一种抗氧化及耐高盐胁迫的人工合成sRNA及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种能提高宿主细胞逆境胁迫抗性的基 因，具体涉及一种具有抗氧化及耐高盐胁迫的人工合成SRNA，本发明还涉及所述人工合成 sRNA的用途。
【背景技术】
[0002] 四十年前在E.coli中首次发现了sRNA，但是对其编码基因和功能并没有确定。近 期的研宄表明在细菌中sRNA控制了不同的细胞活动，例如：耐酸性，糖代谢和外膜应激反 应等等。其中OxySsRNA的转录激活能够保护细胞减轻氧化胁迫的伤害，而DsrAsRNA的 激活能够保护细胞减轻低温伤害。
[0003]Hfq是一种转录后调节子，近年来越来越多的研宄表明sRNA与Hfq有联系或是 需要该蛋白对革巴mRNA进行转录后控制[WassarmanKM，ZhangA，StorzG.SmallRNAsin bacteria:diverseregulatorsofgeneexpressioninresponsetoenvironmental change[J].Cell，2002, 109:141-144.]。Hfq能够特异性地增加OxySRNA和它的靶mRNAs 的相互作用。通常Hfq与sRNA协同与靶mRNA结合从而形成一个核酸蛋白复合物[M0llcr T,FranchT,H0jrupP,KeeneDR,etal. .Hfq:abacterialSm-likeproteinthat mediatesRNA-RNAinteraction[J].Mol.Cell, ,2002a, 9:23-30.]。2003 年研宄表明Hfq 能够与大约1/3的已知的大肠杆菌sRNA较高亲和性的结合。2011年Laura等人通过对 hfq突变株的芯片分析在奈瑟氏菌中发现了大量的直接或是间接受该蛋白调控的sRNAs。 2013年DokyunNa等人利用人工合成调控小RNA来调节微生物部分基因的表达，通过组合 筛选找到的合成sRNA抑制murE基因可以使受体菌株产1，5-戊二胺能力提高55%[Dokyun Na,SeungMinYoo,HannahChung,HyegwonPark,JinHwanPark&SangYupLee.Metabolic engineeringofEscherichiacoliusingsyntheticsmallregulatoryRNAs.Nature BiotechnologyVOLUME31NUMBER2FEBRUARY2013 ;doi: 10. 1038/nbt. 2461.]，有力证 明了sRNA在调控细胞代谢过程中的作用。
[0004] 但是，目前尚未见到任何有关来自固氮施氏假单胞菌非编码sRNA基因赋予宿主 细胞抗氧化及耐高盐胁迫功能的研宄报道，更未见到其结合Hfq转录调节子能够提高宿主 逆境胁迫性的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是设计并合成一种新的SRNA，使其具有赋予宿主细胞抗氧化及耐高 盐胁迫的功能。
[0006] 本发明人利用转录组分析及蛋白组分析方法对施氏假单胞菌A1501菌sRNA的组 成及功能进行了研宄，首次发现并确定了非编码SRNA03基因的核心序列片段，并且结合非 编码RNA的Hfq转录调节子，人工合成了一种新的sRNA，命名为AncR03。
[0007] 所述人工合成AncR03基因的核心序列片段是SEQIDNO: 2所示的特异性结合序 列。
[0008] 所述人工合成AncR03基因中Hfq蛋白结合序列是SEQIDNO:3所示的序列。
[0009] 具体地，本发明进行了如下研宄：
[0010] -、人工合成sRNA中特异结合序列的确定
[0011] 具体步骤如下：
[0012] 1、固氮施氏假单胞菌A1501(P.stutzeriA1501)中SRNA03结合区（20bp)基因片 段缺失突变株（A1501ASRNA03)的构建：
[0013] 2、A1501ASRNA03缺失突变株互补菌株的构建：
[0014] 3、缺失sRNA0320bp结合区对施氏假单胞菌A1501菌株氧化胁迫抗性的影响：
[0015] 实验结果显示，缺失sRNA0320bp结合区片段导致突变菌株抗氧化胁迫能力比野 生型低了两个数量级；而回补菌株能部分恢复菌株的抗氧化胁迫能力。表明该20bp片段是 SRNA03发挥功能的重要结合域。
[0016] 二、人工合成sRNA表达质粒pSAncR03的构建
[0017] 在确定了人工合成sRNA重要的特异性结合序列后，选取大肠杆菌中启动子序列， Hfq蛋白结合序列和终止子序列按照序列表所示合成该人工合成sRNA的完整序列。
[0018] 在本发明一个实施例中，该AncR03由启动子（SEQID NO: 1)，特异性结合序列（SEQ ID NO:2)，Hfq蛋白结合骨架序列（SEQID NO:3)及终止子（SEQID NO:4)四部分组成。
[0019] 人工合成sRNA的功能实验：
[0020] 实验证明，本发明所得到的人工合成sRNA具有特异响应逆境信号的功能，能够大 幅度提高其他受体菌株的氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性，用其构建的携带该SRNA03的重组 工程菌株，相对于不含有该SRNA03的菌株，在相同的高浓度的氧胁迫和高浓度的盐胁迫条 件下，具有更尚的生存率。（详见实施例）。
[0021] 与目前常用的直接转入抗氧化及耐盐功能基因相比，由于sRNA处于细胞代谢调 节的上游，因此调节效率更高且针对性更强，对细胞功能影响小。
[0022] 本发明的创造性主要体现于发明构思和核心序列：
[0023] 由于本发明首次发现了上述核心序列片段是SEQIDN0:2,根据本发明的发明构 思，当本领域技术人员根据需要和实际条件，可以设计并人工合成得到多种不同的sRNA的 完整序列，用于提高其他受体菌株的氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性。
[0024] 例如，选取其它适当的启动子序列、Hfq蛋白结合序列和终止子序列，或者连接其 它功能的序列。但这些都不能脱离本发明的发明精神。
[0025] 本发明提供的人工合成sRNA的用途：
[0026] 由于该人工合成sRNA具有特异响应逆境信号的功能，可用于工业生产提高氧化 胁迫抗性和盐胁迫抗性的菌株。而这样的菌株在许多方面具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0027] 图1是H202冲击后野生型A1501，缺失突变株A1501ASRNA03及回补菌株 A1501sRNA03的生存力比较；
[0028] 图2是人工合成sRNA酶切后连接到载体中，构建的表达载体pSAncR03的构建图 谱；
[0029] 图3是过氧化氢胁迫冲击后E. coli T0P10及重组菌株E. coli T0P10(pSAncR03) 的生存力比较；
[0030]图4是NaCl冲击后E. coli T0P10及重组菌株E. coli T0P10 (pSAncR03)的生存 力比较。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明做更为详细地阐述；实施例仅用于举例说明本发 明，而不用于限制本发明的范围。在本发明的基础上，本领域的技术人员具体操作过程中， 可以根据实际需要做一些非实质性地修改，这些修改都应属于本发明保护的范围。
[0032] 实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条 件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0033] 实施例1人工合成sRNA中特异结合序列的确定和表达质粒pSAncR03的构建
[0034] 一、人工合成sRNA中特异结合序列的确定
[0035] 我们发现来自于固氮施氏假单胞菌A1501的非编码SRNA03参与调控宿主细胞部 分抗逆生理过程。实验证明，缺失SRNA03会导致细胞抗氧化和耐盐能力的降低，而将该 sRNA转入大肠杆菌中也会明显增强其在过氧化和高盐环境中的生存能力，其调控细胞抗逆 生理过程已被确认。为了构建调控能力更强的sRNA，首先需要明确的就是特异性结合序列， 为此我们通过生物信息学软件分析SRNA03并选取其结合区域一段20bp片段作为特异性结 合区，构建该区域缺失及回补菌株，利用氧化抗性实验证明该区域的作用。具体步骤如下：
[0036] 1、固氮施氏假单胞菌A1501(P. stutzeri A1501)中sRNA0320bp片段缺失突变株 的构建：
[0037] 首先利用融合PCR技术将20bp目的基因的上游片段、壮观霉素抗性盒基因以及 目的基因的下游片段融合成一大小约为2.lkb的长片段，然后将克隆片段进行BamHI和 HindllI双酶切，连接到自杀载体pkl8m〇bSacB上。将构建好的自杀重组质粒通过三亲结合 的方法导入到野生型A1501菌中，通过与染色体上基因的同源重组将自杀质粒整合到了染 色体上，利用抗性筛选和PCR验证得到单交换菌株，然后根据sacB基因在10%蔗糖选择压 下致死的特性，将经过PCR验证的单交换克隆按照10'1(T4和1(T5的稀释梯度分别涂布在 含有10%蔗糖的壮观霉素抗性的LB平板，进行双交换的筛选，经PCR验证得到RNA0320bp 结合域的完全缺失突变菌株A1501ASRNA03。
[0038] 2、A1501ASRNA03突变株互补菌株的构建：
[0039] 首人工合成sRNA0320bp片段，然后将合成的片段进行BamHI和Hindlll双酶切， 连接到广宿主表达载体PLAFR3上，通过三亲结合的方法转到A1501ASRNA03中，成功获得 互补菌株A1501sRNA03。
[0040]3、缺失sRNA0320bp结合区对施氏假单胞菌A1501菌株氧化胁迫抗性的影响：
[0041] 分别培养野生型A1501，缺失突变株A1501ASRNA03,和回补菌株A1501sRNA03。在 固体平板上挑取单菌落在液体LB培养基中分别过夜培养，次日转接到LB培养基中使0D_ 约为0. 1，30°C培养2-3h，至006(|(|约0. 6左右。首先各取lml菌体，稀释到10 _4为空白对 照，然后再各取lml菌体加入终浓度为20mMH202冲击10min，最后将每个处理做梯度稀释 至1(T4,取8y1点到LB固体平板上，30°C过夜培养、观察（图1)。
[0042] 图1H202冲击后野生型A1501，缺失突变株A1501ASRNA03及回补菌株 A1501sRNA03的生存力比较。
[0043] 实验结果显示，缺失sRNA0320bp片段导致突变菌株抗氧化胁迫能力比野生型低 了两个数量级；而回补菌株能部分恢复菌株的抗氧化胁迫能力。表明该20bp片段是SRNA03 发挥功能的重要结合域。
[0044] 二、人工合成sRNA表达质粒pSAncR03的构建
[0045] 在确定了人工合成sRNA重要的特异性结合序列后，选取大肠杆菌中启动子序列， Hfq蛋白结合序列和终止子序列按照序列表所示合成该人工合成sRNA的完整序列。
[0046] 人工合成sRNA序列组成结构按以下方式连接：1一2- 3- 4
[0047] 序列如下表所示：
[0048]
【主权项】
l.SEQ ID N0:2所示序列的基因在赋予宿主细胞抗氧化及耐高盐胁迫方面的应用。
2. 含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的基因在赋予宿主细胞抗氧化及耐高盐胁迫方面的 应用。
3. -种具有抗氧化及耐高盐胁迫功能的人工合成sRNA，其特征是含有SEQ ID NO: 2所 示序列。
4. 权利要求3所述的sRNA，其特征是还含有SEQ ID NO: 3所示序列。
5. 权利要求4所述的81?隱，还含有3￡〇10勵：1和3￡〇10勵:4所示序列。
6. -种具有抗氧化及耐高盐胁迫功能的人工合成sRNA，序列组成结构为：1 一2- 3- 4,其中，1 :启动子序列；2 :特异性结合序列；3 :Hfq蛋白结合序列；4 :转录终止子序列； 序列分别是：启动子（SEQ ID N0:1)，特异性结合序列（SEQ ID N0:2)，Hfq蛋白结合骨 架序列（SEQ ID NO:3)，转录终止子（SEQ ID NO:4)。 7. SEQ ID N0:2所示序列的基因。
【专利摘要】本发明首次发现并确定了来自于施氏假单胞菌非编码sRNA基因的核心序列片段，并且结合大肠杆菌非编码RNA的Hfq转录调节子，人工合成了一种新的sRNA。经实验证实,该人工序列具有赋予宿主细胞抗氧化及耐高盐胁迫的功能。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-11, C12N15-70
【公开号】CN104593361
【申请号】CN201510007581
【发明人】燕永亮, 陆伟, 战嵛华, 王劲, 张维, 陈明, 林敏
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月7日