移植用组织等价物及其制造方法

专利名称：移植用组织等价物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及移植用组织等价物及其制造方法，特别地涉及在体外培养的，含有移植对象细胞并在培养后可向生物体移植的三维结构的移植用组织等价物及其制造方法。
作为移植用组织等价物，已知在片状或薄膜状的载体上播种·培养细胞得到的二维等价物、或在立体的海绵状(多孔体)的载体上培养细胞制得的三维等价物等。这种移植用组织等价物被制作成细胞的分布状态比较均匀。即，在为了修复如软骨损伤等立体损伤的三维组织等价物的构筑中，与二维组织等价物的构筑不同，播种细胞、进行组织培养以便使细胞也分布在组织等价物的厚度方向。
但是，对于三维组织等价物，在使细胞比较均匀地分布的状态下形成组织是非常困难的。特别是在构筑具有一定厚度的大型组织等价物时，营养物大多不能充分扩散至内部。因此，制作这种细胞分布比较均匀的大型组织等价物时，需要长的培养期间，或以高的细胞密度播种细胞。
另一方面，由于组织等价物的硬度与细胞密度或产生基质密切相关，即使在使细胞达到均匀状态来培养的情况，根据移植部位，存在细胞密度过高、组织等价物过硬的情况。这种过硬的组织等价物，柔软性差、即使移植入生物体内与移植周围部分的融合性也不充分、有可能脱落。反之，若细胞密度过低，由于在组织修复时消耗时间、而且向移植周围部分的固定也消耗时间，因此在固定前的期间内有可能脱落。
本发明鉴于上述现有技术的问题，目的在于提供一种可制造比较大型的移植用组织等价物，可迅速进行移植后的向组织周围部分的固定，抑制脱落的移植用组织等价物和这种移植用组织等价物的制造方法。
这样的本发明的移植用组织等价物，由于在表面的至少一部分上具有移植对象细胞或细胞基质丰富的细胞层，移植时该细胞层与移植面接触，移植后向组织周边部分的亲和性升高。而且，本发明的移植用组织等价物，由于在其内部具有比该细胞层更低的移植对象细胞或细胞基质浓度，且主要由细胞培养载体构成的载体层，因此可以赋予移植用组织等价物适当的柔软性，能够确保与移植周围部分的融合性。由此，可获得在移植用组织等价物总体中未均匀地分布移植对象细胞，对生物体的亲和性良好、且与移植周围部分的融合性优异的组织等价物。在移植用组织等价物在组织周围部分固定后，细胞培养载体成为细胞增殖的基础，在体内(生物体内)进行组织重建，移植部分被同种组织重建。
另外，本发明提供一种在体外培养的，含有移植对象细胞并且培养后可向生物体移植的三维结构的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于包括，在构筑上述三维结构的细胞培养载体上包埋移植对象细胞的包埋工序，和将可培养上述移植对象细胞的培养基供给包埋了上述移植对象细胞的细胞培养载体的供给工序，和在上述细胞培养载体的表面的上述移植对象细胞的增殖率比上述细胞载体内部高的条件下培养，并在该细胞培养载体的至少一部分表面上，上述移植对象细胞密度比上述细胞培养载体的内部更高，形成细胞密度不同的两层的培养工序。
在这样的本发明的移植用细胞等价物的制造方法中，由于在包埋了移植对象细胞的细胞培养载体的表面上移植对象细胞的增殖率升高的条件下培养、形成细胞密度不同的两层，因此通过进行培养，可以分别在细胞培养载体的表面上形成移植对象细胞多的层、在内部形成移植对象细胞少的层。
进一步，本发明提供一种在体外培养的，含有移植对象细胞且培养后可向生物体移植的三维结构的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于包括，混合在培养基中可以维持立体结构的流动性载体和移植对象细胞的混合工序，和将通过上述混合工序得到的混合物播种在预先被载置的三维载体的至少一部分表面上的播种工序，和在上述流动性载体的至少一部分中、培养细胞达到实质上移植对象细胞成为密集状态的培养工序。
这样的本发明的移植用组织等价物的制造方法，由于在细胞培养载体表面的至少一部分播种移植对象细胞、形成细胞密度不同的两层，因此可以容易地在细胞培养载体的表面侧形成移植对象细胞丰富的层。
这种组织等价物10具有后述的由培养载体构成的三维结构。组织等价物10的大小虽然根据移植场所的大小而有所不同，但是一般地具有1～10mm的厚度、优选为2～5mm。
组织等价物10具备内侧的载体部分12和表面侧的细胞层14。
载体部分12虽然由构建组织等价物10的三维结构的培养载体、和在移植组织中适合的移植细胞构成，但是主要由培养载体构成，移植细胞的分布比后述细胞层14少。
培养载体还具有适合移植细胞培养的组成，因此，在培养载体中可以成长·增殖移植细胞。作为这种培养载体，虽然可以使用具有适于在生物体内移植的组成的载体、但是优选为生物体吸收性材料或生物体亲和性材料。特别地可以列举，胶原、透明质酸、多聚轮烷(polyrotaxane)、明胶、纤连蛋白、肝素、甲壳质、壳聚糖、昆布氨酸、褐藻酸钙、多聚轮烷水凝胶，它们可以单独或者两种或以上组合使用。
培养载体构筑组织等价物10的三维结构，决定组织等价物10总体的结构。这样的培养载体的三维结构不仅提供移植细胞增殖的基础，也提供与生物体相近的培养环境。因此，特别是在软骨组织或骨组织的再生中使用的培养载体，虽然有必要显示三维结构，但是只要是可以构筑三维结构，可以为任何形态的载体，特别优选为凝胶状或海绵状。
细胞层14连续地在载体部分12的外侧，被配置在组织等价物10的大约整个周围。细胞层14和载体部分12相同，虽然都是由培养载体和移植细胞或产生基质构成，但是比载体部分12含有更多的移植细胞。在细胞层14的移植细胞的细胞密度和载体部分12内部的细胞密度相比，只要是实质上密就可以，优选实质的密集状态、即、密集相邻的细胞之间是连续的。
若在组织等价物10的表面上形成移植细胞层，则细胞层14的厚度多厚都可以，但是优选为20～500μm、特别优选为100～200μm。若比20μm薄，由于不能充分发挥作为含有移植细胞的组织等价物10的功能，所以不优选。另外，比500μm厚的细胞层，考虑到作为移植物过硬的情况、或者由于培养时间被延长、制作时费时而没有效率，所以不优选。
可在组织等价物10的细胞层14和载体部分12两方面都存在的移植细胞是成为移植对象的细胞，可以根据组织等价物10的移植目的地进行适宜的选择。在这种移植细胞中，虽然只要是可向生物体移植的细胞都可以，但是优选通过组织等价物10的三维结构能有效地增殖的细胞，可以列举软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肝细胞和它们的前体细胞。这些细胞可以单独使用，或者根据成为移植目的地的生物体部位组合2种或以上使用。
这些移植细胞，可以根据细胞的种类用对应的公知的采集方法从生物体进行采集。虽然可以将采集的细胞原样使用，但是根据情况，可以在适当的培养基中培养规定的时间后，包埋入培养载体中。
移植细胞在组织等价物10中，由于产生与移植适应性细胞的增殖或移植环境的适应性等相关的细胞基质，所以组织等价物10除了移植细胞外、也可以含有由细胞产生的细胞基质。该细胞基质的浓度由于和移植细胞的基质产生能力及细胞数相关，因此与载体部分12相比细胞层14中的浓度更高。细胞基质可以是由密集的移植细胞产生的，也可以是从外部添加的细胞基质。该移植细胞和细胞基质都是赋予组织等价物10向生物体的生着能力和组织等价物10的硬度的物质。
因此，由于组织等价物10在最外层具有含有丰富的移植细胞或移植细胞及细胞基质的细胞层14，向生物体的生着率高，而且即使经过很长时间也不脱落、可以原样固定。在内侧的载体部分12中，由于细胞数和细胞基质的量都比细胞层14少，组织等价物10的柔软性与细胞数和细胞基质的量成比例地富有，因此从生物体适应性的观点来看，可以将组织等价物10总体的硬度·柔软性调整为良好的值。进一步，组织等价物10由于周围具有细胞和细胞基质丰富的细胞层14，在移植后迅速被固定，固定后、被移植的组织等价物10作为基础在体内(生物体内)可以良好地再生组织。
下面，对于组织等价物10的制造方法进行说明。
组织等价物10可以通过下述工序得到，该工序包括将上述移植细胞在培养载体中包埋的工序，和将培养基供给包埋后的培养载体的工序，和在培养基中培养的培养工序。
在包埋工序中，移植细胞和培养载体通过常规方法被混合(以下，指细胞-载体混合物)。此时，移植细胞的播种密度虽然依赖于预定的培养期间或培养载体的种类、培养基的组成，但是一般地，适合为1×104个/ml～1×108个/ml、优选为约2×104个/ml～2×107个/ml、进一步优选为约2×105个/ml～约2×106个/ml。另外，除非另有说明，播种密度表示在培养载体中包埋的状态下的密度。在此范围外高效率地形成细胞密度或基质密度高的细胞层14是困难的，而且，特别是若比此范围的播种密度少，则由于增殖率不充分，到形成双层结构为止的时间变长，所以不优选。
在供给工序中，可培养移植对象细胞的培养基被提供给在培养载体中包埋得到的细胞-载体混合物中。
在培养中使用的基础培养基，优选为液体培养基，培养使用的中成为培养基基础的基础培养基中，可使用任何在移植细胞通常的培养中使用的公知的培养基。在这种培养基中，可以列举例如杜尔贝科改良的伊格尔极限必需培养基(DMEM)等。培养基的供给，在液体培养基的情况下，如通常一般进行的，通过注入充分量的液体培养基以使具有三维结构的细胞-载体混合物总体成为液面下来进行。在培养载体中包埋得到的细胞-载体混合物原样被载置在适当的培养器中后，将培养基供给该细胞-培养混合物。
培养工序是在包埋入载体的移植细胞的增殖率在载体的表面升高的条件下进行的。这样的高增殖率条件通过移植细胞的细胞种类、播种密度、培养基的组成、相对于载体培养基的浸透能等、或它们的组合来进行选择。
作为高增殖率条件的一例，可以列举，对应于移植细胞种类选择在基础培养基中添加胎牛血清(FBS)等特定种类的血清、增殖因子等。例如，在兔软骨细胞的情况下优选胎牛血清(FBS)。另外，通过适宜选择在可迅速转换为对数增殖期的播种密度、或该播种密度和对载体的浸透率高的培养基的组合可以实现高增殖率。
另外，在向作为高增殖率条件的基础培养基中添加的物质中，可以列举抗坏血酸。通过向基础培养基中添加抗坏血酸，可以提高细胞的基质产生能力或增殖能力。其结果，与组织等价物10的内侧相比，在多数培养基容易浸透的表面侧，由于通过抗坏血酸的作用能产生很多的基质，因此可以形成比载体部分12的产生基质量多的细胞层14。
这里使用的抗坏血酸，若是通常该领域中使用的L型的话，只要是未失去生理活性，可以使用盐、水合物等任何形态。可以列举例如，L-抗坏血酸-2-磷酸、L-抗坏血酸磷酸酯镁盐、抗坏血酸-2-硫酸钠盐、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(维生素C-2-葡糖苷)等稳定型的抗坏血酸。作为在基础培养基中添加的抗坏血酸，在以L-抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物的形态添加时，可以10～300μg/ml、优选50～200μg/ml的量添加。
特别是在基础培养基中添加的抗坏血酸，由于在液体中分解的性质，优选维持在冷冻保存的状态下，被混合在基础培养基中的状态下冷冻保存，优选例如被保存在-5～-20℃下的抗坏血酸。
培养工序可以只在至少在细胞-载体混合物中细胞增殖，在组织等价物10的表面侧和内侧形成细胞数不同的双层的期间内进行，优选到构成细胞层14的细胞成为在表面连续的大致密集的状态为止。由于培养工序在高增殖率条件下进行，组织等价物10的细胞层14迅速形成。在组织等价物10的表面部分中，由于与培养基全面接触，例如，通过选择增殖率高的培养基，可以缩短培养期间。成为该状态的时间根据播种密度和培养基的组成而不同，例如，在2×106个/ml的播种密度时，为2～3周。
组织等价物10的细胞层14配置在载体部分12的外侧的几乎全周上。为了获得具有沿外周的细胞层14的组织等价物10，首先，在培养期间中，从培养器剥下组织等价物10。从培养器中剥下的组织等价物10由于飘浮在培养基中，因此在该状态下通过继续培养工序，沿培养基接触的外周形成细胞层14。
因此，按照本发明，不考虑内部的细胞密度，可以高效地制造对生物体的生着率和固定良好的组织等价物10，即使可以得到的细胞数量少，也可以比较容易地提供大型三维结构的组织等价物。另外，组织等价物10中，由于不需要直到内部为止细胞均匀地分布，与均匀分布的等价物相比，可以更迅速地制造。
这样的组织等价物10，与移植周边组织的融合性优异，被比较快地固定在移植周边组织上，可以减少脱落的可能性。
另外，在组织等价物10中，在包埋工序中，混合移植细胞和培养载体，虽然在载体部分12中也含有移植细胞，但若在细胞层14中存在细胞或细胞基质的话，则在载体部分12中不存在细胞也可以。这样的在载体部分12中不含有细胞的组织等价物可以通过预先在培养器中设置培养载体，然后在培养载体的表面上播种载体-细胞混合物并开始培养得到。
此时使用的载体，虽然可使用与上述相同的凝胶状或海绵状的载体，但是与移植细胞混合时具有流动性。通过使用这种流动性的载体，仅在预先设置在培养器中的载体的表面上配置或涂布就可以适度地被覆其表面。培养期间可以为移植细胞至少在载体的一部分密集化的时间，或从细胞到产生适当量的细胞基质为止的时间。由此，可以用比较简单的作业和短时间形成双层结构。因此，可以容易地制作对生物体融合性高的三维结构的组织等价物20。
另外，在组织等价物10中，虽然沿其外周具有细胞层14，但由于只有在移植时在与生物体的接触面上形成细胞层14，就可以在组织等价物的固定性等中发挥作用，因此也可以不沿全周存在，而在表面上的至少一部分上形成细胞层14。
图2表示其它组织等价物20。在该组织等价物20中，在外周的一部分具有未形成细胞层14的地方。该组织等价物20由于不需要沿外周全部形成细胞层14，因此可以比沿全周形成细胞层14用更短的时间制作。
这样的组织等价物20可以通过在培养器上开始培养后，不从培养器上剥下，终止培养工序容易地得到。
另外，图3表示成为其它变形例的组织等价物30。在该组织等价物30中，形成细胞层14的区域变得比载体部分12露出的部分小。这样的组织等价物30被移植时使在全周的一部分形成的细胞层14与生物体接触。由于与生物体接触的细胞层14对向生物体的固着有贡献，所以可以得到与上述相同的结果。
这样的组织等价物30可以通过沿厚度方向切断上述组织等价物20容易地得到。因此，由于可使组织等价物30的形状与移植部位的形状相符合，提高与生物体的密着性，所以可更迅速地实现对生物体的固定和组织再生，而且可以抑制脱落。
以下，虽然列举一实施例对本发明的内容进行具体的说明，但是本发明并不仅限于此。
放置的混合液在5％CO2、37℃的条件下静置0.5～1小时使其凝胶化，加入培养基，开始培养。培养基中使用调整为含有50μg/ml抗坏血酸(L-抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物C6H6O9P·3/2Mg·nH2O；日光ケミカルズ株式会社制)和100μg/ml透明质酸的10v/v％FBS(胎牛血清)-DMEM(杜尔贝科改良的伊格尔极限必需培养基)，在37℃、5％CO2的条件下培养3周。
在3周的包埋培养后，得到直径约10mm、厚度约3mm的组织等价物。为了确认该组织等价物的形态，用常规方法对作为软骨细胞产生基质的酸性粘多糖类阿尔斯蓝染色，对细胞核进行Kernechtrot染色后，用显微镜观察剖面时，确认形成细胞密度不同的细胞层和载体层的双层。
图5A和B是经过了3周包埋培养的软骨组织剖面的阿尔斯蓝染色图像。观察图5，产生的酸性粘多糖类密集在胶原凝胶表面，在凝胶内部只形成几个菌丛。此时细胞层的厚度大约为100～200μm。而且，从作为软骨的特征产生基质的II型胶原的染色像(图6A和B)也可以观察到同样的结果。
得到的组织等价物在表面上丰富地存在软骨组织细胞密集的细胞基质，与此相对，在内部不存在细胞数和细胞基质量，因此若在厚度方向施加负荷会产生适度的变形，可知有适宜的硬度。
在表1中，分别用×表示几乎看不到双层结构的情况，△表示可以看到一部分双层结构的情况，○表示可以看到双层结构的情况。
由该结果可知，在任何播种密度，在规定期间的培养后都可以提供组织等价物。另外，以2×105个/100μl载体播种的情况下从10天左右开始，以2×106个/100μl载体播种的情况下在10天以内开始，在组织等价物表面的一部分上形成双重结构，表示可迅速作为移植片使用。表1

实施例7、比较例1～2除了作为基础培养基使用10v/v％FBS-DMEM，只添加50μg/ml抗坏血酸(L-抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物)的培养基(实施例7)、只添加100μg/ml透明质酸的培养基(比较例1)、不添加添加物的基础培养基(比较例2)作为培养用培养基外，与实施例1相同地进行培养操作。
图8为在实施例1、图9为在实施例7、

图10为在比较例1、图11为在比较例2的条件下培养3周的软骨组织剖面的阿尔斯蓝染色图像。从这些剖面染色图像可以明确，在作为添加物加入抗坏血酸的实施例1和7(图8和9)中，在培养软骨组织的表面形成细胞层，成为双层结构。与此相反，在比较例1和2(图10和11)中不形成细胞层。
表2是以实施例1制作的培养软骨细胞为基准来表示实施例1和7、比较例1和2的培养软骨组织的双重结构的有无、基质产生和细胞数的表。表中“基准”表示实施例7，比较例1和2的基质产生和细胞数与实施例1的这些方面相比时作为基础。
表2

由这些实验结果可知，在实施例1的培养条件下，通过在基础培养基中添加抗坏血酸，可以在培养软骨组织表面上有效地形成细胞层。
培养操作虽然和实施例1相同地进行，但低温保存或冷冻保持在培养开始时配制的上述培养用培养基，在培养基交换时，仅分别将必要量从保存状态返回可使用状态来使用，培养3周。另外，实施例1中每次培养基交换要配制新的培养基，进行培养基交换。图12为在冷冻保存培养基中培养的软骨组织剖面(实施例8)的阿尔斯蓝染色图像，图13为在低温保存培养基中培养的软骨组织剖面(比较例3)的阿尔斯蓝染色图像。
表3是以实施例1制作的培养软骨细胞为基准来表示实施例8和比较例3的培养软骨组织的双重结构的有无、基质产生和细胞数的表。表中“基准”表示实施例8和比较例3的基质产生和细胞数与实施例1的该方面相比时作为基础。表3

由这些实验结果可以明确，虽然在冷冻保存培养基中形成了细胞层，但在低温保存培养基中细胞层的形成非常少。这可推测为由于抗坏血酸在液体中具有氧化分解或加水分解的特性，如果在液体的状态下低温保存，其活性缓慢地降低，不形成细胞层。与此相反，认为在冷冻保存中被保存在固体的状态下，由于可以抑制抗坏血酸的活性降低，形成了细胞层。
由于即使是这种含抗坏血酸的培养基，根据保存方法其活性(效果)变化，因此有可能形成没有细胞层的培养软骨组织。由此可知，在培养基中抗坏血酸的活性与细胞层的形成密切相关。
图14为测定实施例1和实施例7～8，以及比较例1～3的活细胞数的图。在形成了细胞层的实施例1、实施例7和实施例8中，可以明确活细胞数多，细胞增殖活性升高。
发明的实用性本发明的移植用组织等价物可以容易地提供在短时间内可移植、富具与移植周边组织的融合性的大型移植用组织等价物。由此，在可用的细胞数量少的情况，或必须由少数细胞数迅速形成大型三维结构的组织等价物时，特别地有用。该组织等价物10，富具与移植周边组织的融合性，比较快地被固定在移植周边组织中，可以减少脱落的可能性。
权利要求
1.一种在体外培养的，含有移植对象细胞并且培养后可向生物体内移植的三维结构的移植用组织等价物，其特征在于，具备主要以构筑三维结构的细胞培养载体构成的载体层、和在上述移植用组织等价物表面的至少一部分上、在上述载体层上局部连续存在、上述移植对象细胞或细胞基质比上述载体层更丰富的细胞层。
2.如权利要求1记载的移植用组织等价物，其特征在于，上述细胞层由密集的上述移植对象细胞构成，或者进一步含有由密集的移植对象细胞产生的细胞基质。
3.如权利要求1记载的移植用组织等价物，其特征在于，在上述细胞层中存在的移植对象细胞的密度相对于上述载体层内部的细胞密度实质的密。
4.如权利要求1记载的移植用组织等价物，其特征在于，上述细胞层的厚度为20～500μm。
5.如权利要求1记载的移植用组织等价物，其特征在于，上述细胞培养载体是生物体吸收性材料或生物体亲和性材料。
6.如权利要求1记载的移植用组织等价物，其特征在于，上述细胞培养载体是胶原、透明质酸和多聚轮烷(polyrotaxane)中的至少一种。
7.如权利要求1记载的移植用组织等价物，其特征在于，上述细胞是软骨细胞、成骨细胞或它们的前体细胞。
8.一种在体外培养的，含有移植对象细胞并且培养后可向生物体移植的三维结构的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于包括，在构筑上述三维结构的细胞培养载体上包埋移植对象细胞的包埋工序，和将可培养上述移植对象细胞的培养基供给包埋了上述移植对象细胞的细胞培养载体的供给工序，和在上述细胞培养载体的表面的上述移植对象细胞的增殖率比上述细胞载体内部高的条件下培养，并在该细胞培养载体的至少一部分表面上，上述移植对象细胞密度比上述细胞培养载体的内部更高、形成细胞密度不同的两层的培养工序。
9.如权利要求8记载的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于，上述培养基含有抗坏血酸。
10.如权利要求9记载的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于，含有上述抗坏血酸的培养基是被冷冻保存的培养基。
11.如权利要求8记载的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于，以1×104～1×108个/ml的播种密度在上述细胞培养载体中包埋上述移植对象细胞。
12.一种在体外培养的，含有移植对象细胞并且培养后可向生物体移植的三维结构的移植用组织等价物的制造方法，其特征在于包括，混合在培养基中可以维持立体结构的流动性载体和移植对象细胞的混合工序，和将通过上述混合工序得到的混合物播种在预先被载置的三维载体的至少一部分表面上的播种工序，和在上述流动性载体的至少一部分中，培养细胞达到实质上移植对象细胞成为密集状态的培养工序。
全文摘要
本发明的移植用组织等价物，是在体外培养的含有移植对象细胞并且培养后可向生物体内移植的三维结构的移植用组织等价物，其特征在于具备主要以构筑三维结构的细胞培养载体构成的载体层，和在上述移植用组织等价物表面的至少一部分上、在上述载体层上局部连续存在、上述移植对象细胞或细胞基质比上述载体层更丰富的细胞层。本移植用组织等价物适合成为比较大型的移植用组织等价物。本移植用组织等价物，可以实现移植后向组织周边部分的早期固定和抑制脱落。
文档编号A61L27/38GK1477979SQ01819903
公开日2004年2月25日 申请日期2001年12月4日 优先权日2000年12月6日
发明者越智光夫, 内尾祐司, 河崎贤三, 加藤雅一, 山本刚之, 福岛里佳, 久留岛丰一, 一, 三, 丰一, 之, 佳, 司 申请人:越智光夫, 株式会社日本组织工程, 科学技术振兴事业团