一种提高植物抵抗盐胁迫能力的方法
【专利摘要】本发明提供一种提高植物抵抗盐胁迫能力的方法，将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，提高植物的抗盐胁迫能力。URO基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；启动子的核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于构建含有URO基因及启动子序列的表达载体是含有T-DNA序列的双元载体。本发明通过改变转录调控因子基因的表达，使植物细胞分化状态改变，从而实现提高植物抗盐能力提高的目的。
【专利说明】一种提高植物抵抗盐胁迫能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业作物性能改进的【技术领域】，具体涉及ー种提高植物抵抗盐胁迫能力的方法，以提高植物耐盐胁迫能力。
【背景技术】
[0002]随着全球温度升高，地球表面水分蒸发加快，海平面上升，以及长时间以来灌溉的农业生产，导致土壤中盐份积累逐年加剧，成为导致作物减产的原因之一。另ー方面，有限的耕地面积面临急剧增加的人口的压カ也逐年上升，大量荒置的盐碱地的有效利用也是农业发展的重要方向。因此，改善经济作物的耐盐胁迫能力，是经济作物育种的重要方向之一。例如:将造纸植物的耐盐性提高，使其可以在盐分较高的地区种植，将极大的节约耕地的面积，缓解农业土地紧缺的压カ。
[0003]常规育种方法耗时时间长，需要几代的杂交、回交，且新性状的出现依赖已有的品种，可控性较差。转基因育种是国际新兴的育种策略。它的优点是耗时较短，可控性较強。缺点依赖于育种对象的转基因平台的建立，以及可以用于遗传改造的基因序列。目前，可用于提闻植物耐盐胁迫能力的基因序列报道很少。
[0004]现有技术中，调控植物对盐胁迫的耐受性主要有编码离子通道的蛋白，以及部分影响植物激素包括细胞分裂素和赤霉素合成的基因。通常认为生长素与植物抗盐胁迫性能没有直接关联，也有报道认为生长素降低植物抗盐胁迫的性能。本发明利用拟南芥的生长素代谢调控基因UR0，通过过量表达该基因，改变植物内源生长素含量，影响植物的整体发育，提高植物对环境中盐胁迫的耐受性。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种提高植物抵抗盐胁迫能力的方法，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，提高植物抵抗盐胁迫能力；其中，所述URO基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示；用于构建所述含有URO基因及启动子序列基因的表达载体含有T-DNA序列的双元载体。至目前尚未有文献报道所述URO基因可被用于提高植物耐盐胁迫能力的人工调控。本发明中，URO基因还可用其它组织特异性启动子启动表达，达到对该基因的表达时空可以进行精确调控的目的，从而更加有效的调控转基因植物光合作用变化。
[0006]其中，所述含有URO基因及部分启动子序列的表达载体为pMon530-UR0 ；所述pMon530-UR0的构建包括如下步骤:以拟南芥的总DNA为模板，并设计引物:上游引物URO-F:5’ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下爾引物URO-R:5’tta atg atg acg atgacc g。经PCR循环反应得到扩增产物，得到URO的核酸片段，连接到T-Vector ;将连接产物转化至大肠杆菌，经筛选得到阳性克隆URO-T。URO-T质粒经XhoI和EcoRI酶切后，与经XhoI和EcoR I酶切后的含有35S启动子的双元载体pMon530进行连接，获得含有融合35S启动子和URO的重组载体pMon530-UR0。[0007]其中，所述PCR循环反应的条件为:94°C 5min ;一次循环94°C 30sec，55°C 45sec，72°C 90sec，30 次循环；72°C IOmin0
[0008]其中，所述植物为草本或木本植物。所述植物为草本植物烟草。
[0009]其中，所述转化方法为农杆菌转化法，基因枪介导转化法，或花粉管通道法。
[0010]本发明中，所述URO基因是指拟南芥基因At3g23140的核酸序列从翻译起始密码ATG到终止密码TAA，包括终止密码。所述启动子是指花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子的碱基序列。
[0011]其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列I所示，该序列I由525个碱基组成。所述启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示，该序列由546个碱基组成。
[0012]本发明中，所述T-DNA序列是公开序列，是指农杆菌Ti (tumor inducing)或Ri (root inducing)质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中，已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。
[0013]本发明中，所述P35S::UR0融合基因是指35S启动子与URO基因相接形成的新的基因序列。
[0014]本发明中，所述pMon530-UR0表达载体是指带有P35S::URO融合基因的可以转化植物的双元载体。
[0015]本发明中，T-Vector是指就是市场上试剂公司提供的线性3’ -T突出双链DNA片段。T载体利于PCR产物的连接。
[0016]本发明中，URO-T是指含有URO序列的T-Vector。所述URO-T质粒是指含有URO序列的T-Vector质粒。
[0017]本发明中，所述含有35S启动子的双元载体pMon530是指ー个商业化的质粒载体名称为pMon530，该质粒的多克隆位点前面含有ー个花椰菜花叶病毒的35S启动子。
[0018]本发明中，所述tbu是指转化有pMon530-UR0的转基因烟草株系，不同株系加不同编号，如 tbu-1, tbu-2 等。
[0019]本发明中，所述启动子可以是任何植物中使用的启动子，包括遍在表达的启动子和组织特异性表达的启动子。
[0020]本发明是将含有URO基因及启动子的表达载体转化植物，为提高植物耐盐胁迫能力提供一条新的途径。
[0021]本发明方法，可以用于植物盐胁迫能力提高的性状。本发明的方法中，提取拟南芥的部分基因片段，通过特定启动子与基因的组合，可以驱动调控植物生长素代谢调控基因在表达升高，使植物细胞生长发育状态改变，提高植物抵抗盐胁迫能力。本发明的方法既可以单独转化植物，也可以对启动子区进行修饰，改变该基因的表达位置和时间，以获得具有组织特异性的最适抗盐效果。利用本发明的方法，可以通过对不同的经济作物进行遗传改造，达到在较短时间内提高植物抗盐能力的良好效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为pMon530_UR0融合基因载体构建过程示意图。
[0023]图2 (a)表示野生型烟草植株。[0024]图2 (b)表示转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株。
[0025]图3为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草的RT-PCR鉴定图谱。
[0026]图4为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株与野生型烟草的叶片细胞形态比较。
[0027]图5为转P35S:: URO融合基因的转基因烟草植株与野生型烟草的叶片在含盐培养基上培养结果比较。
[0028]图6为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株与野生型烟草的叶片耐盐胁迫能力比较。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例是对本发明进一步的详细阐述，而不是对本发明的限制。本发明并不局限于【具体实施方式】的内容，凡基于本发明在权利要求的范围内做出各种变形或修改，均属于本发明的保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0030]本发明调控植物抵抗盐胁迫的方法，具体如下:
[0031]培育抵抗盐胁迫能力升高的转基因烟草，以拟 南芥总DNA为模板；设计引物，上游引物 UR0-F:5，ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下游引物 UR0-R:5，tta atg atgacg atg acc g ;进行PCR扩增，PCR反应条件为:94度5min，一个循环；94度30sec，55度45sec, 72度90sec, 30循环；72度IOmin进行PCR扩增，然后，电泳、回收、纯化PCR扩增产物，得到URO基因的核酸片段。
[0032]将URO基因核酸片段连接到T-Vector (TAKARA)，并转化至大肠杆菌，经PCR及酶切筛选获得阳性克隆(UR0-T)。经测序，检测结果确定阳性克隆序列正确。
[0033]分别利用XhoI和EcoRI酶进行酶切测序正确的URO-T质粒，电泳、回收、纯化，与被XhoI和EcoRI酶切后的已含有35S启动子的双元载体pMon530连接。获得含有融合35S启动子和URO基因的重组载体p35S::UR0，测序鉴定正确。之后，将该质粒转化入农杆菌中，并进行鉴定。35S::UR0融合基因载体pMon530-UR0构建过程，參考图1所示，具体记载在实施例 2、3、4、5、6、7 中。
[0034]用叶盘法，转化并筛选烟草，获得稳定转化本序列的烟草。提取转化子的RNA，反转录并进行RT-PCR鉴定。參考图2 (a)为野生型烟草，參考图2(b)为转化子烟草。参考图3为转p35S::UR0融合基因的转基因烟草的RT-PCR鉴定图谱。其中wt为野生型对照，其它样品tbu-1, tbu-2, tbu-3为不同株系的转化子。
[0035]待转化子生长3个月后，取同样生长时间和条件的野生型及转化子完全成熟的叶片，进行横切观察，结果发现，转化子的叶片细胞明显增大，如图4。同时取无菌培养转基因烟草叶片和野生型叶片在含有一定浓度NaCl的培养基上培养，拍照记录结果并利用image tool3.0软件分析結果。结果如图5所示，在没有NaCl的培养基上，野生型和转基因烟草的生长状态良好，均没有明显的白化，如图5中的A，B所示。在含600mM NaCl的培养上培养两天后，野生型烟草已经有很明显的白化现象，如图5中的C所示，緑色部分比例平均为57.3%，如图6所示；而转化子tbu-5的白化比例较野生型明显偏低，如图5中的D所示，只有在伤ロ很严重处有少许白化，緑色部分比例平均为85.2%，如图6所示。当浓度增加到SOOmM吋，差别更明显，野生型在第一天时就已经完全白化了，如图5中E所示，而URO转化子tbu-5即使在培养3天后，叶片依然维持很高的叶绿素含量，如图5中F所示。
[0036]实施例1，提取拟南芥基因组DNA
[0037]试剂:
[0038]Lysis Buffer =Tris-HCl, pH8.0 (0.2M);尿素(7M);十二烷基肌氨酸钠(2%)；EDTA (0.05M)步骤:
[0039](I)植株的绿叶或花等组织适量，置于1.5ml的离心管中，加200 ill裂解液，用小棒研磨成浆，再用400 ii I裂解液冲洗小棒。
[0040](2 )加600 ill的酚-氯仿，剧烈震荡20秒，使蛋白质变性。
[0041](3) 12000rpm离心5分钟后取上清。
[0042](4)加 50 ii I 醋酸钠，600 U I 异丙醇，混匀，12000rpm 离心 5min。
[0043](5)去上清，沉淀溶于 400 ill TE(Tris-EDTA)中。
[0044](6)再加 40iil 3mol/L NaAC(PH5.2), Iml 无水こ醇，混匀，12000rpm 离心 5min。
[0045](7)去上清，用70%こ醇洗沉淀一次，离心；去清液。
[0046](8)室温干燥，沉淀溶于50 Ul无菌水中，即为提取得到的植物基因组DNA。
[0047]实施例2 (a), PCR方法获得目的基因片段
[0048](I)以实施例1中提取的拟南芥DNA作为模板
[0049]URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列I所示。
[0050]启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
[0051](2)引物设计
[0052]根据URO基因及其启动子序列，以及购建克隆方便，设计ー对引物，URO-F和UR0-R，其中前者的引物上有ー个Xhol的限制性内切酶酶切位点，引物序列为:
[0053]上游引物UR0-F:5，ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,如序列 3 所示。
[0054]下游引物URO-R:5’ tta atg atg acg atg acc g 如序列 4 所示。
[0055](3) PCR扩增目的片段
[0056]PCR试剂:K0D-Plus酶购自于T0Y0B0公司
[0057]PCR反应体系:
【权利要求】
1.一种提高植物抵抗盐胁迫能力的方法，其特征在干，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，提高植物抵抗盐胁迫能力；其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述启动子的多核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于构建所述含有URO基因及启动子序列基因的表达载体是含有T-DNA的双元载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有URO基因及启动子序列的表达载体为p35S::UR0 ;所述p35S::UR0的构建包括如下步骤:以拟南芥的总DNA为模板，设计引物，上游引物 URO-F:5’ ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下游引物 UR0-R:5’ ttaatg atg acg atg acc g ;经PCR循环反应得到扩增产物,得到URO基因的核酸片段,连接到T-Vector ;将连接产物转化至大肠杆菌，经筛选得到阳性克隆URO-T ；URO-T质粒经XhoI和EcoRI酶切后，与经XhoI和EcoR I酶切后的含有35S启动子的双元载体pMon530上进行连接，获得含有融合35S启动子和URO的重组载体pMon530-UR0。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR循环反应的条件为:94°C5min ;一次循环 94で 30sec,55°C 45sec,72°C 90sec，30 次循环；72で IOmin0
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为草本或木本植物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化方法为农杆菌转化法，基因枪介导转化法，或花粉管通道法 。
【文档编号】A01H5/00GK103525857SQ201210236403
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2012年7月6日
【发明者】孙越, 刘水, 李玲 申请人:华东师范大学