专利名称：制备一种受体特异的组织移植体或组织植入体的方法
技术领域：
本发明涉及一种由组织基质和在其上繁殖的受体耐受的细胞制备受体特异的组织移植体或组织植入体的方法。
在移植医学领域，对适宜的、尽可能少地引起受体产生不良反应的移植体的需求量很大。移植体从受体自己身体中取出用来移植，只在特别案例中是可能的。从免疫学的角度，这种移植手术是最不需要顾虑的了，而对于特定的脉管和器官以及较大面积待替换的皮肤却不存在这种可能性。对于特定的器官，如今实际上只是异体捐献者的同种异体移植体，或在矫形外科学领域更具多样性，考虑的是合成材料、金属、陶瓷等等以及不同的复合材料制备的植入体。在使用同种异体移植材料，例如捐献器官，永久地需要对受体生物体有负担的免疫抑制。尽管如此排斥反应仍经常地成为第一并发症。即使人造材料也可以导致排斥反应和炎症反应，致使手术结果失败。
出于不同的理由如今经常尝试使用异种材料(来源于动物)。其优点主要是所述材料相对于同种异体(捐献)材料较易于获得。而且这样的一种“生物材料”比人造材料运用灵活并更合适于受体身体的某些部位。所述异种移植材料却因为是强抗原而成为问题。
因此人们长期试图使异种同种异体或合成的移植材料，即不同种类可考虑用于移植的组织变成受体耐受的。对此经常尝试的是，在通过无细胞化对受体尽可能免疫中性化的异种或同种异体的组织或合成的基质材料(例如可生物降解的生物聚合物)上繁殖受体耐受的细胞，由此获取一种移植体或植入体，其尽可能不被受体当作异种或至少因为存在的自体的、自身的细胞而更易于耐受。
例如在DE19828726A1中描述了制备人造生物移植体的一种方法，先是从移植体的间质结缔组织中清除原有的细胞，在基质上重新繁殖受体耐受的，优选的是自体细胞，以便获得受体特异的生物移植体。
为了促使用于新繁殖的细胞接近自然地生长和持续不断永久性地细胞更新，适宜的作法是，将特定的细胞介质或还有因子加入培养物，这些细胞介质或因子刺激所述生长中的细胞进入特定的过程。如果培养的受体特异细胞包括成纤维细胞，则例如在合适的介质/因子的帮助下可以刺激胶原蛋白再生并以此促进组织基质重建成对于受体来说是自体的。许多因子有趋化性或加快生长的作用，对于专业人员来说，每个因子的作用已经是被彻底研究乃至清楚了的。通过加入所述因子，使所述的过程被启动、加速并通过因子种类和功能被控制。
现有技术已知的操作方式存在缺陷，使用的因子是很昂贵的。这就限制了所述方法的应用范围，因为通过在特定的移植体基体上繁殖受体耐受细胞来制备受体特异的移植体或植入体的方式已经是很昂贵的了，并且通过使用天然分离的或合成的介质还会使之变得更昂贵。
另一个问题在于介质/因子和辅助因子准确的投入剂量及对其理想投入时间和部位的控制。
本发明的任务因此在于，在由组织基质和其上繁殖的受体耐受细胞制备受体特异的组织移植体或组织植入体的方法中简化并更好地控制向组织培养物中加入介质、因子、辅助因子的过程，并使其更加经济。同时所述方法还应该使获取的受体特异的移植体或植入体的自然形成成为可能。
根据本发明，所述问题的解决方案是这样拟定的，在一种由组织基质和其上繁殖的受体耐受细胞制备受体特异的组织移植体或组织植入体的方法中，受体耐受细胞在组织基质上的繁殖是在附加细胞的参与下进行，所述附加细胞产生并向周围释放促进组织再生的介质、因子或辅助因子。
对于释放介质或因子的附加细胞的“参与”在这里的理解是，将所述附加细胞在所述繁殖方法中，作为对用于繁殖的受体耐受细胞的补充，或者直接加入组织培养物中并通过和受体特异细胞的相互作用刺激释放介质或因子(以便于附加细胞对繁殖过程直接干涉，也就是参与)，或者与组织移植体或植入体的培养并行地在同一培养装置中(生物反应器)，或者在一个分开的仪器中同时培养所述附加细胞(协同培养)，而根据本发明应用的细胞在并行培养物中分泌的产物(介质、因子、辅助因子)被直接加入所述组织培养物。属于介质的也包括引起炎症的介质。
在介质或因子释放细胞的并列培养中，可以使用分别相应于其细胞类型的常用适当的培养基。
对于“介质或因子释放细胞”在本发明范围内的理解是，其相对易于被激活(即被刺激)，以释放促进组织再生的介质、因子或辅助因子。这里算得上的有巨噬细胞、某些免疫活性的细胞及其它。激活过程可以优选通过一种来自繁殖细胞的刺激(如细胞碎屑)来进行，作为替代方案也通过加入化学物质或小的异物颗粒。
对于组织再生的理解是指修复过程以及组织的分解和重建过程。介质释放细胞刺激周围的细胞分别进行表型重建，促进神经合成过程和组织更新。
作为介质或因子释放细胞可以使用移植体受体的自体细胞。特别考虑的是白细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒性白细胞，树突细胞，干细胞，特别是多能性干细胞以及体干细胞或所述细胞的混合。使用巨噬细胞目前被看作是特别有利的。
特别是在介质或因子释放细胞的协同培养中，但也在直接加入移植体组织培养物的情况下，可以通过加入适当的物质刺激所述细胞产生特定的介质、因子或辅助因子或增加细胞产物的产生。可采用来刺激所述细胞的其中有来自组织培养中的细胞碎屑。
所述方法优选这样进行，使所述介质或因子释放细胞在繁殖期间至少短时地直接加入到用于繁殖的培养基和/或组织基质中。
在组织基座上繁殖受体耐受细胞制备组织移植体或植入体，可以遵循一种已知的方式，就此例如DE 198 28 726中给出了详细描述。在这里组织基座或组织基质，例如是一种天然或合成的，无细胞化的或自体胶原基质或合成组织，如一种生物聚合物纤维或网状构造通常存在于一种培养基中，可以往其中加入不同的添加物(也称为调节的培养基，意思是为繁殖而对组织的调节)。可以例如使所述培养基流过组织或在一个循环中循环经过组织。所述培养基也可以间隔地加入然后在培养物上静止保留一段时间；理想的条件是根据待繁殖的组织的种类而定。
常用的营养基可以作为培养基或调节的培养基使用，任选地可配有不同的添加剂。对此合适的营养基是专业人员所熟悉的。
在所述培养基中加入受体特异细胞，或是从繁殖的一开始连续地，或是分批多次地加入。对受体特异细胞的理解是指，受体自体的、对受体尽可能免疫耐受而挑选的(相容的)同种异体的或基因修饰过的同种异体的或异种的细胞。如果通过测试被归类为类似受体的或特别通过基因修饰而适应于受体的细胞可以看作是免疫相容的细胞。
也可以在繁殖及处理的不同时段加入不同种类的细胞，以便在组织上构成由不同的细胞种类组成的不同的细胞层。此外可以局部性地加入不同的细胞。例如在一皮肤移植体的上端和下端有不同的细胞或一管状脉管的内侧和外侧有不同的细胞。基本上所有种类的体细胞都可以作为受体耐受细胞考虑，例如结缔组织细胞(其中有成纤维细胞，结缔组织细胞)，肌肉细胞(肌细胞)，内皮细胞，皮肤细胞(其中有生角质细胞)，分化成器官细胞的细胞(心脏细胞、肾脏细胞等)，优选带有胶原构架的结构化的器官，通常所有的细胞，其可被提供有效用于特定的作为植入体的组织的重建。
对于组织移植体，基本上涉及到每一个可移植的组织。特别在这里算得上的是通常的脉管，如动脉和静脉，动脉瓣、心瓣膜，部分器官和完整器官，皮肤块、肌腱、角膜、软骨、骨、喉、心脏、气管、神经、Miniskus、椎间盘、输尿管、尿道、膀胱以及其它等等。
以合成的基质或框架为基础的植入体提供的许多可能性中有静脉、心瓣膜、角膜、膀胱和皮肤。
介质或因子释放细胞可以，如上所述，在繁殖期间至少短时地加入到组织培养基和/或组织基质中。为此可能的是，介质或因子释放细胞在繁殖开始时一次性或和受体耐受细胞一同直接加在组织基质上。介质或因子释放细胞也可以随着培养基分批或连续地加入，其中培养基的交替也可在有或没有介质或因子释放细胞的情况下进行。
在本发明的扩展形式中还考虑到了，为了加入介质或因子释放细胞而使用血液，它本身含有所期望的介质或因子释放细胞，优选移植体或植入体受体的自身血液。所述血液可就所期望的组分而言浓缩或可以分离血液组分并加以运用。
进一步优选的可以是将可激活的介质或因子释放细胞保持在一培养基中，该培养基与组织在繁殖过程中是有联系的，以使从细胞培养物中释放的介质/因子在繁殖期间导入组织。如上所述，这种介质或因子释放细胞的协同培养作为并列培养可以设置在所述组织培养装置的外部或内部。
介质或因子释放细胞的培养，例如巨噬细胞培养，可以在一个生物反应器中进行，其与培养和处理受体特异的移植体或植入体的反应器通过适当的方式相连。从生物反应器中取得的因子可按适合的量加入到循环地或分批式加料的调节的培养基中。
作为选择，所述巨噬细胞培养物或其它介质或因子释放细胞或混和的介质或因子释放细胞培养物，在用受体耐受细胞的处理步骤中，通过一种对于细胞介质和/或因子可透过的薄膜、膜或隔离壁与调节的培养基保持分隔，以便可以将生成的介质和/或因子连续地释放到所述调节的培养基中。
考虑用于移植的组织的处理通常是在一个生物反应器中进行的，其中培养基在一特定空间内保存并任选地循环。在所述空间内可以用一个可透过的隔离壁为依据本发明运用的细胞或巨噬细胞的培养构造出一个培养空间，以便生成的细胞介质和/或因子可以永久性地穿出来进入条件培养基。
作为介质或因子释放细胞可以应用的特别是来自白细胞家族的细胞，然而也可以是外周或中央干细胞(来自于血，脂肪组织，器官和骨髓)，优选多能性干细胞，例如所有形式的白细胞、粒性白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、单细胞、骨髓细胞、脾细胞、记忆细胞、胸腺细胞。
为了借助于受体耐受细胞的繁殖，挑选适合于相应组织类别的各种细胞或混和细胞。所述受体耐受的，优选自体的或通过基因修饰而成为受体特异的同种异体或异种的细胞包括，适于构造所期望的组织的细胞，选择性地还有那些可以刺激和/或控制组织重建的细胞，如产生细胞因子的细胞和/或趋化影响性细胞，其中有如上所述的介质或因子释放细胞。
本发明，即产生并释放介质、因子、辅助因子至调节的培养基的细胞参与用受体耐受细胞繁殖的移植体或植入体的培养，其优点在于为相应目的而特别合适的介质/因子可以在反正需要的培养步骤期伴随产生。以致可以放弃使用格外昂贵的和特异性较低的因子。
通过规定某些可激活的介质或因子释放细胞和任选地给予这些细胞适当的刺激，可以影响介质/因子的释放并以此控制和加速组织生长。
作为组织基质可以，分别根据应用情形，例如使用一个合成的组织基质，它包括例如一种或多种以下材料Polyglactid，聚二噁酮(Polydioxanon)、可生物降解的聚酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯(Polyacryle)、胶原蛋白、血纤维蛋白原。作为替代方案可以应用的，如上已描述的，还有自身或无细胞化的异种或同种异体组织基质。
如下，本发明将依据实施例加以描述用于新的人造生物组织的以工业和生物聚合物作为载体物质(组织基质)的加速重建使用可生物降解的聚合物作为合成基质材料。所述合成材料可以是提纯了的生物来源性材料。将所述材料成型为“合成”基质(相对于无细胞化的生物组织)。
所述聚合物的降解可以通过水解或也可以通过酶催化完成。
可使用的是可以生物降解的聚合物如Polyglactid，聚二噁酮、聚酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯、特别的生物聚合物和(生物)大分子，如典型的细胞外基质的组分，胶原蛋白或血纤维蛋白原。
与常规方法相符，在一个合成的组织基座(例如合成的心脏瓣膜)上繁殖挑选出来的受体特异细胞。培养在一种通常用于此目的培养基(例如DMBM；WE)中进行。在繁殖期间，以一定时间间隔地用植入体受体的自身血液、浓缩的自身血液或加入了血液成分的培养基清洗所述组织植入体。在此阶段巨噬细胞选择性粘附在曝露的基质上。通过聚合物的分解产物使淋巴细胞和巨噬细胞获得免疫刺激性刺激并被激活，自体的成肌纤维细胞经内源性激活剂刺激合成基质。这是特别重要的，因为随后加速例如水解方式的聚合物分解，以至比现有技术所可能的时间缩短了很多。这再次使得在没有残余聚合物的存在下活体植入一个已制成的产品成为可能，所述残余聚合物在突然加速分解时可能引发活体不期望的不稳定状况或还引起异物反应。
作为对于在血液中培养的替代方案，可以将血小板制剂(在约3000g和白血球1800g时获得)分开地在生物反应器的不同的部位或同步地在一个分开的设备中协同培养。在后一情况下，使如此获取的组织培养的培养产物导入到真正的组织生物反应器中。
诱导心脏瓣膜重建至正常的细胞生理特征受体血管细胞的预扩张阶段运用传统的方式需要大约10天。心脏瓣膜随后置入一生物反应器并使用预扩张了的成纤维细胞、平滑肌细胞(SMC)和内皮细胞(Endothelialen)如通常地在管式繁殖。并行地使新鲜获取的骨髓干细胞作为总细胞库通过注射而加至基质上和之内。在那里在细胞外基质空间位点的局部微环境压力下发生了干细胞的分化控制。另外通过基质和局部细胞分解产物刺激干细胞的活化状态。通过受体血管内皮细胞和平滑肌细胞的运用发生了和干细胞之间的相互影响。此外因此就地产生了所述组织特异细胞。这意味着，基于活体抽取技术(Biopsieentnahmen)例如在制备主动脉心瓣膜时必需使用不能直接从目标组织上获取的组织。这包括例如静脉组织，其具有不同于动脉瓣的动脉细胞的分子和表型分化。另外还缺少不同的细胞类型，它们例如只在瓣尖出现的，如神经元细胞系统。在局部微环境压力和瓣膜中存在基质参数(理想的是例如一同种异体的动脉瓣基质)下所述干细胞分化为部位特异的细胞类型包括负责局部神经支配过程的神经元细胞系统。在活体植入后，干细胞还可以使使用动脉细胞的分化繁殖(Repopulation)成为可能。然而EC还是重要的，因为在血管系统中减少了血栓形成。通过FB和SMC，本身来源于静脉，至少在受体特异的基质中启动了重建过程，它通过由干细胞募集的细胞库推进，矫正和直至完成。
权利要求
1.由组织基质和在其上繁殖的受体耐受的细胞制备受体特异的组织移植体或组织植入体的方法，其特征在于，在组织基质上所述受体耐受的细胞的繁殖是在附加细胞的参与下进行的，所述附加细胞产生促进组织再生的介质、因子或辅助因子并向周围释放。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞释放引起炎症的介质或因子。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述介质或因子释放细胞包括移植体受体的自体细胞，特别是白细胞、树突细胞、巨噬细胞或这些细胞的混合。
4.根据权利要求1至3之一项的方法，其特征在于，所述介质或因子释放细胞包括前体细胞和干细胞。
5.根据权利要求1至4之一项的方法，其特征在于，所述介质或因子释放细胞在繁殖期间至少短时地加入到用于繁殖的培养基和/或组织基质中。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述加入过程是通过添加移植体或植入体受体的自身血液或自身血液的组分完成的。
7.根据权利要求5至6的方法，其特征在于，所述介质或因子释放细胞保持在一培养物中，该培养物与组织在繁殖期间以某种形式相连，以便将从细胞的培养物释放的介质/因子在繁殖期间加入到组织中。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述释放介质或因子细胞的培养物，优选为巨噬细胞培养物，在用受体耐受细胞的繁殖和处理期间通过一种对于细胞介质和/或因子可透过的薄膜、膜或隔离壁保持与培养基分隔，并且所生成的介质和/或因子连续地释放至所述组织-移植体-培养基中。
9.根据权利要求1至8之一项的方法，其特征在于，使用一种合成的组织基质作为组织基质。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述使用的组织基质包括一种或多种以下材料Polyglactid，聚二噁酮、可生物降解的聚酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯、胶原蛋白、血纤维蛋白原。
11.根据权利要求1至8之一项的方法，其特征在于，使用一种自身的或无细胞化的异种的或同种异体的组织基质作为组织基质。
12.根据权利要求1至11之一项的方法，其特征在于，所述使用的受体耐受细胞是移植体或植入体受体的自体细胞。
13.根据权利要求1至11之一项的方法，其特征在于，所述使用的受体耐受细胞是针对受体作为耐受细胞而挑选的同种异体细胞或基因修饰过的同种异体细胞。
全文摘要
本发明的方法是一种进一步发展的细胞繁殖方法，根据该方法生物细胞在一种合成的或天然的组织基质上繁殖以获得组织植入体或组织移植体。频繁通过添加介质、因子或辅助因子促进一般来源于移植体或植入体受体的细胞的繁殖。根据本发明的方法，因子或介质是这样添加的，即特别适于产生所述因子的细胞，与组织协同培养。
文档编号C12N5/10GK1439050SQ01810294
公开日2003年8月27日 申请日期2001年5月28日 优先权日2000年5月29日
发明者奥古斯蒂努斯·巴德 申请人:奥古斯蒂努斯·巴德