谷氨酸受体多肽基因应用的载体和方法
【专利摘要】本发明揭示了分离的多聚核苷酸和多肽，用于提高植物耐旱性和氮利用效率的重组DNA载体，含有这些重组DNA载体的植物或种子，以及利用这些重组DNA载体的方法。重组DNA载体含有植物中有功能的启动子和与之连接的多聚核苷酸，其中，所述的多聚核苷酸编码谷氨酸受体多肽。
【专利说明】谷氨酸受体多肽基因应用的载体和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物育种和遗传学，特别是，涉及用于提高植物非生物胁迫抗性(如干旱)和提高氮素利用效率的重组DNA载体。
[0002]发明背景
[0003]非生物胁迫是世界范围内引起作物减产的主要原因，每年会造成主要作物减产 50 % 以上(Boyer，J.S.(1982) Science 218:443-448 ；Bray, E.A.等(2000) InBiochemistry and Molecular Biology of Plants, edited by Buchannan, B.B.Amer.Soc.Plant Biol.，pp.1158-1249)。干旱是所有非生物胁迫中影响作物产量最主要的因素，在植物生长发育阶段，干旱会激活植物各种不同生理和发育变化。近年来，尽管对非生物胁迫响应的分子机制和植物耐旱性的遗传调控网络进行了广泛的研究(Valliyodan，
B.Nguyen, H.T.(2006) Curr.0pin.Plant Biol.9:189-195 ；ffang, ff.等(2003) Planta218:1-14 ；Vinocur, B.和 Altman, A.(2005) Curr.0pin.Biotechnol.16: 123-132 ；Chaves,M.M.和 Oliveira, Μ.M.(2004) J.Exp.Bot.55:2365-2384 ；Shinozaki, K.等(2003) Curr.0pin.Plant Biol.6:410-417 ;Yamaguchi_Shinozaki, K.和 Shinozaki, K.(2005)TrendsPlant Sc1.10:88-94)，但是植物如何感受、传导干旱胁迫信号和其耐旱性的生物化学和分子机制仍然是生物学研究中面临的一个主要挑战。
[0004]早期非生物胁迫响应分子方面的研究主要借助差异和/或加减法分析(Bray，E.A.(1993)Plant Physiol.103:1035-1040 ;Shinozaki, K.和 Yamaguch1-Shinozaki，K.(1997)Plant Physiol .115:327-334 ；Zhu, J.-K.等(1997)Crit.Rev.Plant Sc1.16:253-277 ；Thomashow, M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mo1.Biol.50:571-599);和其它的方法，如分离候选基因，分析胁迫条件下该基因的表达或活性产物，或进行特定胁迫条件下功能互补分析(Xiong, L.和Zhu, J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum 112:152-166)。另外，用于鉴定和分离调控基因突变体的正向和反向遗传学研究为胁迫条件下基因表达的变化提供了证据(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum 112: 152-166)。
[0005]氮素的吸收在植物生长发育的过程中发挥着重要的作用(Gallais等(2004)，J.Exp.Bot.55(396):295-306),植物吸收环境中的无机氮合成氨基酸,土壤可利用氮肥可以提高植物的产量，因此施用氮肥成为农民提高栽培作物(如玉米)产量强有力的方法。在植物最佳生长发育阶段，可利用氮素的缺失就成为了非生物胁迫。现在，为了避免硝酸盐对环境的污染，同时保持足够的利润，农民希望减少氮肥的使用，同时植物的产量并不减少。因此培育氮利用效率高的植物新品种成为增加作物产量的一条重要途径。
[0006]激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于模式植物拟南芥的研究中(Weigel,D.等(2000)Plant Physiol.122:1003-1013)。转录增强子序列的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于分离具有重要农艺性状表型的基因，包括提高非生物胁迫如干旱和低氮耐性的基因。
[0007]动物细胞中，谷氨酸受体(glutamate receptor, GLR)可以与谷氨酸结合,通过配体门控离子通道或G-蛋白偶联的受体在主要兴奋神经传递素传递中发挥作用，植物中已经鉴定有与 GLR-类似的基因(Davenport R.(2002) Annals of Botany 90:549-557)。GLRs在营养的吸收、运输和信号转导中发挥作用(Davenport R.(2002)Annals of Botany 90:549-557)，因此可以通过基因工程手段将GLRs基因转入植物中提高植物的抗逆性，特别是在非生物胁迫如干旱，低温和低氮条件下的耐性。
发明摘要
[0008]本发明包括以下具体实施例:
[0009]1.基因组中含有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体的植物，其中，所述多聚核苷酸编码谷氨酸受体多肽，通过本发明中所述的GAP参数测定，可知上述谷氨酸受体多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少为85% ;所述植物与对照植物相比具有较高的耐旱性或较高的氮素利用效率。
[0010]2.基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体的植物，其中，所述多聚核苷酸编码一个多肽，通过本发明中所述的GAP参数测定，可知其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少为85% ;与对照植物相比，所述植物显示至少一个农艺性状的变化；可选的，在水分限制条件下，与对照植物相比，植物显示所述至少一个农艺性状的变化；所述农艺性状可以是籽粒产量或者生物量；所述的变化可以是增加。
[0011]3.上述I和2中所述的植物，可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0012]4.上述植物的种子，所述种子的基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，其中，所述的多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少为85%;所述种子长出的植物与对照植物相比，具有较高的耐旱性，或 至少一个农艺性状的变化，或两者；所述至少一个农艺性状可以是氮素利用效率、籽粒产量、生物量或其组合；所述的变化可以是增加。
[0013]5.提高植物耐旱性的方法包括(a)使用与至少一个调控序列连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体转化植物再生细胞，其中，所述多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9氨基酸序列的一致性至少为85% ； (b)由步骤(a)的植物再生细胞再生基因组中含有构建的重组DNA载体的转基因植物；(c)获得由步骤(b)获得的再生植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有构建的重组DNA载体，且与野生型植物相比，所述子代植物具有较高的耐旱性。
[0014]6.评价植物耐旱性的方法包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，所述多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少为85% ；(b)获得转基因植株的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有构建的重组DNA载体；(c)与对照植物相比，评价子代植物的耐旱性。
[0015]7.确定植物中至少一个农艺性状变化的方法:(a)获得转基因植物，其基因组中含有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，其中所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少为85% ；(b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物基因组中含有构建的重组DNA载体:(c)与对照植物对比，确定子代植物是否具有所述的至少一个农艺性状的变化；可选的，步骤(C)包括在水分限制条件下确定转基因植物是否具有至少一个农艺性状的变化；所述的至少一个农艺性状可以是氮素利用效率、籽粒产量、生物量或者其组合；所述的变化可以是增加 。
[0016]8.上述5-7所述的任一方法，其中，植物可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜猜、棉花、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0017]9.本发明中分离的多聚核苷酸包括(a)编码多肽氨基酸序列与序列表中SEQ IDNO:5或9氨基酸序列的一致性至少为90%的核苷酸序列，(b)序列表中SEQ ID NO:4或8所示的核苷酸序列，(c)与(a)或(b)核苷酸序列完全互补的序列，其中，(c)序列与(a)或(b)序列的核苷酸数目相同且100%互补；所述多肽包括序列表中SEQ ID NO:5或9所示的氨基酸序列；所述核苷酸序列包括序列表中SEQ ID NO:4或8所示的核苷酸序列。
[0018]在具体实施例中，本发明主要揭示了与至少一个调控序列连接的本发明中分离的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，和含有该重组DNA载体的细胞、植物或种子；所述细胞可以是酵母、昆虫或植物细胞等真核细胞，也可以是细菌细胞等原核细胞。
[0019]附图和序列表的简要i兑明
[0020]下面的详细说明、附图和序列表有助于全面了解本发明。
[0021]图1.水稻激活标签突变体库构建中使用的A-载体图。四拷贝的CaMV 35S增强子(4 X CaMV 35S增强子)邻近右边界(RB)，LTP2: =DsRed邻近左边界(LB) ,UB1:: Hygr #为筛选标记重组DNA片段，15kb的间隔区位于4 X CaMV 35S增强子与Hyglr之间。Amplr表示氨苄青霉素抗性基因，Hyf表示潮霉素抗性基因，UBI为玉米泛素启动子，LTP2为大麦脂转移蛋白2启动子，DsRed为礁珊瑚红色荧光蛋白。
[0022]图2.AHO1486水稻株系中T-DNA侧翼序列和候选基因在9号染色体上的位置图谱。T-DNA插入水稻基因组的9号染色体的15760218和15760298之间，T-DNA右边界末端缺失22bp，左边界的UBI启动子缺失65bp。
[0023]图3.AHO1486株系转基因水稻不同组织中GLRl和GLR2激活表达水平的real-time PCR分析。Zhonghuall-WT代表野生型中花11, Zhonghuall-TC代表组织培养获得中花11 ；R代表根，S代表茎，L代表叶。把对照水稻叶片中GLRl或GLR2基因的表达水平设为I, AHO1486株系根中GLRl基因的表达水平为17.74，茎中为3.95，叶中为58.83 (左图)；AH01486株系根中GLR2基因的表达水平为1.00，茎中为1.45，叶中为38.45。
[0024]图4.不同转基因水稻株系叶片中GLR2表达水平的real-time PCR分析。对照水稻DP0005叶片中GLR2基因的表达水平设为1.00，各转基因株系叶片中GLR2基因的表达水平如图数字所示。
[0025]图5.低氮处理期间GLR2转基因水稻(DP0015)和对照水稻(DP0005)分蘖情况的照片。
[0026]图6.过表达水稻GLR2基因提高了拟南芥(DP0015-5和DP0015-6)的耐旱性。A.DP0015-5和DP0015-6中GLR2基因的表达水平，B.复水第三天时拟南芥的存活率，C.复水第三天时拟南芥的生长状况。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009转化株。
[0027]图7.过表达水稻GLRl基因提高了拟南芥(DP0025-13和DP0025-16)的耐旱性。A.DP0025-13和DP0025-16中GLRl基因的表达水平，B.复水第三天时拟南芥的存活率，C.复水第三天时拟南芥的生长状况。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009转化株。
[0028]图8.水稻GLRl和GLR2氨基酸序列的比对。保守区是GLRl第三个外显子编码的G483-H842之间的359个氨基酸序列。
[0029]表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列编号
[0030]表2.T2代AHO1486水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0031 ] 表3.TO代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0032]表4.Tl代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0033]表5.T2代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0034]表6.Tl代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在温室条件下的耐低氮性能分析(分蘖数)
[0035]表7.Tl代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在温室条件下的耐低氮性能分析(SPAD值)
[0036]表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列编号
[0037]
【权利要求】
1.基因组中含有重组DNA载体的植物，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸；根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为85% ;与对照植物相比，所述植物显示增强的耐旱性和/或较好的氮素利用效率。
2.基因组中含有重组DNA载体的植物，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸；根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为90% ;与对照植物相比，所述植物显示增加的籽粒产量、生物量或两者。
3.根据权利要求1或2，与所述对照植物相比，在水分限制或氮素限制条件下，所述植物显示所述增加的籽粒产量、生物量或两者。
4.根据权利要求1、2或3，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
5.权利要求1、2、3或4植物收获的种子，其中，所述种子的基因组中含有重组DNA载体，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连多聚核苷酸；根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为90% ;与对照植物相比，由所述种子长出的植物显示至少一个增加的性状，如耐旱性、籽粒产量和生物量。
6.提高植物耐旱性的方法,其包括(a)将重组DNA载体转入植物再生细胞，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为90%;(b)由步骤(a)的植物再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体，与对照植物相比，所述子代植物显示增强的耐旱性。
7.评价植物耐旱性的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中含有重组DNA载体，所述的重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为90% ;(b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)以不含有所述重组DNA载体的植物为对照，评价子代植物的耐旱性。
8.确定植物籽粒产量、生物量或两者变化的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中含有重组DNA载体，所述重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为90% ； (b)获得转基因植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)测定子代植物的籽粒产量和/或生物量，并将所述测定与对照植物的籽粒产量和/或生物量进行比较。
9.根据权利要求8的方法，转基因子代植物和对照植物的籽粒产量和/或生物量是在水分限制条件下测定的。
10.根据权利要求8或9的方法，与对照植物相比，转基因子代植物的所述籽粒产量和/或生物量增加了。
11.根据权利要求6-10的任一方法，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜猜、棉花、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
12.分离的多聚核苷酸包括(a)编码影响植物耐旱性或氮素利用效率的多肽，根据GAP比对方法，所述多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少为90% ;和(b)核苷酸序列(a)的全长互补序列。
13.根据权利要求12，所述多肽的氨基酸序列包括序列表中SEQID NO:5或9。
14.根据权利要求12，所述核苷酸序列包括序列表中SEQID NO:4或8。
15.含有重组DNA载体的植物或种子，其中，重组DNA载体包括权利要求12-14中任意多聚核苷酸，和与之相连的调控序列。
16.含有增加内源多聚核苷酸表达的重组转录激活元件的水稻，其中，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性为90%。
17.权利要求16的水稻植物，载体包括序列表中SEQID NO:1所示的序列。
18.权利要求16或17的水稻，转录激活元件插入水稻基因组9号染色体的15760218和15760298之间。
19.权利要求16的水稻，内源多聚核苷酸编码SEQID NO:9或5所示的多肽。
20.改善植物耐旱性或氮素利用效率的方法，其包括(I)将权利要求16-19任意水稻植株与另一个水稻植株进行杂交，产生的子代种子；(b)收获和种植子代种子以获得至少一个子代植株，所述后代水稻的9号染色体的15760218和15760298之间存在转录激活元件的插入；(c)将子代水稻与另`一个水稻品种杂交，产生至少一个回交子代种子；可选的，(d)多次重复步骤(b)和(C)，产生比所选水稻品种具有更高耐旱性和氮素利用效率的植物。
【文档编号】A01H5/00GK103503777SQ201210236405
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2012年6月21日
【发明者】高阳, 刘敬梅, 刘军华, D·F·罗萨尔特, 吕贵华, S·斯瓦桑卡, 王昌贵, 王伟, 王喜萍, 夏勉, 于昆 申请人:先锋国际良种公司, 北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司