSCW)的动物。
[0039] 移植物可以用于人的前交叉韧带（ACL)的置换。移植物可以是具有大于平均的天 然人ACL的失效强度的移植物。
[0040] 在一个实施方式中，前伸肌腱可以是指内伸肌（趾内伸肌，Extensor Digitorum Medialis) (EDM)。在一个实施方式中，动物的年龄可以是在约18个月和约24个月之间。在 一个实施方式中，回收前，动物是至少约295kg HSCW。

【专利附图】

【附图说明】
[0041] 图1示出了用于分选肌腱的单股相关性的计算方法。
[0042] 图2示出了环状植入物的拉力数据。示出了通过本申请的方法生产的肌腱，相对 于无菌处理的牛肌腱，相对于对比的人肌腱。
[0043] 图3A-图3C示出了 3个月的尸体解剖的，40x的不同组织。图3A示出了，在狒狒 中植入后由本申请的方法产生的牛肌腱。图3B示出了未处理的牛肌腱（对照）。图3C示 出了用于比较的天然ACL。
[0044] 图4A-图4C示出了不同的组织学比较。图4A示出了，在狒狒中植入后，通过本申 请的方法产生的牛肌腱（3个月，40x)。图4B示出了用于参考的人胭绳肌腱自体移植（5个 月，200x (现有技术：Marumo 2005))。图4C示出了狒狒天然ACL (40x)。
[0045] 图5A-图5F示出了用于比较的股骨隧道的不同的组织学切片。图5A示出了在狒 狒中植入后，通过本申请的方法生产的牛肌腱（4x)。图5B示出了指定区域的放大图（20x)。 图3C示出了用于比较的，3个月后的人自体移植400x(Scranton 1998)。图示出了在狒 狒（IOx)中移植后，通过本申请的方法生产的牛肌腱。图5E示出了指定区域（40x)的放大 图。图5F示出了用于比较的在6个星期的人自体移植400x(Scranton 1998)。
[0046] 图6A-图6F示出了用于比较的胫骨隧道的不同的组织学切片。图6A示出了在狒 狒（4x)中植入后，通过本申请的方法生产的牛肌腱。图6B示出了指定区域（20x)的放大 图。图6C示出了用于比较的，在3个月的的人自体移植400x(Scranton 1998)。图6D示出 了在狒狒（4x)中植入后，通过本申请的方法生产的牛肌腱。图6E示出了指定区域（40x) 的放大图。图6F示出了用于比较的在6周的人自体移植，400x(Scranton 1998)。

【具体实施方式】
[0047] 一方面，本申请涉及包括用于在人体植入中使用的软组织的植入物领域。优选从 异种移植物来源获得本申请的软组织植入物。本申请提供了用于加工植入物材料的新方 法，包括，但不限于，自体移植、同种异体移植或异种移植材料，包括骨和软组织，优选软组 织，如韧带或肌腱。具体地，根据本申请的方法处理的异种移植软组织材料允许移植物被充 分地清洁、机械制造/成型/修整、灭菌、包装随后以迄今不可能的经济的尺度植入。进行外 来异种抗原的充分清除，使得本申请的植入物一旦置入，不会被人体强烈排斥。本申请的异 种移植软组织植入物提供了足够的结构、机械和/或生化完整性以作为，如ACL置换使用。 这些植入物具有用于增强的机械性能和增强的愈合性能的潜力（相比现有ACL移植选择）。 术语"移植物"和"植入物"在本文中可互换地使用。
[0048] 如本文使用的，术语"钝化"意在涉及从植入物中去除潜在的致病生物和免疫原物 质。因此，该术语意指无菌度和下降的抗原性二者，虽然该术语并不旨在排除植入物的有益 的生物学性能，如成骨性能（骨传导和骨诱导；骨融合），天然组织功能，以及植入物的期望 的结构强度。术语"钝化"优选是指术语"灭菌"，因为当灭菌是目标时，该术语具有绝对的 含义，于其而言，确定性测试的能力由进行这类测量的技术状态和/或由对于伴随的组织 破坏的需要限制。此外，虽然根据本申请的方法生产的植入物可能并不完全没有任何抗原 性或致热源性，但是极大地降低了这些不需要的方面，而这也是如本文使用的术语"钝化" 意指的。
[0049] 如本文使用的术语"生物惰性"意指不被宿主身体排斥或强烈攻击的钝化的植入 物。
[0050] 如本文使用的术语"生物活性"意指具有改善的愈合、重塑和/或结合的植入物或 组织，其相比非生物活性的植入物或组织，以更高的速率，更快，具有更高的质量或具有更 高的坚固性（robustness,鲁棒性）表现出至少一种或多种愈合或生长现象。
[0051 ] 如本文使用的，术语"灌注的"或"灌注"旨在暗示将清洁溶液充分互相渗透进入 并且穿过旨在用于植入受体的材料的通道和裂缝。
[0052] 如本文使用的，术语"快速"或"快速地"，如它们应用至根据本申请的压力循环的 方法时，是指秒到分，而不是小时或天的数量级的时帧。
[0053] 如本文使用的术语"超声"或"超声处理"是指在允许超声能量充分转移至植入物 的条件下，在根据本申请的方法进行加工时，通过植入物的容器应用超声或超声能量。也称 为超声轰击。超声能量可以穿过液体转移至工件，使得达到充分的清洁和细菌或细胞破坏， 而不导致对工件的整个超结构损害。
[0054] 如本文使用的"软组织"是指除了骨以外的任何生物组织，包括但不限于，肌腱、韧 带、筋膜、全部关节、硬脑膜（dura)、皮肤、心包膜、心脏瓣膜、静脉、神经组织、粘膜下层组织 (submucosal tissue)(例如，肠组织）和软骨。
[0055] 本文描述的"软组织"典型地是胶原材料，其是自体移植物、同种异体移植物或异 种移植物，优选异种移植物。软组织可以是预定长度的肌腱、相同或不同长度的肌腱束、预 定长度的韧带、相同或不同长度的韧带束、一段或多段心包膜、真皮、筋膜、硬脑膜、皮肤、粘 膜下层组织（例如，肠组织）、软骨或它们的组合。优选地，软组织的来源是异种移植肌腱。
[0056] 如本文使用的"植入物"（或"移植物"）是指认为其植入人或动物是有益的任何 材料。因此，植入物可以是组织衍生的材料，如骨、皮肤等，或它可以是可能需要清洁、灭菌 或钝化的具有外表面和内部结构的金属或合成材料。植入物可以包括自体移植组织、同种 异体移植组织、异种移植组织或它们的组合，并且，对于矿物化组织，如骨，植入物可以包括 矿物化组织、部分去矿物化组织、完全去矿物化组织和它们的组合。植入物可以包括单一的 或整体的移植物材料，组装的骨材料，如在美国专利申请序列号09/782, 594和09/941，154 中描述的那些，成形的植入物，如在美国专利号6, 440, 444和6, 696, 073中描述的那些，以 及同种异体基因生物相容基质，如在美国专利申请序列号10/754, 310和10/793,976中描 述的那些。本发明的方法和设备也可以在美国专利号D461，248、6, 290, 718、6, 497, 726、 6, 652, 592、6, 685, 626和6, 699, 252中描述的那些植入物的处理中使用。全部的前述专利 和专利申请通过引用结合于此。
[0057] 根据定义，"肌腱"是胶原束，其通常将肌肉的起点连接至骨。根据定义，"韧带"是 胶原组织的带，其连接骨或支撑内脏。然而，某种程度上这类术语在植入物领域可互换使 用，而且对于肌腱的引用，还旨在包括韧带的使用。
[0058] 虽然仅包括软组织的移植物是优选的，但是还包括包含软组织和骨的植入物，如 骨-肌腱-骨移植物。骨-肌腱-骨-移植物包括一个或多个骨块以及附接至一个或多个 骨块上的肌腱（或韧带）。还包括了本申请的某些方面应用至骨或硬组织移植物。本申请 的某些方面可以进一步适用于包括化合物组织、全关节和器官的更复杂的结构。
[0059] 提供了新的方法用于加工包括软组织的植入物，其包括但不限于，骨和软组织、矿 物质化或去矿物质化的组织和包括前述组织类型的组合。具体地，根据本方法处理的软组 织允许软组织充分地清洁、灭菌和/或钝化，没有对软组织过度的结构或化学损伤。虽然同 种异体移植或自体移植软组织可受益于根据本发明方法的加工，但异种移植软组织因其高 可用性和低成本而是优选的。
[0060] 在这种用于生产在人体中是安全和有效的异种移植物的新方法中，本申请提 供了特定的步骤以有效去除外来异种抗原。来自包括外来表位，特别是包括但不限于， Galal-3Gal_l-4GlcNAc-R(常称为α-gal)的异种来源的移植物，一旦植入，通常被人体 强烈排斥。本发明的发明人已经确定了从异种移植软组织植入物中受控的去除α-gal(和 其他外源表位）的重要因素之一是在加工中渗透梯度的受控且集中的使用。
[0061] 本发明人已经确认了制造有生存力的异种软组织植入物的重要步骤之一是使用 至少一个碳水化合物处理的步骤，优选使用葡萄糖溶液处理。异种移植软组织的葡萄糖的 处理允许非酶糖化（glycation)。不希望被理论限制，应该相信，糖化生产"硬化"或"强化" 的组织，这在整个清洁过程中对允许组织保留其机械强度和结构是有益的。本发明人已经 确定如果不进行葡萄糖处理，胶原在相对短的持续（约小于6分钟）时间内对于化学攻击 是敏感的。在一些实施方式中，没有葡萄糖以及糖化现象，在清洁/钝化过程中肌腱可能不 会完全存活（即，失去结构完整性）。对于最初葡萄糖步骤的暴露持续时间，提供给组织最 少约70分钟并且上达至90分钟或更多的暴露时间，对于所使用的浓度是有效的。
[0062] 另外，在该方法中使用了在组织内外产生流的渗透梯度。这还称为渗透循环（从 低渗溶液转换至高渗溶液）。作为非限制性实施例，清洁溶液可以从DI水循环到生理盐水 并且回到DI水。这也可以表达为水与化学药品比率（WCR)。WCR是指在整个方法中，全部 暴露于DI水相对于暴露于化学药品和化学药品混合物（包括生理盐水）。该参数提供了与 去除异种抗原以及去除生物负担是相关的全面的方法梯度。取决于整个方法中设定的步骤 的预期的行为，WCR值设定在不同的水平。最佳使用1. 5至2的数量级的值以从植入物中 去除不需要的材料。然而，如果参数设置过高则可以对植入物结构产生有害作用。在一些 实施方式中，优选设置是〇. 6至1. 05之间以在给定的加工步骤中平衡竞争的设计说明。
[0063] 对于真空压力对正压力的总暴露可以以真空对压力比率（VPR)的方式定义，还发 现其是对于去除植入物中不需要的材料的重要因素。VPR还对植入物的机械性能有影响。 在4的数量级的值对于改善植入物张力（strain)和极限延长（增加）具有有益的作用，同 时还防止胶原组成的分子损伤，这将使得植入物在植入后更容易受到酶降解。然而，如果设 置过高，该参数可以影响可以从植入物中去除不需要材料（即，异种抗原）的相对效率。在 一些实施方式中，优选的设置是位于1. 90和2. 40之间以平衡竞争设计说明。
[0064] 通常，WCR如下计算：
[0065] 在组织仅暴露于DI水的过程中的总时间=水暴露（分）
[0066] 在组织暴露于任何其他化学药品或化学药品的组合而不是水（对于该计算，认为 盐水是化学药品）的过程中的总时间=化学暴露（分）
[0067] "水暴露" / "化学暴露" =WCR
[0068] 可以对整个过程计算该比率，也可以在每个过程步骤计算。如本文使用的，过程步 骤表示意味着在最终产品中产生特异性设计特性的配方区域（recipe region)。每个过程 步骤包括多个过程阶段或由它们组成。每个阶段由在指定的条件，如接触时间、温度、压力、 真空、压力循环和超声下暴露至组织的特定化学溶液组成。
[0069] 高的WCR表明在整个过程中或在过程的特定步骤中，水暴露比化学剂暴露更多。 例如，2的值将表明对于给定的步骤或对于整个过程，存在比化学多达2倍的水暴露。已经 测定WCR对全部的利益因素具有大的影响（如，a-gal去除，强度等），并且还对变化非常 敏感。在一些情况下，在说明中的重要的区别、产率等可以通过改变该参数少至约0.01单 位达到。这表明流体运动（即渗透循环）在该过程中是非常重要的以达到期望的植入物属 性。
[0070] 已经在相关的a -gal去除中观察到WCR的重要作用。在高比率（如，1. 5至2. 0 或更高）时，它改善a-gal的去除，但更高的值倾向于"弱化"肌腱。在低值（如，小于1. 0) 时，具有残留化合物毒性水平的可能性增加。因此，整个过程中，对于本申请的某些实施方 式，WCR优选设置在约1.0。
[0071] 一般地，VPR如下计算：
[0072] 在组织暴露于真空的过程中的总时间=真空暴露（分钟）
[0073] 在组织暴露于压力的过程中的总时间=压力暴露（分钟）
[0074] "真空暴露" / "压力暴露" =VPR
[0075] 也在每个过程步骤计算该比率。高的VPR值表示相比压力暴露，存在更多的真空 暴露（对于整个运行或对于特定的步骤）。发现该参数不仅影响机械特性还影响a -gal的 去除。
[0076] 在清洁、灭菌和/或钝化包括软组织的植入物中可以采用前述方法。前述方法通 常将包括在可选的超声处理下，在清洁剂和植入物接触期间，通过循环上升和/或下降的 压力用清洁剂灌注植入物。此外，在该过程期间使用在组织内和组织外产生流的渗透梯度。 在优选的实施方式中，包含要处理的植入物的处理室用清洁剂填充（通常提供作为包含某 种浓度的清洁剂的溶液）。当植入物浸入清洁剂溶液中时，在清洁剂与植入物接触期间，处 理室中的压力循环地增加和下降，可选地用并存的超声。通过循环增加和降低压力，使清 洁剂灌注至植入物。因此，在各阶段内或各阶段之间、在各步骤内或各步骤之间以及贯穿整 个过程，通过压力循环的速率、循环的事实和压力循环的幅度，以及进一步通过WCR和PVR 比率的大小、这些比率的变化和这些比率的排序，实现植入物或其部分的深度的、穿透的清 洁、灭菌和/或钝化。因此，整个过程可以成功地在一个大气压之上或之下的压力下成功地 进行。优选地，整个过程在室中进行，该室在整个过程中或过程的特定阶段允许其内含物的 超声处理。此外，优选地，整个过程在电脑的可编程系统或可编程逻辑电路控制下进行整个 过程，使得手动加工最小化并使加工的可再现性最大化。其中，经加工的组织是任何形式的 同种异体移植或异种移植组织，适当溶剂的选择具有的另外的优点是，与如果不包括这类 处理相比产生甚至更低抗原性的经加工的组织，在一些实例中可以具有增强的强度、硬度 或其他机械性能以及增强的愈合、重塑或其他生物或生化性能的另外优点。
[0077] 当采用循环的压力时，升高的压力可以高达高于环境压力约200磅每平方英寸 (PSI)，可替换地高于环境压力约150 PSI、可替换地高于环境压力约100 PSI，并且可以低 至高于环境压力约75 PSI、可替换地高于环境压力约50 PSI、可替换地高于环境压力约25 PSI、可替换地高于环境压力约15 PSI、可替换地高于环境压力约5 PSI。通过该方法可以预 期更高的压力，虽然避免由于这类压力导致的设备故障或组织损伤的压力是合乎需要的。 该下降的压力或真空可以高至约环境压力，可替换地低于环境压力约4 PSI、或可以低至低 于环境压力约8 PSI、可替换地低于环境压力约12 PSI、可替换地低于环境压力约14 PSI、 可替换地低于环境压力约14. 7PSI。如上面指明的，任何高压和低压可以结合以限定一系 列压力，只要选择的最小值等于或小于选择的最大值。术语环境压力适用于该方法进行的 地点的标称大气压或任何合适的参考压力，对于该方法给定的实例，该参考压力可以作为 参考用于反应室内压力的测量。当使用快速循环增加的或降低的压力时，压力循环的速率 可以是至少约1秒，可替换地至少约2秒、可替换地至少约5秒、可替换地至少约10秒、可 替换地至少约20秒、可替换地至少约30秒、可替换地至少约50秒、可替换地至少约60秒、 可替换地至少约120秒、可替换地至少约180秒、可替换地至少约240秒。当使用快速循环 的压力时，压力循环的速率可以是最多约5分钟、可替换地最多约4分钟、可替换地最多约 3分钟、可替换地最多约2分钟、可替换地最多约110秒、可替换地最多约100秒、可替换地 最多约90秒、可替换地最多约60秒、可替换地最多约45秒、可替换地最多约30秒、可替换 地最多约20秒、可替换地最多约10秒。如上面指明的，任何最大和最小速率可以结合以限 定一系列的速率，只要选择的最小值小于或等于选择的最大值。
[0078] 在一个大气压之上或之下的压力下可以成功进行处理过程。25英寸汞柱（约 85kPa或约12. 5PSI)和室中溶液的蒸汽压之间的排空压是适当的。约40和100PSI之间 (约276kPa和690kPa之间或约80和200英寸汞柱之间）的后填充压是合适的。在美国专 利号6, 482, 584、6, 613, 278和6, 652, 818中描述了快速循环的压力的使用；每篇均颁发给 本受让人，并且每篇都通过引用结合于此。
[0079] 在一个实施方式中，整个过程在处理室中进行，该处理室在整个过程中或过程的 特定步骤中允许其内含物的超声处理。此外，优选地，整个过程在电脑的可编程系统中或可 编程逻辑电路控制下进行，使得手动加工最小化并且使加工的可再现性最大化。在植入物 置于处理室后，用清洁溶液将室填充至充分浸没溶液中的植入物的水平（虽然在室内保留 了一些预留空间以促进快速的压力循环）。
[0080] 本方法包括用于异种移植软组织处理的清洁剂的新的顺序。在本方法优选的实 施方式中，一种或多种清洁剂与包括软组织的植入物接触以中和、去除或基本减少血液、月旨 肪、细胞、蛋白质、抗原、细菌、病毒、真菌或其他材料。在美国专利号6, 482, 584、6, 613, 278 和6, 652, 818中描述了某些清洁剂（和使用这些清洁剂的方法），其全部通过引用结合于 此。清洁剂包括但不限于，去污剂、消毒剂（有时称为消毒试剂）、净化剂（有时也称为净化 试剂）、抗生素、杀病毒化合物等。可以使用特定的试剂（如碳水化合物）以增强组织性能 和/或用于组织保护。另外，可以使用高渗溶液或低渗溶液以建立渗透梯度。
[0081] 可以以溶液或其他混合物的形式提供清洁剂。优选，清洁剂作为水溶液（优选使 用DI水）提供。例如，可以使一种或多种以下清洁剂与包括软组织的植入物接触：包含任 何氧化杀菌剂（例如过氧化氢），一种或多种去污剂，盐水，碳水化合物，与水混溶的醇，如 乙醇或异丙醇，碳酸氢钠和/或它们的组合的溶液。
[0082] 用于本方法中使用的合适的醇包括甲醇、乙醇、丙醇（包括异丙醇）和丁醇（包括 异丁醇和叔丁醇）。异丙醇是目前优选的。以溶液或混合物提供醇，具有按重量计（wt%) 约0. 1 %至约100 %，可替换约5 %至约95 %，可替换约20 %至约90 %的优选的浓度范围。 优选的醇是具有低分子量（例如，在约32g/mol至约360g/mol的范围，可替换地具有分子 量等于或小于约61g/mol、可替换地约90g/mol、可替换地约120g/mol、可替换地约240g/ mol、可替换地约360g/mol的醇）和/或具有低于本方法使用的实施方式的操作条件下的 熔点的那些。可以期望可以使用其他保护试剂代替醇，例如多元醇。优选的多元醇是具有 相对低的分子量（例如，从约32g/mol至约360g/mol范围）的那些。
[0083] 在本方法中使用的氧化灭菌剂包括过氧化物、氧化物、次氯酸盐，过羧酸和臭氧。 用于在本方法中使用的优选的过氧化物是过氧化氢。可以以溶液或混合物提供氧化灭菌 齐U，具有优选的按重量计（Wt% )约1%至约15%的浓度范围。
[0084] 碳水化合物（或通常称为"糖"）可以是二糖或单糖或更复合糖。例如，那些可以 在本方法中使用的包括，但不限于，葡萄糖或右旋糖或结晶葡萄糖或醛糖或酮糖或半缩醛 或吡喃糖或呋喃糖或赤藓糖或苏糖或核糖或阿拉伯糖或甘露糖或阿洛糖或阿卓糖或木糖 或来苏糖或古洛糖或艾杜糖或半乳糖或塔罗糖。也可以考虑二糖（如蔗糖或果糖）。优选 的是葡萄糖。可以考虑"D"糖（天然存在的）以及"L糖"，"D"构象是优选的。
[0085] 可以以溶液或混合物提供碳水化合物，具有按重量计（wt % )约40 %至约50 %的 优选的浓度范围。使用DI水作为溶剂，优选45wt %。可替换地，碳水化合物浓度是可预期 的，包括更低的浓度如，20 %或30 %和更高的浓度如55 %、57 %、60 %或70 %。在某些优选 的实施方式中，约40至50wt %之间的过饱和葡萄糖溶液是优选的。当饱和溶液的条件变化 时，例如升高温度、降低饱和液体的体积（如通过蒸发），或升高压力，制备或得到过饱和溶 液。
[0086] 在方法中使用的盐水溶液包括但不限于有机和无机盐溶液。无机盐的实例是熟知 的，并且包括但不限于，NaCl、NaF、NaBr、KC1、KF和KBr。有机盐的实例包括但不限于乙酸 钠（CH 3COONa)、柠檬酸钾（C6H5K3O7)、乙酸铵（NH 4+CH3C00_)、乳酸钠（NaC3H5O3)或由有机羧酸 与无机碱的反应产物得到的其它盐。考虑用于与本申请使用的盐度的浓度范围为约〇. 6% 至35%。特定的实施方式可以使用27%的盐水，其他实施方式可以使用5. 9%的盐水，其他 实施方式可以使用0.7%的盐水，其他实施方式可以使用0.9%的盐水，其他实施方式可以 使用1%的盐水，其他实施方式可以使用6%的盐水，其他实施方式可以使用10%的盐水， 其他实施方式可以使用20%的盐水。
[0087] 在本申请方法的一些实施方式中还使用碳酸氢钠 （Sodium bicarbonate or sodium hydrogen carbonate)(通常为小苏打；化学式NaHCO3)。碳酸氢钠是结晶的白色 固体，但通常作为细粉末出现并且在水中是可溶解。它通常也被称为面包苏打、烹调苏打 和小苏打。在口语的使用中，它的名称简称为碳酸氢钠盐（sodium bicarb)、碳酸氢盐苏打 (bicarb soda),或者干脆是碳酸氢盐（bicarb)。
[0088] 可以制备包括非离子去污剂、阴离子去污剂或二者的去污剂溶液。考虑用于本申 请的方法中使用的非离子去污剂包括，但不限于，醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、烷基 多糖苷、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨糖醇、或任何的Triton?, Tween?或Brij?系列去污 齐U (如Triton? X-100)。考虑用于本申请的方法中使用的非离子去污剂包括但不限于烷 基苯横酸盐、烧基横酸盐、烧基憐酸盐或烧基硫酸盐，如十-烧基硫酸纳盐、十四烧基硫酸 钠盐、十六烧基硫酸钠盐、固醇（steryl)硫酸钠盐和油基（oleyl)硫酸钠盐（例如，十二烧 基硫酸钠 （SDS ;也称为SLS))。Triton? X-100和SDS(SLS)是优选的。已经使用Triton? X-100和SDS处理骨和软组织许多年。（参见例如，美国专利号4, 801，299)。使用的浓度是 按重量计约0. 5或1% (wt% )，虽然可以使用其他的浓度，例如约0. 1至10wt%之间。还 可以混合去污剂与过氧化物用于更有效的清洁。
[0089] 十二烧基硫酸钠（SDS或NaDS)，也被称为月桂硫酸钠 （sodium Iaurilsulfate或 sodium lauryl sulfate) (SLS)是具有式CH3 (CH2)11OSO3Na的有机化合物。它是在许多清洁 和卫生产品中使用的阴离子表面活性剂。该盐是由连接至硫酸根基团的12-碳尾（tail) 组成的有机硫酸盐，给予材料去污剂需要的两亲的性能。Triton X-IOO(C14H22O(C2H4O) n)是 非离子表面活性剂，其具有亲水的聚氧化乙烯链（它平均具有9. 5个氧化乙烯单元）以及 芳族烃亲脂或疏水集团。该烃基是4-(1，1，3, 3-四甲基丁基）-苯基基团。这涉及去污剂 的普郎尼克范围。普郎尼克是氧化乙烯和氧化丙烯的三嵌段共聚物。形成自氧化乙烯的部 分比形成自氧化丙烯的部分更亲水。Triton? X-100也是通常使用的去污剂。
[0090] 优选的特定的清洁剂是过氧化氢、异丙醇、Cali mu lse? SLS、Triton? X-100 (TNBP)、氯化钠溶液、葡萄糖和NaHC03。
[0091] 不希望受制于特定的理论，相信在一些实施方式中，碳水化合物，优选葡萄糖的处 理，提供给移植物分子强度。通过非酶解糖化，胶原轻微反应。该"老化"组织的步骤使得 它在生化上更成熟，同时在后续步骤中还保护它免于化学分解。使用过氧化物和去污剂，以 及盐水处理用于异种抗原的去除。通过空化、化学分解和渗透梯度，从组织从去除不需要的 抗原和细胞。通过暴露于氧化剂和去污剂下灭菌，连同空化使任何外来生物负荷变形，随后 从组织中洗出。醇处理改善了机械强度（主要增加刚度）。化学药品漂洗（如，水）用于 膨胀组织以去除并稀释之前步骤留下的残留化学药品。可选地，进行分解残留过氧化物的 步骤。在该步骤中可以加入小苏打（NaHCO 3)以便活跃地降解过氧化物的超氧化物键。小 苏打将移植物的最终PH从酸性增加至碱性。在一些实施方式中，最终pH是约8,可替换地 至少约7. 0,可替换地至少约7,可替换地至少约7. 5,可替换地至少约8. 5,可替换地至少约 9。但不希望受到理论束缚，移植物的碱性pH还有助于增强移植物的愈合。应该相信由于 这个事实，即碱性环境增加了成骨细胞的活性。
[0092] 然而，中还考虑在一些实施方式中可以删除上面增加 pH(和/或分解过氧化物的 超氧化物键）的步骤。没有增加步骤的移植物的PH是在5与7之间、优选约6。
[0093] 本方法可以包括用试剂处理植入物的一个步骤或多个步骤，该试剂能增加用于加 工的组织的表面面积（如，通过膨胀该组织）。例如，可以在期望的PH下用溶液处理组织， 和/或可以在一个或多个加工时期维持期望的pH。
[0094] 另外，根据本发明的技术，在清洁试剂应用至软组织之前、之间和/或之后，软组 织由张力运动学地限制（kinematically restrained)(如下面描述的）。运动学限制可以 作为单个限制或作为多个限制应用。运动学限制可以以常态的方式或可变的方式应用，例 如稳定的状态或时间变化的方式。
[0095] 更具体地，用包括软组织的植入物装载可加压处理室，可选地，将压力施加至软组 织。将进一步理解，植入物可以包括单独的软组织或软组织和骨和/或合成材料的组合。 [0096] 将清洁剂引入至处理室。通常将足量的清洁剂引入以浸没植入物（换言之，该植 入物浸没在清洁剂中）。在清洁剂以及可选地超声的存在下，使用升高的和下降的压力的一 系列的"η"循环将清洁剂压入植入物基体。植入物的基体通道（包括软组织的内部）被重 复填充并排空清洁剂，以及振荡压力的结果是将组分去除。该步骤循环的次数可以是1至 约150次（其中，η = 1-150)可替换地，约10至约50次，可替换地约2至约30次）。
[0097] 清洁剂在此接触的合适的温度部分取决于清洁剂及其浓度。在一些实施方式中， 转移温度设置在20°C，并且不进行液体的主动加热。化学药品流/超声的行为可以将试剂 "加热"至高达39°C。通常处理室温度在约27至35°C之间。在一些实施方式中，更高的温 度（40°C及以上）可以开始使组织的化学性能退化。对于肌腱，50°C及以上可以开始使组织 的结构退化。
[0098] 在不同的阶段，清洁剂可以与植入物接触合适的时间段，例如，约1分钟至约150 分钟；可替换地，约4分钟至约60分钟；可替换地，约60分钟至约130分钟。前述时间段可 以是连续的分钟，或它们可以被植入物与其他清洁剂、漂洗液、或其他溶液接触的时间段分 隔或间隔开。虽然压力处理是优选的并且压力循环是特别优选的，但还考虑本方法可以应 用于在恒定的压力，如环境压力、升高的压力或下降的压力或真空下处理组织。
[0099] 作为本申请的另外的方面，提供方法和设备用于将运动学限制（包括张力、压缩 或固定）施加至植入物，特别是施加至包括软组织，如肌腱的植入物。已经发现，当包括软 组织，如肌腱、骨-肌腱-骨移植物和其他软组织的植入物进行包括与一种或多种清洁剂接 触的处理过程（例如，清洁、钝化、和/或灭菌）时，在处理过程的至少一个或一些部分期 间，对移植物的损害（特别是对软组织的损害）可以通过将张力施加至植入物（特别是软 组织）降低。通过将运动学限制，如张力，施加至软组织，由该处理方法（或它的一个或多 个单独的步骤）引起的损害可以降低、最小化或排除。此外，将张力施加至软组织可以改善 处理过程的有效性和一致性。
[0100] 用于骨和软组织植入物的常规的加工方法包括，例如在美国专利号：5, 333, 626、 5, 512, 662、5, 556, 428、5, 769, 893、5, 797, 871、5, 976, 104、6, 024, 735、6, 293, 970 中描述的 那些，其全部通过引用结合于此；以及其他的专利和出版物。在常规的方法中，包括软组织 的植入物经受处理室，而没有植入物的张力处理或植入物的运动学限制。在这类常规方法 中，在该方法中的软组织的定位和定向可以通过在该过程中使用的清洁剂、工具和方法改 变。该改变的定位或定向可以导致不同的植入物样品之间的不一致性，因为不同的植入物 样品可以具有不同的对清洁剂的暴露（例如，因为重叠的组织或包裹它们周围的组织）。同 样，可以发生不一致的清洁和清洁试剂进入单个组织，因为组织的一个区域可以过度暴露， 因为它在外部，而组织的另一区域成团状，捕获或不恰当地限制在内部，接受了少量的对清 洁剂的暴露。由于与软组织使用常规的灭菌方法可以产生的另一问题是软组织可能萎缩， 导致不期望的外观和结构改变，其可以随后导致过多的术后松弛。而在软组织处理的另一 关注是过多的术后炎症。组织炎症可以通过不同的清洁剂与血液、脂肪、或软组织内的其他 材料的相互作用引起。例如，过氧化物与内源材料的反应可以引起组织膨胀并导致组织损 伤。这些反应通常称为发泡反应，如在过氧化物局部应用至伤口表面所观察到的。对愈合 过程有害的水平的过氧化物反应剩余的副产物最终可以导致术后炎症反应。当组织未被拉 伸时，（如果在处理期间未被限制）发泡反应可以引起更多伤害，由于泡沫和副产物更有可 能在组织内被捕获。
[0101] 本发明方法可以降低、最小化或排除一个或更多前述问题。在处理过程期间，使用 清洁剂通过将张力施加至包括软组织的植入物，可以以期望的方式维持软组织在室中的定 位，并且清洁剂不可能用足够的力施加以改变定位。因为清洁剂更均匀并更可预测地接触 植入物（特别是软组织），在不同的植入物之间和单个植入物内具有更好的一致性。软组织 将具有更小的萎缩倾向，并且因此将具有更小的产生不期望外观的植入物的可能性。通过 在处理过程中将张力施加至软组织，可以降低来自内部发泡反应的炎症和损伤，因为在拉 伸组织外部存在发泡反应的机会更大，而不是保留在组织内以引起更多的损伤。另外，在加 工期间施加的张力将保护移植物免受术后松弛，在常规加工期间，术后松弛可以由移植物 的收缩和萎缩引起。
[0102] 期望提供的用于施加运动学限制的设备具有很少的部件，容易使用并且可以经受 遇到化学药品和环境。对于设备不期望具有过量的约束和致动的部件。此外，设备应该由能 够经受使用和清洁环境的材料制造。例如，期望的设备能够经受具有约120°c (约250° F) 的区域的温度的高压釜中的温度。在高压釜中，蒸汽应当接触并灭菌设备的各种部件。因 此，如果设备具有大量的工件、螺钉、急转弯或小零件，不太肯定该高压釜可以充分灭菌设 备的所有的部件，使得它可以再次使用。
[0103] 用于施加运动学限制的设备应该设计成将大部分或基本上全部的组织暴露于处 理过程中使用的清洁剂。或在处理过程中，通常期望使设备覆盖大量的组织，或者限制清 洁或漂洗溶液的流。设备不仅在用于清洁、钝化、和/或灭菌植入物的过程中有用，而且也 可以有用并适于在贯穿以下的一个或多个步骤中给植入物提供运动学限制：回收、加工、包 装、运输、储存、植入物的术前制备、植入物的术中制备、以及植入物的术中处理。
[0104] 因此，组织张力应该设计成在一个或多个以下范围中施加一定量的张力。用于组 织张力装置（tissue tensioner)的材料应该是强劲的、生物惰性的（换言之，它们不与生 物组织相互作用）并且能够经受预期用于它们的使用和清洁的化学药品和温度环境。用于 组织张力装置的合适的材料包括（但不限于）聚合物、陶瓷，和非腐蚀金属。优选的金属包 括不锈钢、钛、和合金，如镍类合金、或通过用镍或铬镀钢获得的材料。在一个优选的实施方 式中，张力装置的所有部分由合适的廉价灭菌材料，如不锈钢、或其他常见的金属板，或塑 料制作，使得张力装置可以在贯穿加工、包装、运输、储存、和术前准备的一个或多个步骤中 伴随移植物。
[0105] 当将张力施加至牛异种移植肌腱软组织植入物时，施加至肌腱的张力的量期望是 约60-75磅的力之间（约267至约334牛之间）。
[0106] 肌腱是坚韧的纤维结缔组织带，其通常将肌肉连接至骨，并且能够承受张力。肌腱 与韧带和筋膜相似，因为它们都是由胶原制造的，除了韧带是将一块骨连接至另一块骨，而 筋膜是将肌肉连接至其他肌肉。肌腱是粘弹性的结构并且充当中间体以驱动从肌肉到骨的 传输。当拉伸时，肌腱具有软组织机械行为。多个研究已经证明肌腱对生长以及重塑过程 中的机械负荷做出反应，非常像骨。不希望被理论束缚，应该相信在处理期间的肌腱的张力 允许组织的加工处于其更"自然的状态"并且允许更有效的清洁以及保存它的机械结构。设 置使用的张力的量使得随着时间的松弛（同时在张力装置中）最小化。优选的松弛量是在 约100N以下，更优选是在90N以下，并且优选在50N以下。保持在上面的松弛范围允许更 有效的软组织加工。
[0107] 本申请优选涉及设计自牛组织的用于ACL置换的软组织植入物。在一些实施方式 中，这类植入物来自牛肌腱，优选地，肌腱来自动物的下肢（伸肌）。可替换地，可以使用来 自不同解剖位置和不同动物的肌腱、韧带或其他软组织。例如，来自牛或其他异种移植来源 的头、颈、背、尾的肌腱。由本申请的处理过程得到的异种移植软组织植入物比天然组织更 强健，不含生物负荷，并且在植入后比现有ACL选择具有更快的结合。
[0108] 在某些实施方式中，本申请的异种移植软组织植入物具有下列特征：
[0109] 1.优异的强度：限定为比来自胫骨前肌的人体植入物更强健。
[0110] 2.生物相容性：限定为一旦植入没有由于外来抗原引起的明显有害的免疫反应 或排斥。
[0111] 3.灭菌：限定为足够的生物负荷的减少以防止来自受体的不利反应。
[0112] 为了确保该过程去除"有生存力"的生物负荷，可以进行14天破坏性无菌培养。该 测试给出了关于灭菌度水平的保障。
[0113] 加工后，可以进行胰蛋白酶消化测试以测量"生物相容性"。该测量确保了一旦移 植物植入，它不会"立即"（一个月内）吸收和/或降解致使强度不够。该值来自大鼠的研 究，其研究了具有不同的胰蛋白酶和胶原酶消化值的植入物的吸收。发现30%的值与通过 体内机制的不接受的植入物降解高度相关。发现3-5%的值与通过体内机制的可接受的植 入物的降解相关。
[0114] 在加工后，也可以进行过氧化氢残留化学药品分析。该测量可以确保一旦移植物 植入，它不会具有过氧化氢的细胞毒性水平。之前的研究表明该化学药品对于具有>3ppm 的值的组织是有毒性的，不符合ISO 10993-5MEM洗脱测试。然而，由于该测试产生假阳 性结果的历史性质，当施加至组织衍生的移植物时，在一些情况下可以认为大于或等于 IOOppm的结果是可以接受的。
[0115] 异种移植物的一个特征是确定去除外来异种抗原。移除、中和、或基本减少外来的 表位，如Gal a l-3Gal_l-4GlcNAc_R(常称为a -gal)和其他是非常重要的，因为人体具有 特异性靶向这类复合糖的抗体。包括该异种抗原的来自异种移植来源的移植物，一旦植入 就会被人体剧烈排斥。因此测定a-gal的去除。实验性的狒狒的研究表明低至60%去除 的植入物不会被排斥。在该研究中使用了具有40%的去除的阳性对照，其确实引起了大量 的免疫反应。为了测定该去除，采用来自相同的经加工的植入物的平均2个样品。在一个 实例中，发现大于或等于55 %的a -gal的平均去除与可接受的移植表现相关。应该注意去 除的百分比表示相对的不是绝对的a-gal的测量。
[0116] 不希望被理论束缚，应该注意一些残留水平的a -gal实际上可以是有益的。如果 实体充分减少或变性，应该相信异种移植物（其重新合并入人类宿主）中的残留a-gar'片 段"（或其他外来的表位）实际上可以增强愈合。在本申请的牛肌腱移植物中已经发现增 强愈合的一些证据（被组织学支持）。对于该增强的/加速的异种移植植入物的愈合的可 能的解释与疫苗（最特异性的亚单位疫苗）的行为模式是相似的。这类疫苗通过将受体暴 露至感染性细菌或病毒的一部分而发挥作用。这些部分通常是相对感染性生物的非感染性 抗原，其可以引起免疫反应而不引起该疾病的不利反应。据信，相似的反应是通过本申请的 牛肌腱植入物引起的。在ACL置换后的愈合级联的第一阶段是"炎症"阶段（Woo 2000和 Scheffler 1998)。据信，由于"鼓励"抗原或者抗原组合（其有有害作用已经变得更良性） 的存在，已经加速该阶段，然而这些抗原仍然存在以允许受体的反应。因此，在本申请某些 优选的实施方式中，具有以某种下降水平的部分或不完全移除的a-gal认为是生物活性 的，而不是简单的生物惰性。
[0117] 对于ACL置换，优选的移植构型是环状的2股移植物。在该构型中，不考虑环状直 径（LD)尺寸，异种移植植入物具有大于平均天然ACL的失效强度的98. 6%的概率（根据 Woo 1991，天然ACL强度=2160N)。本 申请人:收集的数据表明，本申请的代表性的异种移植 肌腱植入物的平均t = 0拉力（pull strength)是6061N。统计学上该值比在文献中发现 的4股天然胭绳肌的平均值（4590N根据Hamner 1999)大1200N。参见图2和实施例1。
[0118] 肌腱（或韧带）是纤维移植材料，其难于紧握（grip)。因此，使用肌腱移植物的 问题之一是植入时如何固定肌腱。使用的一个解决方法是用具有某种齿或螺钉的构件"咬 住"肌腱，提供在平的表面上改善的紧握。用于这样做的方法使用了挤压螺钉，其朝着它植 入其中的骨隧道壁压缩移植韧带。
[0119] 螺钉可以由非吸收性生物相容材料制造，如不锈钢、钛、钴铬-钥合金或其他合 金。可以使用其他非吸收性生物相容材料，如聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯腈、聚四氟 乙烯、聚酯以及它们的组合。这些螺钉在一端也可以具有孔眼用于附着缝合线。
[0120] 也可以使用生物吸收性螺钉。生物吸收性材料的实例包括：聚丙交酯、聚（L-丙 交酯）（PLLA)、聚（D，L-丙交酯）（PLA)、聚（乙交酯）（PGA)、聚（L-丙交酯-共-D，L-丙交 酯）（PLLA/PLA)、聚（L-丙交酯-共-乙交酯）（PLA/PGA)、聚（乙交酯-共-三亚甲基碳酸 酯）（PGA/PTMC)、聚二噁烷酮（PDS)、聚己酸内酯（PCL)、聚羟基丁酸酯（PHBT)、聚（磷腈）、 聚（D，L-丙交酯-共-己内酯）（PLA/PCL)、聚（乙交酯-共-己内酯）（PGA/PCL)、聚（磷 酸酯）、聚酐、聚乙烯醇、亲水性聚氨酯，及它们的组合。吸收性螺钉也可以由生物复合物制 作。生物复合材料结合生物陶瓷和生物吸收性聚合物，并且改变螺钉的吸收和愈合曲线。生 物陶瓷包括磷酸三钙和羟基磷灰石。
[0121] 另一种固定方法是用纽扣和缝合线将移植物固定在骨隧道中。另一种方法是使用 十字销连接，其以垂直的方式使十字销穿过隧道，以及在一些实施方式中，移植物随后连接 至十字销或套在十字销上。另一种方法是使移植物穿过骨隧道并且从后端出去，随后将移 植物韧带附接至隧道的外部（例如，用螺钉和/或垫圈和/或卡钉）。
[0122] 鉬织来源/规格
[0123] 在一些实施方式中本申请包括优选用于ACL置换的软组织植入物，设计自异种移 植组织，其可以利用现有的规划政策以便能够控制组织材料来源。产品包括详细的牛规格 以确保一致的原材料。异种移植物可以是猪、羊、平胸鸟、马、凯门鳄、牛或任何其它合适的 动物来源。在某些实施方式中，异种移植物优选是牛。
[0124] 植入物可以来自牛肌腱，优选肌腱来自动物的下肢（伸肌），其具有贯穿整个组 织长度的致密的结构。没有BSE的一致的可靠来源的牛组织是优选的。优选移植植入物 回收自来自澳大利亚或新西兰的牛。根据世界动物健康组织（0ΙΕ)，澳大利亚国家没有 BSE(澳大利亚政府农业，渔业和林业的部门，04--06/40((八1181:四1丨3116〇￥6^111161^〇6卩1:· of Agriculture, Fisheries and Forestry. DAFF06/4D))。因此，相对来自美国生养的牛的 BSE的风险，澳大利亚来源是优选的。在一些实施方式中，可以使用可替换的地点，只要由 OIE或其他合适的权威组织确认这类材料没有BSE，并且结构上等效或合适。肌腱回收自牛 的下肢。在一些实施方式中，在人体中用于ACL置换的优选使用的牛肌腱如下：
[0125] 指侧伸肌（趾侧伸肌，Extensor Digitorum Lateralis) (EDL)
[0126] 指总伸肌（趾总伸肌，Extensor Digitorum Communis) (EDC)
[0127] 指内伸肌（趾内伸肌，Extensor Digitorum Medialis) (EDM)
[0128] 这些肌腱中的每个是前伸肌（anterior extensor)，其具有充足的长度用作ACL 置换移植物。来自牛的四条腿中的每条包括这3种肌腱（来自牛的前肢的肌腱由于通常的 屠宰技术被砍短了一点）。优选没有刻痕、伤口或眼泪的组织。优选进行连接至肌腱的外部 结缔组织的重要的去除。在一些实施方式的原材料中，优选的260mm的最小长度是合乎需 要的。该优选的最小长度考虑了在加工期间用于张力调整需要的长度，并且随后生产至少 80_的环状植入物。只要满足长度要求，可以考虑使用其他肌腱。
[0129] 优选使用具有贯穿其长度的一致强度和质量的肌腱，优选牛指内伸肌（EDM)。在 加工前，低温储存肌腱。发现某些牛品种具有优选的长的以及强壮的肌腱。这些牛品种优 选包括（1)纯种的圣热特鲁迪斯、婆罗门、安格斯（即，100%的这些中的仅一种）；（2)具有 25%至100%的圣热特鲁迪斯牛、婆罗门或安格斯或这些的组合的杂交种；（3)具有50%至 100%的圣热特鲁迪斯牛、婆罗门或安格斯或这些的组合的杂交种；或（4)包括选自圣热特 鲁迪斯牛、婆罗门或安格斯的至少一个祖先的任何杂交种。为达到肌腱的最佳的相对强度 和成熟度，动物重量（热标准胴体重，HSCW)优选大于或等于约295kg。然而，在某些实施方 式中，牛的HSCW可以是小于或等于约266kg，以及低至约200kg。
[0130] 为确保加工后更高的产率，以及确保植入物与植入物机械强度上的小的变化，在 原组织植入物参数和极限抗拉强度（UTF)之间发展相关性。在一些实施方式中，发现预计 的2020N的UTF是合乎需要的。在其他实施方式中，任何大于1800N的值可以是合乎需要 的，并且超过1725N的任何值都是可接受的。由于在剧烈活动期间的推测的天然人体ACL负 载，已经报道超过1000N的任何值都是临床上可接受的，以及由于在日常生活的正常活动 期间的推测的天然人体ACL负载，大于445N的任何值都是临床上可接受的。（Noyes 1976)
[0131] 具体参考牛，来自更老的牛的肌腱（例如，超过约18个月龄的牛）是合乎需要的， 因为它们通常更大（大于横截面（CSA))以及更成熟（更好的结构完整性）。然而，已经发 现BSE的发病率在"更老的"牛中更流行，因此必需进行平衡。在一些实施方式中，至少12 个月龄的动物是可以接受的，优选至少18个月龄，可替换约18至24个月之间，可替换约18 至36个月之间，可替换约24至30个月之间，可替换约30至36个月之间，可替换大于36 个月。已知在畜牧业中，通过分析动物牙齿的发展和其他因素确定动物的年龄。例如，发现 小于18个月龄的牛可能没有恒切牙，而发现直到30个月龄的牛可能具有不超过两个恒切 牙。发现直到36个月龄的牛可能具有多达4个恒切牙。因此，通过牙齿的出现测定牛的可 接受性。在一些实施方式中，具有2至4个之间恒切牙的牛是可接受的。
[0132] 至于动物重量，基于历史产出率确定规格。优选的肌腱产率是约80%。这表示接 收的80%的原肌腱具有可接受的尺寸以生产具有2020N或更大的单股（single strand) UTF的肌腱。重量小于约295kg的牛可以极大降低产出率。用于分选的单股相关性公式如 图1所示。由于例如因素，如液体含量和纤维结构的异质性，利用生物材料的工作的许多挑 战是材料性能变化的可能性。为考虑这些变化，如图1描述的，相关性的某些实施方式可以 包括因素，如环状直径、宽度和厚度，它们不仅仅是组织形态的简单的总测量。沿着肌腱的 长度在6个点上测量主要的（宽度）和次要的（厚度）尺寸。使用标准肌腱垫铁（sizing block)测量环状直径（LD)。肌腱形状的限定包括来主轴（长轴，major axis)的6个测量 的主要平均值和来自次轴（短轴，minor axis)的六个测量的次要平均值。用双脚规制作 的主轴测量是优选的，用落差计制作的次轴测量是优选（施加的重量约200-215克）。
[0133] 实施例
[0134] 实施例1
[0135] 在一个实施方式中，移植物使用牛肌腱来源，回收自澳大利亚牛，其具有贯穿植入 物全部长度的致密结构。生产的异种移植物优选在8.0和11. 5mm之间的环状直径（LD)尺 寸并且具有约270mm的平均长度。下表（表1)总结了用于这些移植物的其他相关的尺寸 特征。
[0136] 表 1
[0137]

【权利要求】
1. 一种包括用糖溶液处理的异种移植肌腱的异种移植肌腱植入物，与可比较的同种异 体移植植入物或自体移植植入物相比，所述异种移植肌腱植入物表现出增强的术后愈合和 /或强度。
2. 根据权利要求1所述的植入物，其中，所述植入物是牛来源的。
3. 根据权利要求2所述的植入物，其中，所述植入物取自圣热特鲁迪斯牛。
4. 根据权利要求1所述的植入物，其中，所述植入物包括前伸肌腱。
5. 根据权利要求4所述的植入物，其中，所述植入物包括指内伸肌。
6. 根据权利要求1所述的植入物，其中，在植入前所述植入物表现出约8的pH。
7. 根据权利要求1所述的植入物，其中，所述糖选自葡萄糖、右旋糖、结晶葡萄糖、醛 糖、酮糖、半缩醛、吡喃糖、呋喃糖、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、 木糖、来苏糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、蔗糖和果糖。
8. 根据权利要求1所述的植入物，其中，所述植入物表现出至少一种异种抗原的约 60%的受控减少、小于约10%的胰蛋白酶消化、以及大于或等于约1800N的基于分选数据 的预测的UTF。
9. 根据权利要求8所述的植入物，其中，所述异种抗原是a -Gal。
10. -种加工异种移植肌腱的方法，包括： a. 从所述肌腱中去除异种抗原， b. 增强所述肌腱的强度， c. 将所述肌腱灭菌， d. 化学漂洗所述肌腱， e. 可选地分解来自所述肌腱的残留过氧化物，以及 f. 可选地提高所述肌腱的碱性。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，以a-f的顺序进行各阶段。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中，各阶段的一个或多个进一步包括一个或多个 使特定的处理化学溶液接触所述肌腱的步骤。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中，一个或多个所述去除异种抗原阶段具有大于 或等于约1的水与化学药品比率（WCR)。
14. 根据权利要求10所述的方法，其中，一个或多个分子强度增强阶段具有小于约1的 水与化学药品比率（WCR)。
15. 根据权利要求10所述的方法，其中，一个或多个所述灭菌阶段具有小于或等于约1 的水与化学药品比率（WCR)。
16. 根据权利要求10所述的方法，其中，整个方法具有基本上约0. 90的水与化学药品 比率（WCR)。
17. -种牛肌腱置换移植物，包括回收自以下的经加工的前伸肌腱：（1) 纯种的圣热特鲁迪斯、婆罗门、安格斯（即，100%的这些中的仅一种）；（2)具有25% 至100%的圣热特鲁迪斯牛、婆罗门、或安格斯或这些的组合的杂交种；（3)具有50%至 100%的圣热特鲁迪斯牛、婆罗门、或安格斯或这些的组合的杂交种；或（4)包括选自圣热 特鲁迪斯牛、婆罗门或安格斯的至少一个祖先的任何杂交种；所述移植物回收自年龄在约 18个月至约36个月之间的、并且在回收前至少约200kg热标准胴体重（HSCW)的动物。
18. 根据权利要求17所述的移植物，其中，所述前伸肌腱是指内伸肌（EDM)。
19. 根据权利要求17所述的移植物，其中，所述动物的年龄在约18个月至约24个月之 间。
20. 根据权利要求17所述的移植物，其中，所述动物在回收前至少约295kg HSCW。
21. 根据权利要求17所述的移植物，其中，所述移植物用于人的前交叉韧带（ACL)置 换。
22. 根据权利要求17所述的移植物，其中，所述移植物具有的失效强度大于平均的天 然人的ACL。
23. 根据权利要求1所述的植入物，其中，所述植入物表现出至少一种异种抗原的大于 或等于约55%的受控减少、小于约10%的胰蛋白酶消化、以及大于或等于约2020N的基于 分选数据的预测的UTF。
24. 根据权利要求1所述的植入物，其中，在植入前所述植入物表现出约6的pH。
【文档编号】A61F2/38GK104519835SQ201380036946
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年5月11日
【发明者】丹尼尔·佩德罗索, 米凯莱·埃利 申请人:Rti外科手术有限公司