人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因 GsDREB2-mNRD，属 于遗传工程技术领域。
【背景技术】
[0002] DREBs/CBF (Dehydration Responsive Element Binding protein,脱水应答兀 件结合蛋白；CBF-repeat binding factor, C-repeat元件结合因子）类转录因子与DRE/ C-repeat元件在胁迫基因表达方面为我们呈现了一个重要的转录调控系统。分析表明，这 些转录因子基因的表达与不同的生理条件相关。例如，〇1?8认、8、0/^8?1、2、3被低温诱导， DREB1A、DREB1D/CBF4、DREB2A 和 DREB2B 被盐和干旱诱导，DREBlF 被盐诱导，而 DREBlE 受 ABA (abscisic acid,脱落酸)诱导。拟南芥中一些胁迫诱导基因如rd29A、Cor6. 6、Corl5a 和Kinl等都被DREBs/CBFs诱导表达，它们的启动子中均含有DRE/C-r印eat元件。Seki等 人鉴定出6个新基因，它们的启动子中同时含有DRE/C-repeat和ABRE元件，意味着这些基 因可能既存在于胁迫反应的ABA依赖途径中，又存在于ABA不依赖途径中。Liu等从干旱 处理的拟南芥cDNA文库中克隆到2个与DRE元件结合，在干旱、高盐胁迫下调控报道基因 ⑶S (β-glucuronidase，β-葡萄糖苷酸酶）表达的基因，定名为和。它 们受干旱和高盐诱导表达，为干旱和高盐应答基因，如用干旱或高盐（250mmol/L NaCl)进 行胁迫处理，15min内，DREB2A和DREB2B基因即可被快速强烈诱导表达，尤其在植物根部， 但是，这两个基因不受外源ABA的诱导。
[0003] 在DREB转基因植物中，DREB转录因子基因的过量表达可以激活靶基因的表达，提 高植物对低温、干旱等逆境的忍耐力。Liu等研究转入35S : DREBlAb和35S : DREBIAc 的转基因拟南芥，将植株在-6°C处理2天，再恢复正常温度生长，结果对照野生型植株全 部死亡，而转入35S : DREBlAb和35S : DREBIAc的植株的存活力分别为19%和17%。检 测对干旱的忍耐力时，对植株作2周不浇水处理，结果对照野生型植株全部死亡，而转入 35S : DREBlAb和35S : DREBIAc的植株再恢复浇水后分别有19%和14%的存活。Dubouzet 等和Qin等分别将克隆的水稻OsDREBlA cDNA，玉米ZmDREBlA cDNA转入拟南芥，结果转基 因拟南芥对低温、干旱和高盐的忍耐力大大高于野生型拟南芥。2005年，陈受益等在大豆中 分离到了 3个DREB基因，分别为GmDREBa、GmDREBb、GmDREBc，并推断该3个基因均能应答 非生物胁迫。王巧燕等从大豆耐盐品种中克隆了一个新的DREB基因 GmDREB2。并通过拟 南芥、烟草验证基因的功能。在后续的研究中发现，该基因提商了转基因拟南芥对干旱和商 盐的抗性，并且，过量表达该基因的转基因烟草，在干旱条件下，自由脯氨酸的含量较对照 明显提高。该研究表明，该基因在转录激活中起到重要的作用，并能够促进植物对非生物胁 迫的抗性，可以应用于非生物胁迫基因工程中，有效地提高作物的耐逆性。2008年，马有志 等又分离到大豆GmDREB3基因，在研究中还发现，该基因在组成型启动子的调控下，转基因 植株的生长受到抑制，而使用Rd29A启动子则不影响转基因植株的生长。
[0004] DREB转录因子的研究已较为深入，但是对该转录因子上游的调控机理并不十 分清楚，对该转录因子激活、结合及其它结构的功能也还有欠缺。在研究中发现，拟南芥 DREB2A转录因子的内部存在一个负向调节结构域（negative regulatory domain, NRD)， 该结构域的存在影响着DREB2A转录因子的结合和激活功能，并且研究发现，该结构域的 缺失可以提高植物对干旱的耐受性（Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Qin F, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression. Plant Cell, 2006, 18(5) : 1292-309)。本研究室克隆了野生大豆的GsDREB2基因（野生大豆 DREB基因的筛选与结合功能分析，哈尔滨工业大学学报，2009,41 (9) : 198-200 ;野生大豆 DREB基因 cDNA的克隆与分析，草业科学，2009, 26 (8) : 17-23)，并深入的研究了该基因的 功能。但是在进行超量表达GsDREB基因拟南芥和烟草的耐盐和干旱胁迫试验时发现，该基 因并没有明显的使转基因拟南芥或烟草的耐逆性提高，鉴于以上的研究，提出这样的疑问， GsDREB2基因内部是否也存在着负向调节结构域，该结构域的存在是否也影响着GsDREB2 基因的调节功能呢？通过实验我们发现来源于野生大豆的GsDREB2基因内部含有NRD，该 结构域具有抑制DREB转录因子与DRE元件结合的特性，同样也抑制转录激活功能。如何改 造 GsDREB2基因并将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，用于提高拟南芥的耐盐性 和抗旱性成为急需解决的一大难题。所以，发明一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱 性的基因 GsDREB2-mNRD (m :mutant)是必要的。
【发明内容】
[0005] 为了克服如何改造 GsDREB2基因并将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南 芥，用于提高拟南芥的耐盐性和抗旱性的难题，本发明提供了一种人工改造的能提高植 物耐盐性和抗旱性的基因 GsDREB2-mNRD，该人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的 基因 GsDREB2-mNRD利用对GsDREB2基因进行改造，使NRD结构域缺失，将人工改造的 GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，可以达到提高拟南芥的耐盐性和抗旱性目的。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 本发明的人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因 GsDREB2-mNRD，其特征在 于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的 负向调节结构域NRD ;人工改造 GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为 GsDREB2-mNRD (Seq ID No:3)〇
[0007] 所述的NRD结构域的预测是用拟南芥AtDREB2A基因 （At5g05410)与GsDREB2基 因的氨基酸序列进行序列比对，确定GsDREB2基因的结构域区域，选择AP2结构域（即转录 因子与DNA结合的结构区区域）和转录激活区域之间的丝氨酸（Ser)苏氨酸（Thr)富集区 域（GsDREB2全长基因 140-204 aa)做为预测的NRD区域。根据预测的NRD位点，设计不同 缺失片段扩增的引物序列，并添加相应的酶切位点，以便于构建转录激活和转录结合的载 体 PGBKT7 与 pGADT7-Rec2。
[0008] 所述的不同缺失片段于DRE元件结合能力的分析，首先构建4 mer DRE报告载体： 以CCGAC为核心序列（DRE元件的核心序列)，进行4次重复，核心元件之间以ATGAGTATACTA 间隔，合成双链4 mer DRE元件序列，分别为DRE(+)和DRE(-)，并且为了便于连接到pHIS2 报告载体(酵母单杂交用的报告载体，Invitrogen公司商业化载体）上，在上下游分别加 feo R I和5^ I限制性酶切识别序列，分别是GAATTC和GAGCTC。合成的序列为（DRE(+): 569 10此:911和01^(-):569 10此：12)。各取20 111浓度为1即