酪蛋白激酶胁迫相关多肽及其用于植物的方法

专利名称：：酪蛋白激酶胁迫相关多肽及其用于植物的方法酪蛋白激酶胁，关多肽及其用于植物的方法相关申请的交互参考本申请为要求于2004年11月17日递交的美国申请号10/卯4，588优先权的国际申请，是递交于2001年4月6日的美国申请号09/828,313的继续申请，后者要求于2000年4月7日递交的美国临时专利申请系列号60/196,001的优先权。美国申请号10/904,588也是递交于2002年11月12曰的美国申请号10/292,408的继续申请，要求于2001年11月9日递交的美国临时专利申请系列号60/346,096的优先权。所述申请的完整内容在此处引用作为参考.发明背景发明领域本发明主要涉及编码植物中非生物胁迫反应和非生物胁迫耐受性相关多肽的核酸序列.具体而言，本发明涉及编码赋予植物旱、冷和/或盐耐受性的多肽的核酸序列.
背景技术：
：非生物环境胁迫如旱胁迫、盐胁迫、热胁迫和冷胁迫，是植物生长和生产力的主要限制因素。由这些胁迫所导致的主要农作物如大豆、稻、玉米、棉花和小麦的作物损失和作物产量损失具有重要的经济和政治意义，造成了许多不发达国家的粮食短缺。植物在其生活周期中一般都会面临环境水含量减少的情况。大多数植物进化产生了保护自己免受这些干旱情况影响的策略。然而，如果干旱情况的严重程度过高、持续时间过长，对大部分作物植物的发育、生长和产量都会产生深远影响。持续暴露于千旱会引发植物新陈代谢的显著变化，最终导致细胞死亡和随即的产量损失。研发胁迫耐受性植物是可能解决或緩和至少部分这些问题的策略。然而，常规采用植物育种产生对这些胁迫具有耐受性的新植物物种的策略相对緩'艮，而且需要特定的耐受性物种与所需物种进行杂交。胁迫耐受性的胚质资源有限，以及远亲植物物种间的杂交不相容性给常规育种带来了巨大问题。此外，在抗早和/或抗盐的模型植物中导致旱、冷和盐耐受性的细胞过程性质复杂，包括细胞适应的多重机制和无数代谢路径。这一胁迫耐受性多元性不仅使耐受性育种多以失败告终，还限制了利用生物技术方法对胁迫耐受性植物进行遗传工程操作的能力。旱胁迫、热胁迫、冷胁迫和盐胁迫具有植物生长的重要共同要素，即水的可得性。如上所述，大多数植物进化产生了保护自身免受干旱环境影响的策略；然而，如果干早情况的严重程度过高、持续时间过长，对大部分作物植物的发育、生长和产量都会产生深远影响。此外，大多数作物植物易受土壤中较高盐浓度的影响.由于某些土壤的高盐M会导致细胞可摄取水量的减少，高盐浓度对植物的影响与干旱对植物的影响具有类似之处.此外，在冰冻温度下，植物细胞由于起始于质外体的结冰从共质体中吸取水而丟失水分。植物对这些胁迫中每一种均具有共同的分子应答机制，而蛋白激酶如M白激酶在这些分子机制中发挥重M用，蛋白激酶形成一个^*^7^;*家^员催化ATP中磷^团向乾多肽上丝氨酸、苏氛酸和酪氨酸JL^酸側链的可逆转运，蛋白激酶为植物中信号转导过程的基础元件，已有人报道其在细胞(以及植物)应答环境刺激的信号感知和转导中发挥关鍵作用，具体而言，S^白激酶I蛋白质为含有高度保守的中央激酶结构域的单体丝氨^/苏氦酸类蛋白激酶。该家族成员具有多变的N-末端和C-末端延伸。N-末端区域负责底物识別，而C-末端延伸对于激酶与底物的相互作用至关重要.C-末端延伸对通过自磷酸化介导的调节也起重要作用(Gross和Anderson,1998CellSignal10:699-711;Graves和Roach,1995，JBiolChem270:21689-21694)。尽管已经表征了涉及植物中胁迫应答和水利用效率的某些基因，对产生胁迫耐受性和水利用效率的植物基因的表征和克隆仍然相当欠缺和破碎。例如，一些研究提示，某些植物中旱胁迫和盐胁迫可能是叠加基因效应所致，而另一些研究则认为植物营养组织中的特定基因在渗透性胁迫时发生了转录活化。虽然一般认为胁迫诱导蛋白在耐受性中发挥一定作用，仍然缺乏直接证据，许多胁迫应答基因的功能仍为未知。所有陆生光合作用生物中，都存在C02吸收和7jc丢失之间的基本生理化学强制性平衡(Taiz和Zeiger1991PlantPhysiology,Benjamin/CummingsPublishingCo,94页)。C02必须处于水溶液中，C02固定酶如核酮糖二磷酸缩化酶-加氧酶(Rubisco，核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)和PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)才能发挥作用。由于C02扩散需要湿润的细JJ&^面，当湿度低于100%时将会不可^地发生蒸发(Taiz和Zeiger1991PlantPhysiology,Benjamin/CummingsPublishingCo257页)。植物具有多种生理机制减少水分丢失(例如蜡角质层、气孔关闭、叶毛、下陷气孔窝)。由于这些屏障对于水和C02的流出并无差别，这些保^#施也能增强对C02摄取的耐受性(Kramer1983WaterRelationsofPlants,AcademicPress305页)，光合作用性0!02摄取对于光合自养植物的植物生长和生物量累积是绝对必要的。水利用效率(WUE)是估计水消耗和C02摄取/生长之间平衡时常用的^t(Kramer1983WaterRelationsofPlants,AcademicPress405页)，可以通过多种方法定义和计算WUE.—种方法是计算整个植物干重与该植物一生中消耗水分重量的比值(Chu等人1992Oecologia89:580),另一方法是测量更短时间间隔内的生物量累积和水分利用(Mian等人1998CropSci.38:390).通常只测量植物中的局限部分，例如仅测量地上部生长量和水利用(Nienhuis等人1994AmerJBot81:943).也可定义WUE为一片叶子或其部分中C02摄取与水蒸汽丢失的比值，通常在很短时期内(秒/分钟)测量(Kramer1983WaterRelationsofPlants,AcademicPress406页)。利用同位素比质谦仪测量的植物组织中固定的13C/12C比，也可用于估计使用C3光合的植物中的WUE(Martin等人1999CropSci.1775)。WUE的提高对生长和水消耗效率的相对改善具有提示意义，但其本身并不能描述这两个过程中何者(或两者都)发生了改变。选择改良作物的性状时，由于水利用减少但生长无改变导致的WUE提高，在7^A^费昂贵的灌溉农业系统中具有特别优点。主要由生长增加而无相应水利用上升而导致的WUE提高，则可应用于所有的农业体系。在许多供水不受限的农业系统中，即偵是以水利用增加为代价(即WUE不改变)的生长增加也能提高产量。因此，需要能同时提高WUE和生物量累积的新方法来提高农业生产力。由于WUE整合了涉及初级代谢和水利用的许多生理学过程，其通常是受到环境相互作用具有广泛基因型的高度多基因性状，(Richards等人2002CropSci42:111)。由于这种种原因，常规育种项目中鲜有选择WUE改变的尝试获得成功。因此，需要鉴定在胁迫耐受性植物和水利用有效植物中表达的基因，新产i的胁迫耐受性植物将真务多种优势，例如通过如降低植物物种的水需求而扩大作物的可培育范围。其他有利优势包括对倒伏的耐受性，即风、雨、虫害或病害引起的苗或茎弯折.发明概述本发明部分实现了鉴定新的独特酪蛋白激酶的需求，所述激酶在过量表达时使植物具有胁迫耐受性。本发明描迷了对调节植物对环境胁迫应答具有重要作用的新型酪蛋白激酶胁^目关多肽(CKSRP)及CKSRP编码核酸.更具体而言，这些CKSRP编码核酸在植物中的过量表达，导致该植物对环境胁迫的耐受性增加.因此，本发明包括分离的含有CKSRP编码核酸的植物细胞，其中该核酸序列在植物细胞中的表达导致其对环境胁迫的耐受性相对于该植物细胞野生型品种增加。优选该CKSRP来自小立碗藓(iV^conK'frd/fl/wtews)、酉良酒酵母(iSfl"Aflfv考ces1"柳/siV^)或欧洲油菜(5r鹏/ca"a/ms)。即此处所述的为小立碗藓酪蛋白激酶-4(PpCK-4或EST289)、小立碗藓酪蛋白激酶-1(PpCK-l或EST194)、小立碗藓酪蛋白激酶-2(PpCK-2或EST263)、小立碗藓蛋白激酶-4(PpPK-4或EST142)、(ScCK-l或ORF760)、欧洲油菜酪蛋白激酶-l(BnCK-l)、欧洲油菜酪蛋白激酶-2(BnCK-2)。欧洲油菜酪蛋白激酶-3(BnCK-3)、欧洲油菜酪蛋白激酶-4(BnCK-4)和欧洲油菜酪蛋白激酶-5(BnCK-5)。本发明某些实施方案中提供的CKSRP及其编码核酸见于小立宛藓OP/y;wwiM>e/te)、酵母(SflCcA"iv附jY^s)或芸莒(5rfl5s/cfl)属成员。在另一优选实施方案中，核酸及多肽来自小立碗藓或欧洲油菜植物或酿酒酵母。本发明中的环境胁迫可为盐、旱、温度、金属、化学物、病原体和氧化胁迫或其組合。在优选实施方案中，环境胁迫选自干旱、高盐和低温中的一种或几种.本发明还提供了CKSRP编码核酸转化的转基因植物产生的种子，其中所述植物为对环境胁迫耐受性相对于该植物野生型品种增强的真实遗传，本发明还提供了下述任意转基因植物、植物部分或种子产生的农产品，;^发明3i提供了下迷分离的CKSRP.4^发明还^^供了分离的CKSRP编码核酸，其中CKSRP编码核酸编码下迷的CKSRP。本发明还提供了分离的含有下述CKSRP编码核酸的重组表达栽体，的野生型品种增强，本发明还提供了含有栽体的宿主细胞和含有该宿主细胞的植物.本发明还提供了产生含CKSRP编码核酸的转基因植物的方法，其中品种增强，包括(a)利用含有CKSRP编码核酸的表达栽^化植物细胞，以及(b)从该植物细胞中产生对环境胁迫的耐受性相对于该植物野生型品种增强的转基因植物。优选实施方案中的CKSRP和CKSRP编码核酸如下所述，本发明还提供了鉴定新CKSRP的方法，包括(a)引^t下述CKSRP或其片段的特异性抗体应答；(b)利用该抗体筛选可能的CKSRP材料，其中抗体与材料的特异性结合提示可能存在新的CKSRP;以及(c)从结合材料中鉴定相对于已知CKSRP的新CKSRP。或者与下述核酸探针杂交可用于鉴定新CKSRP核酸。本发明也提供了修饰植物胁迫耐受性的方法，包括修饰如下述CKSRP核酸在植物中的表达。可实施本发明提供的方法来增强或降低胁迫耐受性。优选通过提高CKSRP核酸的表达增强植物的胁迫耐受性。附图简述图1显示过量表达PpCK-l的转基因植物以及野生型拟南芥04ra6iVfo/w&)林系的干旱胁迫测试结果。转基因林系呈现耐受性表型。显示了个体转J沐系.图2显示过量表达PpCK-l的转基因植物以及野生型拟南芥抹系的冰冻胁迫测试结果，转基因物种呈现耐受性表型.显示了个体转化株系。图3显示过量表达PpCK-2的转基因植物以及野生型拟南芥抹系的干旱胁迫测试结果.转基因物种呈现耐受性表型.显示了个体转化株系.图4的图表说明了公开的小立碗藓和酿酒酵母S^白激酶与其他已知酪蛋白激酶的相对同源性。困5显示五种公开的小立碗藓和酿酒酵母酪蛋白激酶的M酸序列与其他已知酪蛋白激酶的氨基酸序列的比对(按出现顺序分别为SEQIDNOS10、47-48、6、4、2、49-52、8和53).阴影表示在每一序列中均保守的氨基酸^Jo以及那些在某些或所有序列中相同或相似的氨基酸残基。图6的图表说明了五种公开的小立碗藓和酿酒酵母酪蛋白激酶与公开的欧洲油菜、亚麻籽、小麦、大麦、向日葵和大豆酪蛋白激酶的相对同源性.图7显示五种公开的小立碗藓和酿酒酵母酪蛋白激酶的M酸序列与7>开的欧洲油菜、亚;^f、小麦、大麦、向日葵和大豆s^白激酶的ltj^酸序列的比对。基因ID和SEQIDNO的对应性见表A。该图也提示了基于比对序列的酪蛋白激酶I的一致序列。阴影提示在每一序列中均保守的氨基酸残基，以及那些在某些或所有序列中相同或相似的氨基酸残基。图8:在组成型启动子控制下拟南芥中过量表达PpPK-4、PpCK-4、PpCK-2或PpCK-l。测定转基因林系的相对水利用效率(WUE)、干重(DW)和植物水利用(E)(与对照的％差别)。发明详述参考以下本发明优选实施方案的详细描述和此处包括的实施例，有助于理解本发明。然而，在公开和描述本化合物、组合物和方法前，应当理解本发明并不仅限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因为这些显然会发生变化；对其多种修饰和改变对于本领域技^A员而言显而易见。还应当理解此处所用的术语仅为描述特定实施方案而不意在限制。具体而言，命名JL^酸序列为多肽"膝蛋白激酶胁迫相关多肽"(CKSRP),并不限制那些序列的功能性。本发明描述了对调节植物应答环境胁迫有重要作用的新型CSKRP和CSKRP编码核酸。更具体而言，这些CSKRP编码核M植物中的过量表达会导致该植物对环境胁迫的耐受性增强。该CKSRP属的代表成员包括但不仅限于PpCK-l、PpCK-2、PpCK-4、PpPK-4、ScCK-l、BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK4和BnCK-5。在优选实施方案中，该属的所有成员均为生物活性的膝蛋白激酶.因此，本发明包括CKSRP多核苷酸和多肽序列，及其在提高植物对环境胁迫耐受性中的用途.在一个实施方案中，CKSRP序列来自植物，优选为小立碗藓植物或芸荅植物，更优选为小立碗藓植物或欧洲油菜植物.在另一个实施方案中，CKSRP序列包括PpCK-l(SEQIDNOS:3和4)、PpCK國2(SEQIDNOS:5和6)、PpCK画4(SEQIDNOS:l和2)、PpPK-4(SEQIDNOS:7和8)、ScCK-l(SEQIDNOS:9和10)、BnCK-l(SEQIDNOS:ll和12)、BnCK-2(SEQIDNOS:13和14)、BnCK隱3(SEQIDNOS:15和16)、BnCK-4(SEQIDNOS:17和18)，以及BnCK-5(SEQIDNOS:19和20)。公开的小立碗藓CKSRP序列和公开的酿酒酵母CKSRP序列与已知的酪蛋白激酶具有显著百分比的同一性，如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本发明提供了由CKSRP编码核酸转化的转基因植物细胞，其中该核野生型品种增强，本发明还lt供含有此处所迷植物细胞的转基因植物部分和转基因植物，植物部分包括但不仅限于茎、根、胚珠、雄遂、叶、胚芽、分生组织区、愈伤組织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等.在某一实施方案中，转基因植物为雄性可育，也提供了由CKSRP编码核酸转化的转基因植物产生的植物种子，其中种子含有CKSRP编码核酸且其中该植物为对环境胁迫的耐受性相对于该植物细胞野生型品种增强的真实遗传.本发明还提供了由表达CKSRP的转基因植物产生的种子，其中种子含有CKSRP编码核酸且其中该植物为对环境胁迫的耐受性相对于该植物细胞野生型品种增强的真实遗传。本发明也提供了下述任意转基因植物、植物部分及植物种子产生的农产品。农产品包括但不仅限于植物提取物、蛋白质、氛基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等。此处所用的术语"品种"是指同一物种内具有恒定特征从而将其与该物种中的一般形式或其他可能存在的品种区分开的一组植物。虽然具有至少一种独特性状，品种的特征亦在于品种内个体间存在一些差异，所述差异主要是基于连续传代子代中性状的孟德尔分离。若"品种"为某一性状的遗传纯合子，以至于其自交产生的子代中不出现可观量该性状的独立分离，则该"品种，，为该性状的"真实遗传".在本发明中，该性状由导入植物品种内的一个或多个DNA序列的转基因表达而产生，本发明首次描述了小立碗藓CKSRP，PpCK-l、PpCK-2、PpCk4和PpPK-4;酿酒酵母CKSRPScCK-l;和欧洲油菜CKSRP，BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5可用于增强植物对环境胁迫的耐受性。此处所用的术语多肽是指含有至少4个由肽键相连的4y^酸链。该链可为线性、分支、环状或其組合.因此，本发明提供了选自PpCK-l、PpCK-2、PpCK画4、PpPK-4、ScCK-l、BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5及其同源物的分离CKSRP.在优选实施方案中，CKSRP选自1)SEQIDNO:4定义的小立碗藓絲白激酶-l(PpCK-l)多肽；SEQEDNO:6定义的小立碗藓SH^白激酶-2(PpCK-2)多肽；SEQIDNO:l定义的小立碗藓酪蛋白激酶-4(PpCK-4)多肽；SEQIDNO:8定义的小立碗藓蛋白激酶4(PpPK4)多肽；SEQIDNO:IO定义的酿酒酵母酪蛋白激酶-1(ScCK-l)多肽；SEQIDNO:12定义的欧洲油菜妙白激酶-1(BnCK-l)多肽；SEQIDNO:14定义的欧洲油菜酪蛋白激酶-2(BnCK-2)多肽；SEQIDNO:16定义的欧洲油菜SS^白激酶-3(BnCK-3)多肽；SEQIDNO:18定义的欧洲油菜酪蛋白激酶-4(BnCK-4)多肽；SEQH)NO:20定义的欧洲油茱S^白激酶-5(BnCK-5)多肽；及其同源物和直系同源物。M酸序列的同源物和直系同源物定义如下，本发明的CKSRP优选由重组DNA技术产生。例如，将编码多肽的核酸分子克隆A^达栽体(如下述)，将该表达载体导入宿主细胞(如下述)，并使CKSRP在宿主细胞中表达。可以利用标准多肽纯化技术，经合适的纯化步骤将CKSRP从细胞中分离出来。在本发明中，术语"重组多核苷酸"是指经遗传工程改变、重排或修^饰的多核苷酸。其实例包括任何克隆的多核普酸，以及与异源序列相连的多核苷酸。术语"重组，，并非指自然发生事件导致的多核苷酸改变，如自发突变。除了重组表达外，可以利用标准肽合成技术化学合成CKSRP或其肽。此外，可利用如抗-CKSRP抗体从细胞(如小立碗藓、酿酒酵母或欧洲油菜细胞)中分离出天然的CKSRP，所述抗体可利用CKSRP或其片段通过标准技术产生。此处所用的术语"环境胁迫"，是指涉及盐、千旱、温度、金属、化学物、病原体和氧化胁迫或其组合的次佳条件。在优选实施方案中，环境胁迫可选自盐、干旱或温度或其组合中的一种或多种；更具体而言，可选自高盐、低水含量或低温中的一种或多种。也应当理解用于该说明书a利要求书中的"一个，，或"一种"，可依据使用语境不同表示一种或多种.因此，"一个细胞"可表示至少使用一个细胞。对于也用于此处的术语"水利用效率"，是指植物生产出的有机物质量除以植物在生产时所利用的水量，即相对于植物用水的植物千重。也用于此处的术语"核酸"和"多核苷酸"，是指线性或分支、单链或双链的RNA或DNA或其杂交。该术语也包括RNA/DNA杂交物，这些术语也包括位于基因编码区3，和5，端的非翻译序列编码区5，端上游至少约1000个核苷酸序列以及该基因编码区3，端下游至少约200个核苷酸序列.不常见M如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嗜呤、次黄噪呤等也可用于反义、dsRNA和核酶配对，例如，含有尿嗜咬和胸腺嘧啶C-5丙炔类似物的多核苷酸能以高亲和力结合RNA，是基因表达的潜在反义抑制物.也可进行其他修饰，如对磷酸二酯主干或RNA核糖基团的2，-羟基进行修饰反义多核苷酸和核酶可完全由核糖核苷酸组成，也可含有混合的核糖核苷酸a氧核糖核苷酸.可通过包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、RT-PCR以及体外或体内转录等任意方法生产本发明的多核苷酸。"分离的"核酸分子为基本与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子(即编码其他多肽的序列)分离的核酸分子。优选地，"分离"核酸中不含有某些在天然存在的复制子中与该核酸天然侧接的序列(即位于核酸5，端和3，端的序列)。例如，克隆的核酸为分离的。在多个实施方案中，分离的CKSRP核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或O.lkb在获取该核酸的细胞(如小立碗藓细胞、酿酒酵母细胞或欧洲油菜细胞)基因组DNA中与该核酸分子天然侧接的核苷酸序列.若核酸已由人工干预改变，或置于并非其天然位置的基因座或位点，或若通it^杆菌感染法将其导入细胞，则该核酸也为分离的。此外，"分离的"核酸分子如cDNA分子，可不含有其天然伴有的某些其他细胞材料，或通过重组技术生产时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学物.具体而言，排除在"分离的核酸分子"定义之外的包括天然存在的染色体(如染色体扩散)、人工染色体文库、基因組文库和作为体外核酸制备物或转染/转化宿主细胞制备物形式的cDNA文库，其中宿主细胞为体外异源性制备物或作为单个集落的异源种一板。同样具体排除在外的为上述文库，其中某一特定核酸仅占据小于5%的插入栽体分子的核酸数目.其他M排除的为全细胞基因组DNA或全细胞RNA制备物(包括机械剪切或酶消化的全细胞制备物)，另外W排除的是作为体外制备物或由电泳分离的异源混合物，其中本发明核酸尚未进一步从电泳介质中与异源核酸分离(如通过从琼脂糖凝胶或尼龙印迹的异源条带中切下单个条带来进一步分离)的全细胞制备物，通过标准分子生物学技术及此处提供的序列信息，可以分离本发明的核酸分子，如具有核苷酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19或其部分的核酸分子。例如，可以利用此处公开的序列之一的全部或一部分，将小立碗藓CKSRPcDNA从小立碗藓文库中分离出来。此外，对含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:19中某一序列的全部或一部分的核酸分子而言，利用基于该序列设计的寡核苷酸引物、通过聚合,式反应能够分离之。例如，可以从植物细胞中分离mRNA(如通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸IM^取方法)，并且可利用逆转录酶制备cDNA(如可获自Gibco/BRL、Bethesda、MD的MoloneyMLV逆转录酶；或可获自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL的AMV逆转录酶)。可基于SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:19所示的核苷酸序列之一设计合成用于聚合酶链式反应扩增的寡核苷酸引物。以cDNA或基因组DNA为模板，利用合适JW苷酸引物，根据标准PCR扩增技^T增本发明的核酸分子.将如此扩增的核酸分子克隆入合适的栽体，并以DNA序列分析表征.此外，通过标准合成技术如利用自动DNA合成仪，能制备对应CKSRP核苷酸序列的寡核苷酸.在优选实施方案中，本发明中分离的核酸分子包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示的核苷酸序列之一。这些cDNA可能含有编码CKSRP的序列(即"编码区")，以及5，非翻译序列和3，非翻译序列.或者本发明的核酸分子可仅含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19中任意序列的编码区，或含有分离自基因组DNA的全基因组片段。本发明也包括编码此处所述CKSRP的CKSRP编码核酸。优选的CKSRP编码核酸为编码选自PpCK-l(SEQIDNO:4)、PpCK-2(SEQIDNO:6)、PpCK-4(SEQIDNO:2)、PpPK4(SEQIDNO:8)、ScCK画l(SEQIDNO:IO)、BnCK國l(SEQIDNO:12)、BnCK醫2(SEQIDNO:")、BnCK-3(SEQIDNO:16)、BnCK-4(SEQIDNO:18)和BnCK-5(SEQIDNO:20)的CKSRP的编码核酸。此外，本发明的核酸分子可含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17及SEQIDNO:19中某一序列编码区的一部分，例如可用作探针或引物的片段或者编码CKSRP生物活性部分的片段。通过小立碗藓、酿酒酵母或欧洲油菜的CKSRP基因克隆确定的核苷酸序列，可用于产生探针和引物，用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物的CKRSP同源物以及其他蘚类和相关物种中CKSRP同源物。编码区的部分也可编码CKSRP的生物活性片段.此处所用的术语CKRSP的"生物活性部分"，指包含CKSRP中参与调节植物胁迫耐受性的某一部分如结构^/部分，更优选为旱耐受性或盐耐受性。在本发明中，对胁迫耐受性的调节是指含CKRSP表达盒(或表达栽强或减少至少10%。定量胁迫耐受性的方法至少可见下文实施例7.在优选实施方案中，CKSRP的生物活性部分增强了植物对环境胁迫的耐受性.CKSRP的生物活性部分包含含有M酸序列的肽，其中所述氨基酸序列来自CKSRP絲,列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20，或来自与CKSRP相同多肽的A^酸序列，其中所含氨基酸少于全长CKSRP或为与CKSRP相同的全长多肽,且具有至少一种CKSRP活性.一般而言，生物活性部分(如长度为如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氛基酸的肽)含有具有CKSRP活性的至少一种结构域或基序.此外，通过重组技术可制备缺失多肽其他区域的其他生物活性部分，并评估此处描述的一种或多种活性.优选地，CKSRP生物活性部分包含一个或多个选择的具有生物活性的结构^/基序或其部分，如图5和7所示的保守的中央激酶结构域.在优选实施方案中，保守的中央激酶结构域包括4个保守区，其中第一区自位点l的甘氨酸残基开始，且位点3为甘氨酸，位点5为苯丙氨酸残基；第二区位于第一区下游，自位点l的缬氨酸残基开始，位点4为赖氨酸、位点6为谷氨酸残基、位点14为谷氨酰胺残基、位点15为亮氨酸残基、位点18为谷氨酸泉基、位点22为酪氨酸残基、位点32为脯氨酸残基、位点38为甘氨酸残基、位点44为天冬酰胺残基、位点50和51为亮氨酸残基、位点52为甘氨酸残基、位点53为脯氨酸^、位点55为亮氨酸残基、位点58为亮氨酸残基、位点59为苯丙氨酸残基、位点62为半胱氨酸残基、位点66为苯丙氨酸残基、位点69为赖氨酸残基、位点70为苏氨酸残基、位点77为谷氨酰胺残基、位点79为异亮氨酸残基、位点86为组氨酸^、位点93为精氨酸残基、位点94为天4^氨酸^J^、位点96为赖氨酸^、位点97为脯氨酸^A、位点99为天冬,残基、位点100为苯丙氨酸残基、以及位点101为亮氨酸残基；第三区位于笫二区下游，自位点l的天冬氨酸残基开始，位点5为丙氨酸残基、位点6赖氨酸瓶基、位点8酪氨酸残基、位点10天冬氨酸残基、位点13苏氨酸残基、位点16组氨酸残基、位点17异亮氨酸残基、位点18脯氨酸^t^、位点19酪氨酸残基、位点20精氨酸残基、位点23赖氨酸^*、位点27甘氨酸戎基、位点28苏氨酸残基、位点29丙氨酸戎基、位点30精氨酸^li、位点31酪氨酸g、位点33丝氨酸^l&、位点35天冬跣胺瓶基、位点37组氨酸残基、位点39甘氨酸残基、位点41谷氨酸残基、位点43丝氨酸M、位点44精氨酸粉l、位点45的精氨酸残基、位点46天冬氨酸残基、位点47天冬氨酸残基、位点49谷氨酸残基、位点52甘氨酸^Ul-、位点57酪氨酸残基、位点58苯丙氨酸残基、位点63亮氨酸残基、位点64脯氨酸^t^、位点65色氨酸残基、位点66^Mfe^残基、位点67甘氨酸残基；而第四区位于笫三区下游，自位点1的脯氨酸残基开始，位点12为精氨酸残基、位点14亮氨酸残基、位点16苯丙氨酸残基、位点20脯氨酸残基、位点21天冬氨酸残基、位点22酪氨酸残基、位点41天冬氨酸残基、位点45天冬氨酸残基，以及位点46为色氨酸残基，本发明也提供CKSRP嵌合或融合多肽。此处所用的CKSRP"嵌合多肽，，或"融合多肽"包含有效连接于非CKSRP的CKSRP。CKSRP是指具有对应于CKSRP的M酸序列的多肽，而非CKSRP是指具有的氛基酸序列对应于基本不同于CKSRP的多肽(如不同于CKSRP且来自相同或不同生物的多肽)的多肽。在融合多肽中，术语"有效连接"是指CKSRP与非CKSRP彼此融合，从而使两个序列都能实现所用序列的预期功能。非CKSRP可融合于CKSRP的N-末端或C-末端。例如，在一个实施方案中，融合多肽为GST-CKSRP融合多肽，其中CKSRP序列融合至GST序列的C-末端。此类融合多肽有助于重组CKSRP的纯化。在另一个实施方案中，融合多肽为在其N-末端^^有异源信号序列的CKSRP。在某些宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列能提高CKSRP的表达和/或分泌，优选通过标准重组DNA技术生产本发明的CKSRP嵌合或融合多肽。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段按阅读框架连接在一起，如利用平头或错开末端进行连接，限制性酶消化以提^适的末端，必要时补足祐性末端，碱性磷酸酶处理以避免不必要的结合和酶连接。在另一个实施方案中，可通过常规技术包括自动DNA合成仪合成融合基因.或者利用锚定引物实施基因片段的PCR扩增，所述锚定引物能在两个连续基因片段间产生互补突出端，从而可l^退火并再扩增以产生嵌合基因序列(见如CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人编辑.JohnWiley和Sons:1992)。此外，可购买得到多种编码融^p分(如GST多肽)的表达栽体。可将CKSRP编码核^隆入此类表达栽体，而使融合部分按阅读框架连接于CKSRP,除了此处描述的CKSRP的片段和融合多肽之外，本发明还包括植物中天然CKSRP和CKSRP编码核酸的同源物和类似物.此处定义"同源物"为分别具有相似或"相同"核苷酸或M酸序列的两个核酸或多肽。同源物包括此处l^定义的CKSRP等位基因变体、直系同源物、旁系同源物、激动剂和拮抗剂.术语"同源物"还包括由于遗传密码简并而不同于SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17以及SEQIDNO:19(及其部分)所示核苷酸序列之一的核酸分子，因此与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核苷酸序列编码相同的CKSRP。例如，SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的同源物描述于SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74和SEQIDNO:76。此处所用的"天然存在的，，CKSRP,是指天然存在的CKSRP**,列。优选天然存在的CKSRP含有选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20的^J^,列.CKSRP的激动剂可保留与CKSRP的生物活性iW^目同或CKSRP的生物活性的某一亚型.CKSRP的拮抗剂能够抑制CKSRP天然存在形式的一种或多种活性.例如，CKSRP拮抗剂能竟争性结合于包括CKSRP在内的细胞膜成分代谢^l^应的下游或上游成员，或结合于介导化合物跨此类膜转运的CKSRP，从而阻断转位的发生。基于对应CKSRPcDNA的天然等位基因变体和同源物、直系同源物、旁系同源物的核酸分子与此处所述的小立碗藓、酿酒酵母或欧洲油菜CKSRP核酸的同一性，可以使用CKSRPcDNA或其部分作为杂交探针，在严格杂交条件下根据标准杂交技术分离这些核酸分子。在备选的实施方案中，可通过筛选CKSRP突变体如平截突变体组合文库中CKSRP激动剂或拮抗剂活性，鉴定CKSRP同源物。在一个实施方案中，通过核酸水平的组合诱变产生CKSRP变体的多样性文库，该文库由多样性基因文库编码。可通过如将合成的寡核苷酸混合物酶连接入基因序列而产生CKSRP变体的多样性文库，从而使潜在CKSRP序列的简并组能以个体多JI^达，或以一组含有CKSRP序列组的更大的融合多肽(如噬菌体展示)形式表达。有多种方法可用于从简并寡核苷酸序列中产生潜在的CKSRP同源物。可在自动DNA分析仪中实施简并基因序列的化学合成，然后将合成基因连接入合适的表达载体。使用简并基因使得在同一混合物内能提供所有编码所需潜在CKSRP序列组的序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域^^(见如Narang，S.A.，1983，Tetrahedron39:3;Itakura等人，1984，An肌.Rev.Bioche肌53:323;Itakura等人，1984，Science198:1056;Ike等人，1983，NucleicAcidRes.11:477)。此外，CKSRP编码区片段文库可用于产生CKSRP片段的多样性群体以用于筛选及l^选择CKSRP同源物。在一个实施方案中，通过在每分子仅发生约一次缺刻的务泮下用核酶处理CKSRP编码序列的双链PCR片段、变性双链DNA、复性DNA以形成双链DNA(其可包括来自不同缺刻产物的正义/反义对)、利用Sl核酶处理从重新形成的二聚体中除去单链部分，并将产生的片段文库连接A^达栽体，来产生编码序列片段的文库.通过这一方法可以得到编码CKSRP中不同大小的N-末端、C-末端以及内部片段的表iiJ:库。若干用于筛选通过点突变或平截产生的组合文库基因产物的技术，以及用于筛选cDNA文库中具有选定性质的基因产物的技术为本领域公知。此类技术适用于快速筛选通过组^l"变CKSRP同源物产生的基因文库.使用最为广泛的可适用于高通量分析的筛选大型基因文库的技术，一般包括将基因文库克隆入可复制的表达栽体、利用产生的栽体文库转化合适细表iiia^^基因。循环集成诱变(Recursiveensemblemutagenesis,REM)为提高文库中功能性突变体频率的新技术，可与筛选测定联合使用以鉴定CKSRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS89:7811-7815;Delgrave等人1993，PolypeptideEngineering6(3):327-331).在另一实施方案中，可通过本领域公知的方法运用基于细胞的测定分析多样性CKSRP文库.本发明还提供了鉴定新CKSRP的方法，包括(a)引起对此处所述的CKSRP或其片段的特异性抗体应答；(b)利用该抗体筛选假定的CKSRP材料，其中抗体与材料的特异性结合提示可能存在新的CKSRP;以及(c)对照已知CKSRP分析结合材料，以确定其为新的CKSRP。如上所述，本发明包括CKSRP及其同源物。为确定两个M酸序列之间的序列同一性百分比(例如序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20之一及其突变型)，以可供最佳比较的方式比对序列(如可向某一多肽序列中引入空档以达到与另一多肽或核酸的最佳比对)。然后比较对应M酸位点上的氨基酸残基。当一个序列(如序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQlDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20之一)中某一位点上的氨基酸戎基与另一序列(如序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20的突变型)中相应位点的氨基酸^J^相同，则这两个分子在该位点上是一致的.在两个核酸序列间可进行同类比较。两序列间的序列同一性百分比为两序列共有相同位点数目的函数(即序列同一性百分比=相同位点数目/总位点数xl00)。优选本发明中分离的氨基酸同源物与核心酪蛋白激酶结构域的同一性至少为约50-60%，优选至少约60-70%，更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%，最优选至少约96%、97%、98%、99%或更大，其中核心酪蛋白激酶结构域含有SEQIDNO:2的残基2-304、SEQIDNO:4的絲77-368、SEQIDNO:6的残基2-294、SEQIDNO:8的絲77-368、SEQIDNO:10的残基77-336、SEQIDNO:12的残基1-296、SEQIDNO:14的残基1-296、SEQIDNO:16的残基5-300、SEQIDNO:18的絲1-295，或SEQIDNO:20的残基25-327所示的M酸序列.在另一实施方案中，本发明分离的氨基酸同源物由SEQIDNO:l中4至912位核苷酸、SEQIDNO:3中229至1104位核苷酸、SEQIDNO:5中4至882位核苷酸、SEQIDNO:7中229至1104位核苷酸、SEQIDNO:9中229至1008位核苷酸、SEQIDNO:ll中1至888位核苷酸、SEQIDNO:13中1至888位核苷酸、SEQIDNO:15中13至卯0位核普酸、SEQIDNO:17中1至885位核苷酸，或SEQIDNO:19中73至981位核苷酸定义的核酸编码。酪蛋白激酶I蛋白质家族的成员具有多变的N-末端和C-末端延伸。N-末端负责底物识别而C-末端区域对与底物的相互作用有重要作用，对于介导通过自磷酸化实现的调节也很重要(Gross和Anderson,CellSignal199810:699-711;Graves和Roach,JBiolChem1995270:21689-21694)。Orf760M紗列(SEQIDNO:10)含有两个在其他酪蛋白激酶I蛋白质中没有的插入，跨越位点37至53的17个氨基酸以及跨越位点165至180的16个氨基酸。这些新插入的存在对于过量表达Orf760的转基因系的功能和随后的表型可能很重要。酪蛋白激酶I蛋白质通过自磷酸化C-末端丝氨酸和苏氨酸残基调节自身活性(Graves和RoachJBiolChem1995270:21689-21694).图5中的比对表明在同一性比对约525个M酸之后，发现C-末端区域存在于Orf760、EST263和EST289中，而在EST142和EST194则缺失，然而，与Orf760、EST263和EST289不同，如图5比对所示，EST142和EST194均含有约72个氨基酸的N-末端区域。这些N-末端和C-末端区域存在与否定义了至少六类作用于胁迫应答的酪蛋白激酶I蛋白质。N-末端区域，或C-末端区域，或核心激酶结构域，或核心激酶结构域与不同或同源的N-末端和/或C-末端延伸区域的组合或定点诱变可用于改变一致的自磷酸化位点，以产生更好的农艺表型.例如，嵌合或融合多肽可含有与图5所示的^核心激酶结构域融合，或与图5所示的任何C-末端结构域融合，或与图5所示任何多肽的核心激酶结构域和C-末端结构域融合的EST1421-72位残基(SEQIDNO:8的N-末端区域).在另一实施方案中，EST289的295-473位g(SEQIDNO:6的C-末端区域)可与图5所示的任意多肽的核心激酶结构域，或图5所示的任意N-末端结构域，或图5所示的任意多肽的核心激酶和N-末端结构域组合，以产生赋予更好农艺表型的嵌合或融合多肽。在另一实施方案中，本发明包括的分离的氨基酸同源物与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20所示的全M酸序列间的同一性，至少为约50-60%,优选至少约60-70%，更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-卯％或卯-95%，最优选至少为约96%、97%、98%、99%或更高。例如，SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20JL^酸序列的同源物描述于SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75和SEQIDNO:77。在另一实施方案中，本发明包括的分离的氨基酸同源物与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19所示核酸序列编码的全氨基酸序列，或与如SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQH)NO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74或SEQIDNO:76所示的其同源物间的同一性，至少为约50-60%,优选至少约60-70%，更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%,最优选至少为约96%、97%、98%、99%或更高.在其他实施方案中，CKSRP氨基酸同源物与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQEDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQEDNO:18、SEQIDNO:20的序列同一性，或与SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQH)NO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75和SEQIDNO:77所述的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQH)NO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20M酸序列同源物的序列同一性，至少为15个连续氣基酸残基，更优选至少为25个连续的氨基酸残基，最优选为至少35个连续氨基酸残基。在另一实施方案中，本发明中分离的核酸同源物包含的核苷酸序列，与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核酸序列，或与>^有至少60个其连续核苷酸的部分间的同一性至少为40-60%，优选至少为约60-70%，更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%，甚至更优选至少约95%、96%、97%、98%、99%或更高.优选的核苷酸序列比軟长度为至少75个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，而最优选为编码区全长。甚至更优选核酸同源物编码的蛋白质与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQH)NO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20在图5和图7所示的中央激酶结构域同源.还优选本发明分离的核酸同源物编码的CKSRP或其部分与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20M酸序列的同一性至少为70y。，且作为植物应答环境胁迫的调节物作用。在更优选的实施方案中，核酸同源物在植物中的过量表达增强了该植物对环境胁迫的耐受性.在更优选的实施方案中，核酸同源物编码作为胳蛋白激酶作用的CKSRP。在本发明中，利用VectorNTI6.0(PC)软件包(InforMax，7600WisconsinAve.，Bethesda，MD20814)确定两个核酸或多肽序列间的序列同一性百分比。使用空位开放罚分15和空位拓展罚分6.66确定两核酸之间的同一性百分比。使用空位开放罚分10和空位拓展罚分0.1确定两个多肽间的同一性百分比。所有其他参数均设置为默认设置。为进行多重比对(聚类W运算法则)，blosum62矩阵的空位开放罚分为10，而空位拓展罚分为0.05。应当注意当确定DNA序列和RNA序列间的序列同一性时，胸本发明另一方面提供了分离的核酸，其包含的多核苷酸在严4M^件下与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的多核苷酸杂交。更具体而言，本发明中分离的核酸分子长度为至少15个核苷酸，并在严格务降下与^^有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核苷酸序列的核酸分子杂交。在其他实施方案中，核酸长度至少为30、50、100、250或更多个核苷酸。优选本发明中分离的核酸同源物包括在高度严^^ff下与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列，且作为植物中胁迫耐受性调节物作用.在更优选的实施方案中，分离核酸同源物在植物中的过量表达增强了植物对环境胁迫的耐受性.在甚至更优选的实施方案中，分离核酸同源物编码作用如膝蛋白激酶的CKSRP。此处所用的涉及DNA与DNA印迹杂交的术语"严M件"，是指在60oC下，10xDenhart杂交溶液、6xSSC、0.5%SDS和100ng/ml变性鲑精DNA中杂交过夜。依次在3xSSC/0.1%SDS，随后在lxSSC/0.1%SDS，最后在0.1xSSC/0.iy。SDS中于62。C下洗涤印迹，每次30分钟。在优选的实施方案中短语"高度严*件"也用于此处，是指在6xSSC溶液、65。C下杂交过夜.在另一实施方案中，"高度严格条件"是指在65。C下，10xDenhart杂交溶液、6xSSC、0.5%SDS和100pg/ml变性鲑精DNA中杂交过夜.依次在3xSSC/0.1%SDS，随后在lxSSC/0.1。/。SDS，最后在0.1xSSC/0.1%SDS中于65。C洗涤印迹，每次30分钟。核酸杂交的方法见于Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284;CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章，Ausubel等人编辑，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork,1995;以及Tijssen，1993，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology:HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第2章，Elsevier,NewYork,1993。优选本发明中分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子，其在严格或高度严;^ff下与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19序列杂交。此处所用的"天然存在"的核酸分子，是指具有天然存在核苷酸序列(如编码天然多肽)的RNA或DNA分子。在一个实施方案中，该核酸编码天然存在的小立碗藓CKSRP、酿酒酵母CKSRP或欧洲油菜CKSRP。利用上述方法和其他本领域技术人员已知的方法，本领域普通技术人员能分离CKSRP的同源物，其包bSEQBDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20所示的絲紗列.此类同源物说明见如SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75和SEQIDNO:77.表A为基因ID与序列表中SEQIDNO的对照。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>这些同源物的一种亚型为等位基因变体.此处所用的术语"等位基因变体"是指含有导致CKSRP**酸序列改变且存在于自然种群中(如植物物种或品种)的多态性的核苷酸序列.此类天然等位基因变体一般会造成1-5%的CKSRP核酸差异。通过在多种不同植物中测序目标核酸的序列能鉴定等位基因变体，利用杂交探针可容易地鉴定那些植物中相同的CKSRP基因座.任意及所有由天然等位变异造成且不改变CKSRP功能活性的此类CKSRP的核酸变体及产生的狄酸多态性或变异性，均包括在本发明范围内。此外，编码相同或其他物种CKSRP的核酸分子如CKSRP类似物、直系同源物和旁系同源物，均在本发明范围内。此处所用的术语"类似物"，是指具有相同或相似功能，但在非相关生物中独立进化而来的两个核酸，此处所用的术语"直系同源物"是指来自不同物种<&#>据物种形成由共同祖先基因进化而来的两个核酸。通常直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。也用于此处的术语"旁系同源物"是指通过基因组内重复而相关的两个核酸。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能相关(Tatusov，R丄.等人，1997，Science278(5338):631-637)。天然CKSRP的类似物、直系同源物和旁系同源物可由于翻译后修饰、M酸序列不同或两者，而与天然CKSRP不同。翻译后修饰包括多肽的体内和体外化学衍生作用，如乙跣化、羧化、磷酸化或糖基化，且此类修饰发生于多肽合成或加工时或用分离的修饰酶处理后。具体而言，本发明的直系同源物一般与天然存在CKSRPM酸序列的所有或部分的序列同一性至少为80-85%、更优逸85-90%或卯-95%、最优选95%、96%、97%、98%或甚至99%或100%，且具有类似于CKSRP的功能。优选本发明的CKSRP直系同源物作用如植物中环境胁迫应答的调节物和/或作用如酪蛋白激酶，更优选CKSRP直系同源物增强了植物的胁迫耐受性。在一个实施方案中，CKSRP直系同代谢的能力.除了种群中可能存在的天然存在的CKSRP序列变体外，技术人员还知道可通过突变将改变导入SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的核苷酸序列中，从而改变编码CKSRP的A^,列而不影响CKSRP的功能活性，例如，可在SEQIDNO:l、SEQH)NO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19序列中实施核苷酸置换而引发"非必需，，氨基酸残基处的氛基酸置换，"非必需"M酸残基为可从CKSRP的野生型序列中改变却不会影响所述CKSRP活性的氨基酸残基，而"必需"氨基酸^为CKSRP活性所必需。然而，其他氨基酸残基(如在那些具CKRSP活性的结构域中非保守或仅半保守的M酸残基)可能对活性并非必需，因此可能可以改变而不会影响CKSRP活性.因此，本发明的另一方面涉及编码CKSRP的核酸分子，其含有对CKSRP活性非必需的氛基酸残基改变。此类CKSRP的M酸序列不同于在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中含有的序列，但仍保留了至少一种此处所述的CKSRP活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，其中多肽中含有的^^酸序列与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲,列的中央蛋白激酶区至少约50%的同一性。优选由该核酸分子编码的多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的JLfc酸序列的中央蛋白激酶区至少约50-60%的同一性，更优选与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQEDNO:20之一的M酸序列的中央蛋白激酶区至少约60-70%的同一性，甚至更优选与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQID]VO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲妙列的中央蛋白激酶区至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%的同一性，最优选与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQH)NO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲紗列的中央蛋白激酶区至少约96%、97%、98%或99%的同一性。在另一实施方案中，核酸分子编码的多肽与SEQH)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲紗列至少约50-60%的同一性，更优选与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18200580046694.1说明书第28/79页或SEQIDNO:20之一的Jl^酸序列至少约60-70%的同一性，甚至更优选与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲酸序列至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-卯％或90-95%的同一性，最优选与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的^Jl,列至少约96%、97%、98%或99%的同一性。本发明优选的CKSRP同源物优选参与植物的胁迫耐受性应答，或更具体而言参与植物中涉^J^迫耐受性应答的多肽的转录，和/或作用如酪蛋白激酶。分别向SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的核苷酸序列之一引入一个或多个核普酸置换、添加或缺失，从而向编码多肽中引入一个或多个MM换、添加或缺失，能产生分离的核酸分子，所迷核酸分子编码的CKSRP与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQD)NO:18、SEQIDNO:20中某一多M列具有序列同一性。可通过标准技术如定点诱变和PCR介导诱变，向SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:S、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19序列之一引入突变.优i^fr—个或多个预测非必需的氨基酸残基处进行保守性M酸置换。"保守性氨基酸置换，，即用具有相似侧链的氨基酸^J^^R^氨基酸残基。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸瓶基家族。这些家族包括具不带电极性侧链(如甘氨酸、天冬跣胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、^分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、^酸)、亮氨酸)以及芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选以同一侧链家族中的另一M酸^^取代CKSRP中的预测非必需氨基酸残基。或者在另一实施方案中，可通过如饱和诱变向全长或部分的CKSRP编码序列中随机引入突变，筛选所产生突变体中此处所述的CKSRP活性，以鉴定保留CKSRP活性的突变体。诱变SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的序列之一后，可重组表达编码多肽并通过如实施例7所述分析表达该多肽植物的胁迫耐受性确定该多肽的活性。此外可产生最优化的CKSRP核酸。优选最优化的CKSRP核酸编码的CKSRP与磷酸基团结合，和/或调节植物对环境胁迫的耐受性，更优选当其在植物中过量表达时增强植物对环境胁迫的耐受性，此处所用的术语"最优化的，，是指经遗传工程操作以提高其在给定植物或动物中表达的核酸.为提供植物最优化的CKSRP核酸，可修饰该基因的DNA序列以使其l)含有高表达的植物基因优选的密码子；2)核苷酸4S^成中A+T的含量与植物中广泛存在者一致；3)形成植物起始序列；或4)消除导致RNA不稳定、不恰当B苷化、降解和终止的序列，或那些形成二级结构发卡或RNA剪切位点的序列。利用一J&植物或特定植物中密码子使用的频率分布，能增加CKSRP核酸的表达.最优化植物中核M达的方法可见于EPA0359472;EPA0385962;PCT申请号WO91/16432;美国专利号5，380，831;美国专利号5,436^91;Perlack等、1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328;以及Murray等人，1989，NucleicAcidsRes.17:477-498.此处所用的"优选密码子使用频率"，是指特定宿主细胞所表现出来的指定确定氨基酸的核苷酸密码子的使用偏好.将基因中密码子出现的次数除以基因中指定同一氨基酸的所有密码子的总出现次数，可确定该基因中该密码子的使用频率。与之类似，通过平均化优选密码子在大量宿主细胞表达基因中的使用频率，能计算出宿主细胞中优选密码子使用频率。优选该分析限于宿主细胞高度表达的基因。合成基因中优选密码子使用频率与宿主细胞所用频率的百分比偏差计算如下首先通it^取所有密码子的平均偏差，确定单个密码子使用频率与宿主细胞使用频率间的百分比偏差。如此处定义，该计算包括特殊密码子(即ATG和TGG)。一般而言，通过等式计算最佳基因的密码子使用与宿主细胞的务体平均偏差lA-n-lZXn-YnXn乘以100Z，其中Xn-宿主细胞中密码子n的使用频率；Yn4成基因中密码子n的使用频率；n代表指定一种氨基酸的密码子；密码子总数为Z,密码子使用频率的总体偏差A，对所有氨基酸而言优选小于约25%，更优选小于约10%.因此，可以最优化CKSRP核酸使其密码子使用的分布频率相对于那些高度表^物基因的偏差优选不大于25%，更优选不大于10%。此外，应当考虑筒并的第三威基的G+C含量百分比(单子叶植物在此位点处似乎更偏好G+C,而双子叶植物则不)。狄现XCG(其中X为A、T、C或G)核苷酸为双子叶植物最不优选的密码子，而单子叶和双子叶植物都不使用XTA密码子。本发明的最优化CKSRP核酸也优选具有与所选宿主植物非常接近的CG和TA双联体避免指数(doubletavoidanceindices)(例如小立碗藓、欧洲油菜、大豆(((vciVie挑似)或稻(Oi^fl更优选这些指数与宿主间的偏差不大于约10-15%。除了编码上述CKSRP的核酸分子外，本发明的另一方面涉及分离的与其反义的核酸分子.反义多核苷酸能通过特异性结合于靶多核苷酸并干扰把多核苷酸的转录、剪切、转运、翻译和/或稳定性，抑制靶多核苷酸的基因表达。现有技术已描述了将反义多核普酸把定于染色体DNA、初级RNA转录物或加工后mRNA的方法.优选的靶区域包括剪切位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子以及开放阅读框内的其他序列.本发明中的术语"反义"，是指含有与db^或部分基因、初级转录物或加工后mRNA的互补性足以千扰内源性基因表达的多核普酸的核酸。"互补"多核苷酸为那些能根据标准Watson-Crick互补法则进行碱基配对的多核苷酸，具体而言，嘌呤与嘧咬进行碱基配对以形成鸟噪呤配对胞嘧啶(G:C)和腺嘌呤配对DNA中胸腺嘧咬(A:T),或腺噪呤配对RNA中尿嘧啶(A:U)的组合。应当理解两个多核苷酸即使彼此不完全互补也可相互杂交，只要彼此间有至少一个区域基本互补。术语"反义核酸，，包括单链RNA以及能转录产生反义RNA的双链DNA表达盒。"活性，，反义核酸为能与初级转录物或编码多肽的mRNA选择性杂交的反义RNA分子，所述多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20的多肽具有至少80%的序列同一性。反义核酸可与整个CKSRP编码链互补，或仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码CKSRP核苷酸序列编码链的"编码区"反义。术语"编码区"指含有能翻译为氨基酸戎基的密码子的核苷酸序列区域。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码CKSRP核苷酸序列编码链的"非编码区，，反义。术语"非编码区"指与编码区侧接而不会被翻译为絲酸的5，和3，序列(即所谓的5，和3，非翻译区).反义核酸分子可与CKSRPmRNA的整个编码区互补，但更优选为仅与CKSRPmRNA的编码或非编码区部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可互补于CKSRPmRNA翻#^始位点周围的区域，反义寡核苷酸的长度可为如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，一般而言，本发明的反义分子含有RNA,其与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19,或编码SEQH)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽的多核苷酸的至少14个连续核苷酸具有60-100%的序列同一性。优选的序列同一性为至少70%，更优选至少75%、80%、85%、90%、95%或98%，最优选99%,利用本领域已知的操作使用化学合成和酶连接反应可构建本发明的反义核酸。例如，可利用天然存在的核苷酸或经多种修饰的核苷酸化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，设计所述修饰核苷酸以提高分子的生物稳定性或提高反义与正义核酸之间形成二聚体的物理稳定性，例如可4吏用硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-硪尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-巯尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嗜啶、/3-D-半乳糖苷Q核苷OS-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟噪呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟噪呤、2-甲基腺噤呤、2-甲基鸟噪呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺苷、7-甲基鸟噤呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲IL^氨甲基-2^克尿嘧啶、0-D-甘露糖Q核苷(j8-D-maimosylqueosine)、5，-甲氧基羧甲M嘧啶、5-甲Hi^嘧啶、2-甲A^代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧吱-5-氣乙酸(v)、wybutoxosine、^^嘧咬、Q核苷、2~^1胞嘧啶、5-甲基-2^L^嘧啶、2-硫尿嘧咬、4-M嘧啶、5-甲*^嘧啶、尿嘧咬-5-氣乙酸甲酯、尿嘧玟-5-氧乙酸(v)、5-甲基-24泉嘧啶、3-(3^J^3-N-2省丙基)尿嘧咬、(acp3)w和2，6-二氨基噪呤，或者可利用表达栽体生物产生反义核酸，所^达栽体中以反义方向亚克隆入核酸(即由插入核酸转录的RNA与目标把核酸间为反义方向，见下文进一步详述)。在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子为O"异头核酸分子.c^异头核酸分子与互补RNA形成特定的双链杂交物，其中与通常^-单位不同的是链彼此平行(Gaultier等人，1987，NucleicAdds.Re&15:6625-6641),反义核酸分子也可含有2，-邻甲l^糖核苷酸(Inoue等人1987，NucleicAcidsRes.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，1987，FEBSLett.215:327-330)。一般向细胞逸用或原位产生本发明的反义核酸分子，以使其能杂交或结合于编码CKSRP的细胞mRNA和/或基因组DNA，从而通过如抑制转录和/或翻译抑制多肽的表达。杂交可为通过常规核苷酸互补形成稳定的二聚体，或如当反义核酸分子结合于DNA二聚体时通过双螺旋大沟内的特异性相互作用而形成。可以通过如将反义核酸分子连接于结合细M面受体或抗原的肽或抗体来修饰反义分子，从而使其可特异性结合于所选择细胞表面表达的受体或抗原。也可利用此处所述的载体将反义核酸分子输送至细胞。为达到细胞内反义分子的足够浓度，优选反义核酸分子处于强原核、病毒或真核(包括植物)启动子控制下的栽体构建体。除了反义多核苷酸外，核酶、正义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)可用于减少CKSRP多肽的表达。此处所用的术语"核酶，，是指基于RNA的催化酶，其具有核酶活性能裂解含有与其互补区的单链核酸如mRNA.核酶(例如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334:585-591描述的锤头核酶)可用于催化性裂解CKSRPmRNA转录物,从而抑制CKSRPmRNA的翻译。可基于此处所述的CKSRPcDNA的核,列(即SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19),或基于构建本发明教导方法分离的异源性序列，设计对该CKSRP编码的核酸具有特异性的核酶.例如，可构建四膜虫(refrfl^y附幼a)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与CKSRP编码mRNA中将裂解的核苷酸序列互补。见如Cech等人的美国专利号4,987,071和5,116,742。或者，可利用CKSRPmRNA从RNA分子集合中选择具有特异性核酶活性的催化性RNA。见如Bartel，D.和Szostal^J.W.，1993，Science261:1411-1418,在优选实施方案中，核酶含有具有至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸、更优选为7或8个核苷酸的部分，其与靶RNA的部分间互补性为100%.制备核酶的方法为^域技^A员所公知.见如美国专利号6,025,167;5,773,260和5，496，698。此处所用的术语"dsRNA"是指包含两条RNA链的RNA杂化物.dsRNA可为线性或环状结构.在优选实施方案中，dsRNA特异于多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中的多肽，或与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽之一在中央蛋白激酶结构域具有至少80%序列同一性的多肽。杂交RNA可基本上或完全互补。"基本互补"是指当如上述用BLAST程序最佳比对两个杂交RNA时，杂交部分至少95%互补。优选的dsRNA长度至少为100M对。一般而言，杂交RNA的长度相同而不具有突出的5，或3，末端且没有空位.然而，^^发明方法可使用5，或3，突出端多达100个核苷酸的dsRNA。dsRNA可^^有核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物如2，-0-甲基核糖基残基或其组合。见如美国专利号4，130，641和4，024，222。dsRNA多核糖肌苷酸多核糖胞嘧咬核苷酸描述于美国专利号4,283,393。生产和使用dsDNA的方法为^5域公知。一种方法包括在体内或在体外单个反应混合物中同时转录两条互补DNA链。见如美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，可直接通过标准转化方法向植物或植物细胞中导入dsRNA。或者通过转录两条互补RNA在植物细胞中表达dsRNA.抑制内源基因表达的其他方法如三螺旋形成(Moser等人，1987，Science238:645-650，和Cooney等人1988，Science241:456459)和共抑制(NapoU等人19卯，ThePlantCell2:279-289)为本领域所公知。部分和全长cDNA已被用于内源性植物基因的共抑制.见如美国专利号4,801,340、5,034,323、5，231，020和5，283，184;VanderKroll等人1外0，ThePlantCell2:291-299;Smith等人1990，Mol.Gen.Genetics224:477481;和Napoli等人19卯，ThePlantCell2:279-289.对于正义抑制而言，引入正义多核苷酸会阻断相应耗基因的转录.正义多核苷酸与^i物基因或RNA间具有至少65°/。的序列同一性。优选同一性百分比为至少80%、90%、95%或更多，引入的正义多核苷酸相对于把基因或转录物并不必为全长，优选的正义多核苷酸与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19中至少IOO个连续氨基酸具有至少65%的序列同一性。同一性区域可包含内含子和/或外显子以及非翻译区。引入的正义多核苷酸可瞬时存在于植物细胞中，或稳定^入植物染色体或染色体外复制子。或者通过乾定与CKSRP核苷酸序列的调节区(如CKSRP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列形成可阻断靶细胞中CKSRP基因转录的三螺旋结构，来抑制CKSRP基因的表达。主要见Helene，C.，1991，AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.等人，1992,Ann.N.Y.Acad.ScL660:27-36;以及Maher，L丄，1992，Bioassays14(12):807-15。除上述CKSRP核酸和多肽外，本发明还涉及这些连接于部分的核酸和多肽.这些部分包括但不仅限于，检测部分、杂交部分、纯化部分、运输部分、反应部分、结^P分等。与部分相连的一类典型核酸为探针和引物。探针和引物一般包括^分离的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含可在严*件下与至少约12、优选约25、更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区；所述连续核苷酸来自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQH)NO:19所列序列之一的正义链；或SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQD)NO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所列序列之一的反义序列；或其天然突变体。基于SEQH)NO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQH)NO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19核苷酸序列的引物可用于PCR反应克隆CKSRP同源物，基于CKSRP核苷酸序列的探针可用于检测编码相同或基本相同多肽的转录物或基因组序列。在优选实施方案中，探针还包含连接于其上的标记基团，例如标记基团可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作基因组标记测试试剂盒的部分，通过如测量细胞样品中CKSRP编码核酸的水平，如检测CKSRPmRNA水平或确定基因組CKSRP基因是否已突变或缺失，来鉴定表达CKSRP的细胞.具体而言，确定基因转录物水平(可用于翻译为基因产物的mRNA量的指标)的有用方法，是实施Northern印迹(参考见如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)。来自Northern印迹的信息至少部分说明了转化基因的转录水平。可通过均为本领域4^P的若干方法从细胞、组织或器官制备总细胞RNA，如Bormaim,E.R.等人，1992，Mol.Microbiol.6:317-326所述。为评估是否存在翻译自该mRNA的多肽或其相对量，可使用标准技术如Western印迹。这些技术为本领域普通技术人员^p(见如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork).本发明还提供了分离的含有上述CKSRP核酸的重组表达载体，其中该栽体在宿主细胞内的表达导致其对环境胁迫的耐受性相对于该宿主细胞的野生型增强.此处所用的术语"载体"，指能够转运另一与之相连的核酸的核酸分子。一类栽体为"质粒"，是指可以连入额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种载体为病毒栽体，其中额外的DNA片段可连接于病毒基因组.某些栽体能在其导入的宿主细胞中自发复制(如具有细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物栽体).其他栽体(如非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组，因而随宿主基因组复制，此夕卜，某些栽体能指导与其有效连接的基因的表达.此处称这种载体为"表达栽体"。一般而言，可用于重组DNA技术的表达栽体通常为质粒形式。在本说明中，"质粒，，和"栽体"可互换使用，因为质粒是最常用的栽体形式.然而，本发明旨在包括能发挥相同作用的此类其他形式的表达栽体，如病毒栽体(如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)。本发明的重组表达栽体中含有以适于在宿主细胞中表达的形式存在的本发明的核酸，即该重组表达载体包含一个或多个基于用于表达的宿主细胞选择的、与待表达核酸序列有效连接的调控序列。此处所用的关于重組表达栽体的"有效连接"，是指目标核苷,列连接于调控序列的方式使该核苷酸序列得以表达(例如在体外转录/翻译体系，或在导入载体的宿主细胞内)。术语"调控序列，，包括启动子、增强子以及其他表达调控元件(例如多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于如Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)，以及Gruber和Crosby述于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick和Thompson编辑,第7章，89-108，CRCPress:BocaRaton，Florida,包括其中的参考文献。调控序列包括那些指导核苷酸序列在多种宿主细胞内组成型表达的序列，以及那些仅在某些宿主细胞或某些M下指导核苷,列表达的序列。本领域技术人员应当知道表达载体的设计取决于如待转化宿主细胞的选择、所需的多Jl^达水平等。可将本发明表达栽体导入宿主细胞，从而产生由此处所述核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽(如CKSRP、CKSRP的突变型、融合多肽等)。可设计本发明的重组表达栽体用于在原核或真核细胞中表达CKSRP,例如，CKSRP基因可表达于细菌细胞如谷氨酸棒杆菌(Cg/Mto加i'c"附)、昆虫细胞(利用杆状病毒表达栽体)、酵母以及其他真菌细胞(见Romanos，M.A.等人，1992，Foreigngeneexpressioninyeast:areview,Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M丄J.等人，1991，Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi(MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet和L丄.Lasure编辑,396-428页AcademicPress:SanDiego中)；以及vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.，1991,Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi(AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy，J.F.等人编辑，1-28页，CambridgeUniversityPress:Cambridge中))、藻类(Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1(3):239-251)、以下类型的纤毛虫全毛亚纲(HoIotrichia)、缘毛亚纲(Peritrichia)、旋唇亚纲(Spirotrichia)、吸管亚纲(Suctoria)、四膜虫(Tetrahymena)、草履虫(Paramecium)、豆形虫(Colpidium)、瞬膜虫(Glaucoma)、匙口虫(Platyophrya)、Potomacus、假康纤虫(Pseudocohnilembus)、'游"f卜虫(Euplotes)、Engelmaniella以及棘尾虫(Stylonychia)，特别是如PCT申请号WO98/01572所述的转化方法形成的带载体的浮萍棘尾虫CS，0^w^cMife附"fle)属，以及多细胞植物细胞(见Schmid仁R.和Willmitzer，L，1988，Highefficiency々^fl"m'i/挑fume/adews-mediatedtransformationofJra6/i/0/is&^ta/i'awaleafandcotyledonexplants，PlantCellRep.583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton，Florida,第6〃章，S.71-119(1993);F.RWhite,B.Jenes等人,TechniquesforGeneTransfer(TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编辑,128-43,AcademicPress:1993;Potrykus，1991，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42:205-225及其中引用的参考文献)，或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞进一步i寸论于Goeddel的GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress:SanDiego，CA(19卯)中。或者可在体外转录和翻译重組表达栽体，例如使用T7启动子调控序列及T7聚合酶。最常利用含有能指导融合或非融合多^达的组成型或诱导性启动子的栽体，实现多肽在原核生物中的表达。融合栽体向其中编码的多肽添加了若干氨基酸，通常加在重组多肽的4^末端，但也可加在其C-末端或融合于多肽的合适区域。此类融合栽体一般具有三个功能l)提高重組多肽的表达；2)提高重组多肽的溶解性；以及3)作为亲和纯化的配体协助重組多肽的纯化。通常在融合表达栽体中，向融^P分和重組多肽的连接处引入蛋白水解裂解位点，以在纯化融合多肽后将重组多肽与融^p分分离，此类酶及其关联识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶.""^融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S转移斷GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A融合于靶重组多肽的pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.，1988，Gene67:31>40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ).在一个实施方案中，将CKSRP的编码序列克隆入pGEX表达栽体以产生编码融合多肽的载体，从N-末端至C-末端包含GST-凝血酶裂解位点-X多肽。可以利用谷胱甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析法纯化融合多肽。可以通过凝血酶裂解融合多肽回收与GST去融合的重组CKSRP。合适的诱导型非融合大肠杆菌(Eco/i)表达栽体的实例包括，pTrc(Amann等人，1988，Gene69:301陽315)和pETlid(Studier等人，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)60-89)。pTrc栽体上把基因的表达取决于由杂交trp-lac融合启动子起始的宿主RNA聚合酶转录。pETlld栽体上乾基因的表达取决于由T7gnl0-lac融合启动子起始的共表达病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的转录。该病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，来自含有lacUV5启动子转录调控下的T7gnl基因的常驻7原噬菌体。最大化重组多Jl^达的策fl^t—是在蛋白水解裂解重组多肽能力受损的宿主细菌中表达多肽(Gottesman，S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)119-128)。另一策略在于改变插入表达栽体的核酸序列从而使每一氨基酸使用的单个密码子均为选用于表达的细菌如谷氨酸棒杆菌中优选使用者(Wada等人1992，NucleicAcidsRes.20:2111-2118)。通过标准DNA合成技术，能够如此改变本发明的核酸序列.在另一实施方案中，CKSRP表达栽体为酵母表达栽体.在酿酒酵母中表达的栽体实例包括pY印Secl(Baldari等人，1987，EMBOJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，l诉2，Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等Aj1987，Gene54:113-123)以及pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego，CA),适用于其他真菌(如丝状真菌)的用于构建栽体的栽体及方法，包^f述于vandenHondel，C.A.M.J丄&Punt，P丄，1991，"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi",在AppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdy等人编辑，1-28页，CambridgeUniversityPress:Cambridge中的那些，或者，可利用杆状病毒表达栽体在昆虫细胞中表达本发明的CKSRP,可用于在培养昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达多肽的杆状病毒栽体包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989，Virology170:31-39)。在另一实施方案中，利用哺乳动物表达栽体在哺乳动物细胞中表达本发明的CKSRP核酸。哺乳动物表达栽体的实例包括pCDM8(Seed,B.，1987，Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBOJ.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞时，通常由病毒调控元件调控表达栽体。例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他对原核和真核细胞均适用的表达系统，可见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.最新版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989的第16和17章。在另一实施方案中，重组哺乳动物表达栽体能指导核酸优选在某一特定细胞类型中的表达(例如使用組织特异性调控元件表达核酸)。组织特异性调控元件为本领域公知.合适组织特异性启动子的非限制性实例包括，白蛋白启动子(肝特异；Pinkert等人，1987，GenesDev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,1988，Adv.ImmimoL43:235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto和Ba附more，1989，EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人1983，Cell33:729-740;Queen和Baltimore,1983，Cell33:741-748)、神经元特异性启动子(如神经丝启动子；Byrne和Ruddle,1989，PNAS86:5473-5477)、舰特异性启动子(Edlund等人1985，Science230:912-916),以及乳腺特异性启动子(如乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请出版号264,166)。也包括发育调节启动子，如鼠hox启动子(Kessel和Gmss，1990，Science249:374-379)和胎多肽启动子(Campes和Tilghman,1989，GenesDev.3:537-546)。为稳定转染哺乳动物细胞，已知根据所用的表达栽体和转染技术，仅有小部分细胞可将外源DNA整合入其基因组.为了鉴定和选择这些^体，一般将编码可选择标记(如对抗生素或除草剂的抗性)的基因与目标基因一起引入宿主细胞。优选的可选择标记包括那些带有对药物如G418、潮霉素和甲氛蝶吟抗性的标记，或植物中那些带有对除草剂如草甘膦、草铵膦或咪唑啉酮抗性的标记.可以编码CKSRP的同一栽体将编码可选择标记的核酸分子引入宿主细胞，或可使用分开的栽体引入。可通过如除草剂选择鉴定稳定转染导入核酸分子的细胞(例如参入选择标记基因的细胞能够存活，而其他细胞死亡)。在本发明的优选实施方案中，CKSRP表达于植物和植物细胞中如单细胞植物细胞(如藻类)(见Falciatore等人,1999，MarineBiotechnology1(3):239-251及其参考文献)，以及高等植物细胞(如种子植物如农作物)。可通过任意方法将CKSRP"导入"植物细胞中，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染法等.本领域技术人员已知的转化方法之一是将开花植物浸入农杆菌04gf^fl""iVO溶液中，所述农杆菌中含有CKSRP核酸，然后育种转化配子.转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的其他合适方法可见于Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual.最新^ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY,1989)及其他实验室手册如MethodsinMolecularBiology,1995，44巻，々iv6acter/ii加protocols,Gartland和Davey编辑,HumanaPress,Totowa，NewJersey.由于生物和非生物胁迫耐受性为多种植物期望真备的性质，如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽和油菜、木薯、胡椒、向日葵和万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆某种、豌豆、苜蓿、灌生植物(咖啡、可可、茶)、柳某种、树(油棕榈、椰子树)、多年生草和牧草作物，这些作物植物也为本发明另一实施方案中优选的基因工程^t物。牧草作物包括但不仅限于小麦草(Wheatgrass)、鹋草(Canarygrass)、雀麦(Bromegrass)、披碱草(WildryeGrass)、蓝草(Bluegrass)，鸭茅草(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百l^l(BirdsfootTrefoil)、杂三叶(AlsikeClover)、红三叶(RedClover)和甜三叶草(SweetClover),在本发明的一个实施方案中，通#杆菌介导的基因转移将CKSRP转染入植物。可利用如GV3101(pMP卯)(Koncz和Schdl，1986，Mol.Gen-Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根瘤农杆菌(^gra6"cte"n挑加附e/fld柳s)菌抹实施农杆菌介导植物转化。可通过标准转化和再生技术实施转化(Deblaere等人，1994，Nucl.Acids.Res.13:4777-4788;Gelvin,StantonB.和Schilperoort，RobertA，PlantMolecularBiologyManual,第2版-Dordrecht:KluwerAcademicPubl.，1995.-inSect.,RingbucZentraleSignatur:BT11-PISBN0-7923-2731-4;GHck，BernardR.;Thompson,JohnE.，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,BocaRaton:CRCPress,1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如通过子叶或下胚轴转化来转化油菜籽(Moloney等人，1989，PlantCellReport8:238画242;DeBlock等人，1989，PlantPhysiol.91:694-701)。农杆菌和植物选择中的抗生素应用取决于用于转化的二元栽体和农杆菌菌株.通常利用卡那霉素为可选择植物标记来进行油菜#^择。利用如Mlynarova等人，1994，PlantCellReport13:282-285所述的技术可实施;Mf菌介导向亚麻的基因转移，此外，可利用如欧洲专利号0424047、美国专利号5，322，783、欧洲专利号0397687、美国专利号5，376，543,或美国专利号5，169，770所述的技术转化大豆.通过颗粒轰击、聚乙二醇介导DNA摄取、或通过碳化硅纤维技术可转化玉米(见如Freeling和Walbot"Themaizehandbook"SpringerVerlag:NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7).玉米转化的具体实例见于美国专利号5，990387，而小麦转化的具体实例见于PCT申请号WO93/07256.根据本发明，如导入的CKSRP参入非染色体的自发性复制子或整合入植物染色体中，则可稳定保留在植物细胞中.或者导入的CKSRP存在于染色体外非复制性栽体上，可能为瞬时表达或具有瞬时活性.在一个实施方案中，可产生CKSRPM入染色体的同源重组微生物，制^^有至少一部分导入缺失、添加或置换的CKSRP基因的栽体，从而改变(如功能性破坏)CKSRP基因。优选的CKSRP基因为小立碗藓、欧洲油菜、大豆或稻CKSRP基因，但也可为来自相关植物或甚至是来源于哺乳动物、酵母或昆虫的同源物。在一个实施方案中，i更计栽体使在同源重组时内源性CKSRP基因受到功能性破坏(即不再编码功能性多肽；也称为敲除栽体)。或者可设计载体以使同源重组后内源性CKSRP基因被突变或受到其他改变，但仍然能编码功能性多肽(例如改变上游调控区域从而改变内源性CKSRP的表达)。为通过同源重组产生点突变，可将DNA-RNA杂化物用于所谓嵌合修复术的技术(Cole-Strauss等人，1999，NucleicAcidsResearch27(5):1323-1330，以及Kmiec，1999，GeneTherapyAmericanScientist87(3):240-247)。小立碗藓的同源重組方法也为本领域公知并考虑用于此处。而在同源重組栽体中，CKSRP基因的改变部分在其5，和3，末端侧接CKSRP基因的另一核酸分子，从而使栽体携带的外源性CKSRP基因与内源性CKSRP基因间能在微生物或植物中发生同源重组。额外的侧翼CKSRP核酸分子具有足够长度以与内源性基因进行成功的同源重组.一般而言，载体中含有数百对^对甚至数千>^对的侧翼DNA(5，和3，末端均有)(见如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.，1987，Cell51:503中同源重组栽体的描述或Str邻p等/s1998，PNAS，95(8):4368-4373中基于cDNA的小立碗藓重组)。将栽体导入微生物或植物细胞中(例如通过聚乙二醇介导DNA)，通过本领域已知的技术选择其中导入的CKSRP基因与内源性CKSRP基因发生同源重组的细胞.在另一实施方案中，产生含有能调节导入基因表达的选择系统的重组微生物.例如，将CKSRP基因引入栽体并置于lac操纵子的调控之下，能使该CKSRP基因仅在IPTG存在时进行表达。此类调控体系为本领域不管是位于染色体外的非复制栽体中,还是位于染色体务^的栽体中，CKSRP多核苷酸都优选位于植物表达盒内.植物表达盒优选含有的能驱动基因在植物细胞中表达的调控序列，该序列为有效连接因而每一序列均可实现其自身功能，例如通过多B苷酸化信号终止转录.有效的多**苷酸化信号为那些来自根瘤农杆菌t-DNA的信号，如基因3，Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合酶(Gielen等人，1984，EMBOJ.3:835)或其功能性等效物，但所有其他在植物中具有功能活性的终止子也适用.由于植物基因表达经常不仅限于转录水平，植物表达盒中优选含有其他有效连接的序列如翻译增强子，如含有烟草花叶病毒中5，非翻译先导序列的能增强每RNA的多肽产率的过驱动序列(GalHe等人，1987，Nucl.AddsResearch15:8693-8711)。植物表达载体的实例详述于Becker,D.，Kemper,E.，Schell，J.和Masterson，R.，1992，Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197;以及Bevan，M.W.，1984，Binary/4g"o6flcteW"挑vectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants:于TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编辑，AcademicPress,1993，S.15-38中植物基因表达应当有效连接于合适的启动子，从而M因表达具有时序性、细胞特异性或组织特异性。可用于本发明表达盒的启动子包括能够起始植物细胞转录的任意启动子。此类启动子包括但不仅限于，可获自植物、植物病毒以及含有能在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌(及始06/M附))的启动子《启动子可为组成型、诱导型、发育阶段优选、细胞类型优选、組织优选或器官优选。组成型启动子在大部分情况下均有活性。组成型启动子的实例包括CaMV19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S启动子(Kay等人，1987，Science236:1299-1302),以及S印1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等、l外0，PlantCell2:163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛酰启动子(Christensen等Aj1989，PlantMolec.Biol.18:675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人1984，EMBOJ3:2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)、农杆菌T-DNA启动子(如甘露碱合酶、胭脂磁^合酶和章鱼碱合酶)、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。诱导型启动子优选在某些环境条件下具有活性，如有或无某一营养素或代谢物、热或冷、光、病原体攻击、乏氧条件等。例如油菜的hsp80启动子由热休克诱导；PPDK启动子由光诱导；烟草、拟南芥和玉米的PR-1启动子由病原体感染诱导；而Adhl启动子由低氧和冷胁迫诱导。诱导型启动子可有助于植物基因表达(综述见Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。化学诱导型启动子尤其适用于需要以时间特异性方式进行基因表达时。此类启动子的实例为#酸诱导型启动子(PCT申请号WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，1992，PlantJ.2:397-404)以及乙醇诱导型启动子(PCT申请号WO93/21334)。在本发明的优选实施方案中，诱导型启动子为胁迫诱导型启动子。在本发明中胁迫诱导型启动子优选在下述一种或多种胁迫下具有活性涉及盐、旱、温度、金属、化学物、病原体和氧化胁迫的次佳条件。胁迫诱导型启动子包括但不仅限于，Cor78(Chak等人2000，PIanta210:875-883;Hovath等人，1993，PlantPhysiol.103:1047-1053)、Corl5a(Artus等人，1996，PNAS93(23):13404-09)、Rci2A(Medina等人，2001，PlantPhysiol.125:1655-66;Nylander等人，2001,PlantMol.Biol.45:341-52;Navarre和Goffeau，2000，EMBOJ.19:2515-24;Capel等人，1997，PlantPhysiol,115:569-76)、Rd22(Xiong等人，2001，PlantCell13:2063~83;Abe等人，1997，PlantCell9:1859-68;Iwasaki等人，1995，Mol.Gen.Genet.247:391-8)、cDet6(Lang和Palve，1992，PlantMol.Biol.20:951-62)、ADH1(Hoeren等人，1998，Genetics149:479-90)、KATl(Nakamura等人，1995，PlantPhysiol.109:371-4)、KST1(MtiUer-R6ber等人，1995，EMBO14:2409-16)、Rhal(Terryn等人1993，PlantCell5:1761-9;Terryn等人1992，FEBSLett.299(3):287-90)、ARSK1(Atkinson等人1997，GenBank登录号L22302,以及PCT申请号WO97/20057)、PtxA(Plesch等人GenBank登录号X67427)、SbHRGP3(Ahn等人,1996，PlantCell8:1477-卯)、GH3(Liu等人，1994，PlantCell6:645-57)、病原体诱导型PRPl-基因启动子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22:361-366)、番茄热诱导型hsp80-启动子(美国专利号5187267)、马铃薯冷诱导型Of淀粉酶启动子(PCT申请号WO96/12814),或创伤i秀导型pinll启动子(欧洲专利号375091)。其他旱、冷和盐诱导型启动子的实例，如RD29A启动子，见Yamaguchi-Shinozalei等人，1993，Mol.Gen.Genet.236:331-340。发育阶段优选的启动子优选表达于发育的某些阶段。组织和器官优选启动子包括那些优选在某些组织或器官中表达的启动子，如叶、根、种子或木质部。组织优选和器官优选型启动子的实例包括但不仅限于果实优选型、胚珠优选型、雄性组织优选型、种子优选型、^优选型、块茎优选型、主茎优选型、果皮优选型、以及叶优选型、柱头优选型、花粉优选型、花药优选型、花瓣优选型、萼片优选型、花梗优选型、长角果优选型、茎优选型、根优选型启动子等。种子优选型启动子优选在种子发育和/或萌发时表达.例如，种子优选型启动子可为胚胎优选型、胚乳优选型以及种皮优选型，见Thompson等人1989，BioEssays10:108。种子优选型启动子的实例包括但不仅限于纤维素合酶(celA)、Ciml、y玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19Bl)等。其他合适的组织优选型或器官优选型启动子包括油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、蚕豆(Viciafaba)USP启动子(Baeimilein等人1991，Mol.Gen.Genet.225(3):459-67)、拟南芥油体蛋白启动子(PCT申请号WO98/45461)，菜豆(尸Aas卯/"sv"/g"f的菜豆蛋白启动子(美国专利号5，504，200)、油菜Bce4启动子(PCT申请号WO91/13980)，或豆球蛋白B4启动子(LeB4;Baeumlein等人，1992，PlantJournal,2(2):233-9),以及能在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中进行种子特异性表达。已知的合适启动子为大麦lpt2或lptl基因启动子(PCT申请号WO95/15389和PCT申请号WO95/23230),或如PCT申请号WO99/16890所i^(大麦大麦醇溶蛋白基因启动子、稻谷蛋白基因、稻^素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麦棵麦醇溶蛋白基因)，其他可用于本发明表达盒的启动子包括但不仅限于，主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、^-大豆球蛋白(/J-conglysin)启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆血凝素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、萎缩l、萎缩2和青铜色启动子、Zml3启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5，412，085和5，545，546)和SGB6启动子(美国专利号5，470，359)，以及合成或其他天然启动子。利用外源DNA结合结构域及应答元件(即非植物来源的DNA结合结构域)，能更灵活地调控植物中外源基因表达。此类外源DNA结合结构域的实例为LexADNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell43:729-736)。本发明还提供了含有以反义方向克隆入表达栽体的本发明CKSRPDNA分子的重组表达栽体。即DNA分子有效连接于调控序列，使与CKSRPmRNA反义的RNA分子得以表i^(通过DNA分子的转录).可选择有效连接于反义方向克隆入的核酸分子的调控序列，指导多种细胞类型中反义RNA分子的连续表达。例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列，以指导反义RNA的組成型、組织特异性或细胞类型特异性表达.反:ML达栽体的形式可为重组质粒、嗛粒或减毒病毒，其中反义核酸在高效调控区的调控下产生.通过导入栽体的细胞类型能确定调控区域的活性.有关利用反义基因调节基因表达的讨论，见Weintraub，H.等人，1986，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews-TrendsinGenetics,Vol.1(1)，和Mol等人，1990，FEBSLetters268:427430。本发明的另一方法涉及导入本发明重组表达栽体的宿主细胞.此处术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞，，可交互使用。应当理解此类术语不仅指特定的个体细胞，也指此类细胞的子代或潜在子代。由于连续传代中可发生因突变或环境影响而导致的某些修饰，此类子代实际上可能与亲代细胞不同，但仍然包括在此处所用术语的范围内。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如CKSRP可在细菌细胞如谷氨酸棒杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵母细胞(CHO)或COS细胞)，藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其他微生物如谷氨酸棒杆菌中表达。其他合适的宿主细胞为4^领域技术人员所z^,本发明的宿主细胞如培养中的原核或真核细胞，可用于产生(即表达)CKSRP。因此，本发明还提供利用本发明宿主细胞生产CKSRP的方法。在某一实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经导入了编码CKSRP的重组表达载体，或其中已经导入了编码野生型或改变的CKSRP基因)，直至产生CKSRP。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离CKSRP。本发明的另一方面涉及分离的CKSRP及其生物活性部分。"分离的"或"纯化的"多肽或其生物活性部分中不含有某些细胞材料(当用重组DNA技术产生时)，或化学前体或其他化学物(当化学合成时)。表述"基本不含有细胞材料"包括CKSRP的制备，其中多肽从其天然或重组产生细胞的某些细胞成分中分离出来.在某一实施方案中，表述"基本不含有细胞材料"包括含有少于约30%(干重)的非CKSRP材料(此处也称为"杂质多肽")的CKSRP制备物，更优选少于约20%的非CKSRP材料，更优选少于约10%的非CKSRP材料，最优选少于约5%的非CKSRP材料.当CKSRP或其生物活性部分为重組产生时，也优选其基本不含培养基，即培养基占多肽制备物量少于约20%，更优选少于约10%，最优选少于约5%.表述"基本不含化学前体或其他化学物"包括CKSRP制备物，其中多肽与涉及多肽合成的化学前体或其他化学物分离。在某一实施方案中，表述"基本不含化学前体或其他化学物"包括CKSRP制备物，其中含有少于约30%(千重)的化学前体或非CKSRP化学物，更优选少于约20%化学前体或非CKSRP化学物，更优选少于约10%化学前体或非CKSRP化学物，而最优逸少于约5%化学前体或非CKSRP化学物。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分中没有来自与CKSRP同一来源生物的杂质多肽。一般而言，此类多肽为通过重組表达所产生，例如在除小立碗藓或欧洲油菜以外的植物或微生物如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或真菌中表达小立碗藓或欧洲油菜CKSRP。此处所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、栽体以及宿主细胞可用于以下一种或多种方法鉴定小立碗藓、酿酒酵母或欧洲油菜;M目关生物；对与小立碗藓、酿酒酵母或欧洲油菜相关的生物进行基因组作图；鉴定和定位小立碗藓、酿酒酵母或欧洲油菜的目标序列；进化研究；确定功能必需的CKSRP区域；调节CKSRP活性；调节一种或多种细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜转运；调节胁迫抗性；以及调节CKSRP核酸的表达。在这些方法的一个实施方案中，CKSRP作用如有活性的钾转运蛋白。在这些方法的另一实施方案中，CKSRP作用如锌转运蛋白。藓类小立碗藓与其他藓类相关，如能在无光下生长的角齿藓(Omtofitow/wwp"Mws)。如角齿藓和小立碗藓的藓类在DNA序列和多肽水平上具有高度的序列同一性，因而可利用来自其他藓类或生物的探针对DNA分子进行外源性筛选，从而确保得到适于在第三种物种中异源筛选或功能性注释和预测基因功能的一致序列.因此，鉴定此类功能的能力具有显著意义，例如预测酵的底物特异性.此外，这些核酸分子能作为藓类基因組或相关生物基因组作图的参考点。本发明的CKSRP核酸分子具有多种用途.最重要的是本发明的核酸和M酸序列可用于转化植物，从而诱导出对胁迫如旱、高盐和冷的耐受性。因而本发明提供了由CKSRP核酸转化的转基因植物，其中该核M列在植物中的表达使其对环境胁迫的耐受性相对于该植物野生型品种增强.该转基因植物可为单子叶或双子叶植物.本发明还提供转基因植物可选自如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽和油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野^JJfe种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳某种、油棕榈、椰子树、禾草和牧草作物.因此，本发明提供了产生转基因的方法。具体而言，本发明描述了利用小立碗藓的PpCk-l、PpCK-2、PpCK-4和PpPK-4;酿酒酵母的ScCK-l;以及欧洲油菜的BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5的表达，来产生抗旱、抗盐和/或抗冷植物，此处证明将该策略用于拟南芥、油菜籽/油菜、大豆、玉米和小麦，但其应用不仅限于这些植物。因此，本发明提供了含有CKSRP的转基因植物，所述CKSRP如SEQIDNO:4定义的PpCK-l、SEQIDNO:6定义的PpCK-2、SEQIDNO:2定义的PpCK-4、SEQIDNO:8定义的PpPK-4、SEQIDNO:IO定义的ScCK-l、SEQIDNO:12定义的BnCK-l、SEQIDNO:14定义的BnCK-2、SEQIDNO:16定义的BnCK-3、SEQIDNO:18定义的BnCK-4，和SEQIDNO:20定义的BnCK-5，其中该植物对选自干旱、高盐或低温或高温中一种或多种的环境胁迫的耐受性增强。在优选实施方案中，该环境胁迫为干旱或低温。含有CKSRP编码核酸的植物(其中核酸在该植物中表达使其相对环境胁迫的耐受性对于该植物野生型品种增强)包括:(a)向植物细胞中导入含有CKSRP核酸的表达载体，且(b)AMi物细胞中产生相对于该植物野生型品种对环境胁迫耐受性增强的转基因植物.植物细胞包括但不仅限于，原生质体、配子产生细胞以及能再生为整个植物的细胞.此处所用的术语"转基因"，指>^有至少一种重组多肽的全部或部分的任意植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分，在许多情况下，全部或部分重组多肽稳定整合于染色体或稳定的染色体外元件，可连续传代.在优选实施方案中，CKSRP核酸编码含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽的蛋白质，本发明也提供了调控植物对环^J^迫耐受性的方法，包^节CKSRP编码核酸在植物中的表达.通过分别提高或减少CKSRP的表达，能增强或降低植物对环境胁迫的耐受性，优选通过提高CKSRP的表达增强植物对环境胁迫的耐受性.可通it^领域技术人员已知的任意方法修饰CKSRP的表达.这些提高CKSRP表达的方法可用于转基因或非转基因植物中.当植物为转基因时，可用含有任意上述CKSRP编码核酸的栽体转化该植物，或如可用指导天然CKSRP在植物中表达的启动子转化该植物。本发明提供此类启动子可为组织优选型、发育调节型、胁迫诱导型或其組合.或者非转基因植物中可含有由引入天然启动子修饰的天然CKSRP表达。SEQIDNO:4定义的PpCK-l、SEQIDNO:6定义的PpCK-2、SEQIDNO:2定义的PpCK-4、SEQIDNO:8定义的PpPK-4、SEQIDNO:10定义的ScCK-l、SEQIDNO:12定义的BnCK-l、SEQIDNO:14定义的BnCK-2、SEQIDNO:16定义的BnCK誦3、SEQIDNO:18定义的BnCK-4或SEQIDNO:20定义的BnCK-5在^tt物中的表达可以但不仅限于通过以下实例之一实现(a)组成型启动子、(b)胁迫诱导型启动子、(c)化学物诱导型启动子，以及(d)带有如锌指来源的转录因子的设计的启动子过量表达(Greisman和Pabo，1997，Science275:657)。在优选实施方案中，利用如Greisman和Pabo，1997，Science275:657所述、SangamoBiosciences,Inc.生产的锌指来源的转录因子(ZFP)调节CKSRP的转录.ZFP既含有DNA识别结构域，也含有能导致^酸如CKSRP核酸活化或受抑的功能性结构域，因此，能产生特异性识别上述CKSRP启动子的活化型或抑制型ZFP，并用于提高或降低CKSRP在植物中的表达，从而调节植物的胁迫耐受性。本发明也包括对**物中SEQIDNO:4定义的PpCK-l、SEQIDNO:6定义的PpCK-2、SEQIDNO:2定义的PpCK4、SEQIDNO:8定义的PpPK-4、SEQIDNO:IO定义的ScCK-l、SEQIDNO:12定义的BnCK-l、SEQIDNO:14定义的BnCK-2、SEQIDNO:16定义的BnCK-3、SEQIDNO:18定义的BnCK4和SEQIDNO:20定义的BnCK-5的同源物的鉴定，以及对该同源物启动子的鉴定.本发明也提供了相对于宿主细胞野生型品种提高目标基因在该宿主细胞中表达的方法，其中该目标基因在应答CKSRP时转录，包括(a)用含有CKSRP编码核酸的表达栽体转化宿主细胞，和(b)在宿主细胞中表达CKSRP,从而提高应答CKSRP转录的基因相对于该宿主细胞野生型品种的表达.除了将CKSRP核酸序列导入转基因植物外，这些序列也可用于鉴定小立碗藓、欧洲油菜、酿酒酵母或其近缘生物.它们也可用于鉴定在微生物混合种群中是否存在小立碗藓、欧洲油菜、酿酒酵母或其近缘.本发明提供了若千小立碗藓、欧洲油菜以及酿酒酵母基因的核酸序列；通过在严4^件下对单一或混合微生物种群培养物的基因组DNA提取物使用跨小立碗藓、欧洲油菜或酿酒酵母基因中某一该生物特有区域的探针，可以确定是否存在该生物。此外，本发明的核酸和多肽分子可用作基因组特定区域的标记。这不仅可用于基因组作图，也可用于小立碗藓、欧洲油菜或酿酒酵母多肽的功能研究。例如，为鉴定基因组中与特定小立碗藓DNA结合多肽结合的区域，可以消化小立碗藓基因组，并将其片段与DNA结合多肽孵育。那些结合多肽的片段还可用本发明的核酸分子作探针检测，优选探针带有容易检测的标记。此类核酸分子与基因组片段的结^该片段得以在小立碗藓的基因組图上定位，且使用不同的酶多次实施可有助于快速确定与多肽结合的核酸序列。此外，本发明的核酸分子可能与相关物种序列足够一致足以作为构建相关藓类基因组图的标记，本发明的CKSRP核酸分子也可用于进化和多肽结构研究。很多原核和真核细胞利用有本发明分子参与的代谢和转运过程；通过将本发明的核可以评价这些生物间的进化相关性.与之类似，此类对比能够评价序列中哪些为保守区域而哪些不是，从而有助于确定多肽中那些对该酶行使功能极为关鍵的区域。此类确定对于多肽改造研究^L^价值，可能提示什么样的多肽能够耐受诱变且不丧失其功能.对本发明的CKSRP核酸分子加工可能会产生与野生型CKSRP具有功能性差异的CKSRP,这些多肽的有效性或活性可能有所提高，在细胞中的数量可能多于正常，或有效性或活性可能降低.对本发明CKSRP的改变可以通过多种机制直接影响胁迫应答和/或胁迫耐受性。在表达CKSRP的植物中，转运增加能改善植物组织和器官中盐和/或溶质分区，提高从细胞中运出离子分子的转运蛋白分子的数目或活性，有可能会影响细胞的盐耐受性。通过将被#^微生物或植物在次合适的条件下生长，然后分析植物的生长特征和/或代谢，能够评价植物、谷氨酸棒杆菌、真菌、藻类或纤毛虫中遗传修饰对胁迫耐受性的影响.此类分析技术为本领域技术人员所公知，包括干重、湿重、多肽合成、碳7]C化合物合成、脂质合成、蒸发蒸腾作用速率、全植物和/或作物产量、开花、繁殖、结实、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,17巻中的ApplicationsofHPLCinBiochemistry;Rehm等人，1993Biotechnology,第3巻第III章Productrecoveryandpurification,469-714页，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人，1988，Bioseparations:downstreamprocessingforbiotechnology,JohnWileyandSons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.,1992，Recoveryprocessesforbiologicalmaterials,JohnWileyandSons;Ulmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,B3巻第11章，1曙27页，VCH:Wdnheim中的Shaeiwitz，J.A.和Henry,J.D.，1988，Biochemicalseparations;以及Dechow，F丄，1989，Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications).例如，可以利用标准方法构建含有此处公开核酸或其片段的酵母表达栽体，并将其转化至酿酒酵母中.然后测定产生的转基因细胞对旱、盐和温^迫的耐受性的消失或改变.与之类似，可以利用标准方法，构建含有此处公开核酸或其片段的植物表达栽体，并将其转化入合适的植物细胞如拟南芥、大豆、油菜、玉米、小麦、蒺藜苜蓿(Me必cflg0friiwc"ft/to)中，然后可检测产生的转基因细胞和/或由此衍生的植物对旱、盐和温JU沐迫的耐受性的下降或改变。对本发明一种或几种CKSRP基因的改造也可产生活性改变的CKSRP，间接影响藻类、植物、纤毛虫或真菌或其他微生物如谷氨酸棒杆菌的胁迫应答和/或胁迫耐受性。例如，代谢的正常生物化学过程会产生一系列产物(如过氣化氢和其他活性氧种类)，活跃干扰同一代谢过程.例如，过氧亚辨酸已知能够贿化酪氨酸的側链，由此使一些在活性位点含有酪氨酸的酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2):226-235).虽然这些产物通常是分泌的，可对细胞进行遗传^it以使其转运出的产物多于一般野生型细胞。最佳化涉及特定分子如盐分子外运的一种或多种本发明CKSRP的活性，有可能会改善细胞的胁迫耐受性。此外，此处公开的序列或其片段可用于在多种生物的基因組中产生敲除突变，如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞(Girke，T.，1998,ThePlantJournal15:39-48)。然后评价产生的敲除细胞耐受多种胁迫情况的能力、对多种胁迫情况的应答以及对突变表型和/或基因型的影响。其他基因失活的方法，见美国专利号6，004，804"非嵌合突变栽体"，以及Puttaraju等人，1999，Spliceosome誦mediatedRNA加附-splicingasatoolforgenetherapy,NatureBiotechnology17:246-252。前述可产生胁迫耐受性增强的CKSRP诱变策略并无限制性；对这些策略的改变对于本领域技术人员显而易见。利用此类策略，辅以此处/〉开的机制，可利用本发明的核酸和多肽分子产生表达突变CKSRP核酸和多肽分子从而改善胁迫耐受性的藻类、纤毛虫、真菌或其他微生物如谷氨酸棒杆菌，本发明也提供了能与此处所述核酸编码的CKSRP或其部分特异性结合的抗体.抗体可由多种已知方法制备(见如Harlow和Lane，"Antibodies;ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1988))。简言之，可将纯化抗原注射入动物体内，其注射量和间隔均足以激发出免疫应答。可直接纯化抗体，或获取动物的脾细胞.然后可将这些细胞与永生细胞系融合并筛选其抗体分泌，抗体可用于筛逸核酸克隆文库中分泌抗原的细胞.然后测序那些阳性克隆(见如Kelly等人，1992，Bio/Technology10:163-167;Bebbington等人,1992，股o/Technoiogy10:169-175)。表述"选择性结合"和"特异性结合"于多肽，是指能确定外源性多肽种群和其他生物制剂中是否存在多肽的结合反应。因此在指定的免疫测定条件下，结合于特定多肽的特异性抗体不会与样品中存在的其他多肽大量结合。此种情况下抗体的选择性结合可能需要选择对特定多肽具有特异性的抗体。多种免疫测定形式可用于选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定以选择与多JIUC生选择性免^应的抗体.见Harlow和Lane，"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)中对可用于确定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述.在某些情况下，需要制备来自多种宿主的单克隆抗体。对制备此类单克隆抗体的技术描述可见于Stites等人编辑，"BasicandClinicalImmunology,"(LangeMedicalPublications,LosAltos，Calif"FourthEdition)及其中引用参考文献，以及Harlow和Lane"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988。本申请中参考了多种出版物。所有这些出版物及其中引用参考文献的乂>开此处4^引用入本申请作为参考，以期更全面地描述本发明涉及的领域的状态，也应当理解前文涉及本发明优选实施方案，可不背离本发明范围而其进行多种改动。以下实施例进一步说明了本发明，这些实施例的构建不在于对本发明的范围实施限制。与之相反，应当清楚认识到可以采用多种其他实施例、修饰及其等效物，其在阅读此处说明后对于本领域技"员而言显而易见，且不背离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围，实施例实施例1一小2碗岸雄##兰长，本研究中使用来自UniversityofHamburg遗传学研究部保藏的植物物种小立碗藓(Hedw.)B.S.GL.它们来自GransdenWood,Huntingdonshire(England)的H丄.K.Whitehouse保藏的植林16/14,是Engel(1968，Am.J.BotS5，438-446)孢子的亚培养，通过孢子方法和配子体再生方法实施植物的增殖a单倍体孢子产生原丝体，成为富叶绿体的绿丝体和少叶绿体的茎丝体，约12天后其上形成芽.这些生长成为带有配子托的精子器和颈卵器。受精后产生带有短蒴柄和孢子囊的双倍体孢子体，减数孢子在其中成熟，在气温25'C、光密度55微摩尔/米、秒(白光；PhilipsTL65W/25荧光管)、it/暗变化为16/8小时的气候室中进行培养。在如Reski和Abel(1985，Planta165:354-358)使用的Knop培养基的液体培养物中修饰藓类，或在使用1%Oxoid琼月旨(Unipath，Basingstoke,England)的Knop固体培养基上培养之。在通风的液体培养基中培养用于RNA和DNA分离的原丝体。每9天粉碎原丝体并转移到新鲜培养基中。实施例2一灰控浙^分荐省DiV丄分离总DNA的细节涉及操作湿重1克的植物材料。使用的材料包括以下緩冲液CTAB緩冲液2%(w/v)N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化铵(CTAB);100mMTrisHC1pH8.0;1.4MNaCl;20mMEDTA;N-月桂醇J^酸緩冲液10%(w/v)N-月桂醇I/L^酸;100mMTrisHC1pH8.0;和20mMEDTA。液氮下于研钵中研磨植物材料，得到细微粉末并转移到2ml的Eppendorf管中。然后用一层1ml的分解緩冲液(lmlCTAB緩冲液，100plN-月桂醇M^酸緩冲液，20pljS^L^乙醇和10/d蛋白酶K溶液，10mg/ml)覆盖冰冻的植物材料，并在60t:持续摇晃温育l小时。将得到的匀浆分到2个Eppendorf管(2ml)中，并用相同体积的氯仿/异戊醇(24:l)振荡提取两次。为了相分离，将^^在8000g和室温下离心15分钟。然后使用水冷的异丙醇将DNA在-70r下沉淀30分钟,在4"和IO，OOOg下沉积沉淀DNA30分钟并重悬浮于180/tlTE緩冲液中(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-3096)。为进一步纯化，用NaCl(终浓度1.2M)处理DNA,并用两倍体积的纯乙醇在-70'C再度沉淀30分钟。用70%乙醇清洗之后，干燥DNA,随后以50/tl水+RNAse(最终浓度50mg/ml)溶解之，在4"C过夜溶解DNA,然后在37t!进行RNAse消化l小时.4"下存放DNA,实施例3-从V、J碗岸分岸省/AC4和^*脊磁必2A^"及c2)AMJt岸沐餘建，为研究转录物，分离了总RNA和M普酸化RNA.根据GTC方法(Reski等人，1994，Mol.Gen.Genet.，244:352-359)从野生型9天龄的原丝体中获取总RNA'采用DynaBeads(Dynal，Oslo,Norway)方法，根据生产商手册分离聚腺苷酸化RNA。确定了RNA或聚腺苷酸化RNA的浓"，通#入1/10体积的pH4.6的3M醋酸钠和2倍体积的乙醇沉淀RNA并贮存于-70t:。为建立cDNA文库，利用鼠白血病病毒逆转录酶(Roche，Mannheim，德国)和寡聚-d(T)-引物合成第一链，与DNA聚合酶I、Klenow酶和RNAseH在12t!(2小时)、16°C(1小时)和22。C(1小时)温育消化，合成第二链。在65。C温育10分钟以终止反应，然后转移到冰上。在37"(30分钟)用T4-DNA聚合酶(Roche，Mannheim)将双链DNA分子补平。用酚/氯仿提取和S印hadexG50旋转柱除去核苷酸。用T4-DNA连接酶(Roche,12'C，过夜)将EcoRI衔接子(Pharmacia，Freiburg，德国)连接到cDNA末端，并与多核苷酸激酶(Roche，37T，30分钟)温育而磷酸化。在低熔点琼脂糖:^上分离该混合物。从皿上洗脱大于3004!^的DNA分子、酚提取、在Elutip-D-柱上浓缩(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)、并且将其连接入栽体臂，和根据生产商的材料和指南，利用GigapackGold试剂盒(Stratagene，Amsterdam,荷兰)将其包装进XZAPII噬菌体或XZAP-Express逸菌体。实施例4一小ji碗岸五sr时洒^和甜雜遂斧.根据标准方法将实施例3描述的cDNA文库用于DNA测序，务沐而言利用ABIPRISM说gDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(Perkin-Elmer，Weiterstadt,德国)通过链终止方法进行.通过体内大量剪切、再转化和随后在琼脂平板上铺上DH10B(具体材料和方法来自Stratagene,Amsterdam，荷兰)，从cDNA文库中回收制备的质粒后，实施随机测序。根据生产商的方法，在QiageneDNA制备自动M上(Qiagen，Hilden),从在含有氨千青霉素的Luria-Bnrth培养基中过夜生长的大麻杆菌(五."/Z)培养物中制备质粒DNA(见Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)。使用具有下列核苷酸序列的测序引物5，-CAGGAAACAGCTATGACC-3，SEQIDNO:215，-CTAAAGGGAACAAAAGCTG"3，SEQIDNO:225，-TGTAAAACGACGGCCAGT誦3，SEQIDNO:23采用Bio-Max(Munich,德国)商业提供的软件包EST-MAX处理序列并进行注释，该程序实际上整合了蛋白质序列的功能和结构性表征的所有重要生物信息学方'法。参见pedant.mips.biochem.mpg.de.网站。整合入EST-MAX中最重要的算法有FASTA(估计统计显著性的高灵敏度的序列数据库搜索；PearsonW.R.，1990，RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA.MethodsEnzymol.183:63-98);BLAST(估计统计显著性的高灵敏度的序列数据库搜索；AltschulS.F.等人，Basiclocalalignmentsearchtool,JournalofMolecularBiology215:403-10);PREDATOR(从单个和多个序列预测高精确度的二级结构。Frishman，D.和Argos，P"1997，75%accuracyinproteinsecondarystruc加reprediction.Proteins,27:329-335);CLUSTALW:多重序列比对.Thompson,J.D.等人，1994，CLUSTALW(通过序列权重、位置特异性空位罚分和权重矩阵选择，提高累进多重序列比对的灵敏度。NucleicAcidsResearch,22:4673-4680);TMAP(从多个比对的序列预测跨膜区域.Persson，B.和Argos，P.，1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments.J.Mol.Biol.237:182-192);ALOM2(从单个序列预澳Ji^膜区域。Klein，P.等人Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminateanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226(1984).第2版由Dr.K.Nakai提供)；PROSEARCH(检测PROSITE蛋白质序列模式。KolakowskiL.F.Jr.，LeunissenJ.A.M.，SmithJ.E,1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotechiiiques13,919-921);BLIMPS(对无空位微数据库的相似性搜索，J.C.WallaceandHenikoffS.，1992);PATMAT(—种序列、模式、模块查询和数据库的搜索和提秘序，CABIOS8:249-254.由说llAlford所写)，实施例5-婆定^^应于i^cu、i/，or-2、Ppor"和P/Wjr-4碗岸O及尸'采用EST-MAX程序，通过BLAST分析，在小立碗藓EST测序程序中鉴定了部分PpCK-l、PpCK-2、PpCK4和PpPK4的小立碗藓部分cDNA(EST)。选择编码蛋白质激酶的特定克隆进一步分析。表2PpCK-l与其它激酶的^J^酸同一性和相似性程度(使用了成对比较:空位罚分10;空位拓展罚分0.1;分数矩阵blosum62)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>(G:C)和腺嘌呤配对DNA中胸腺嘧咬(A:T),或腺噪呤配对RNA中尿嘧啶(A:U)的组合。应当理解两个多核苷酸即使彼此不完全互补也可相互杂交，只要彼此间有至少一个区域基本互补。术语"反义核酸，，包括单链RNA以及能转录产生反义RNA的双链DNA表达盒。"活性，，反义核酸为能与初级转录物或编码多肽的mRNA选择性杂交的反义RNA分子，所述多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20的多肽具有至少80%的序列同一性。反义核酸可与整个CKSRP编码链互补，或仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码CKSRP核苷酸序列编码链的"编码区"反义。术语"编码区"指含有能翻译为氨基酸戎基的密码子的核苷酸序列区域。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码CKSRP核苷酸序列编码链的"非编码区，，反义。术语"非编码区"指与编码区侧接而不会被翻译为絲酸的5，和3，序列(即所谓的5，和3，非翻译区).反义核酸分子可与CKSRPmRNA的整个编码区互补，但更优选为仅与CKSRPmRNA的编码或非编码区部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可互补于CKSRPmRNA翻#^始位点周围的区域，反义寡核苷酸的长度可为如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，一般而言，本发明的反义分子含有RNA,其与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19,或编码SEQH)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽的多核苷酸的至少14个连续核苷酸具有60-100%的序列同一性。优选的序列同一性为至少70%，更优选至少75%、80%、85%、90%、95%或98%，最优选99%,利用本领域已知的操作使用化学合成和酶连接反应可构建本发明的反义核酸。例如，可利用天然存在的核苷酸或经多种修饰的核苷酸化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，设计所述修饰核苷酸以提高分子的生物稳定PpCK-l、PpCK-2、PpCK-4和PpPK-4全长编码区域的序列，可用于设计用于每一基因全长克隆的寡聚引物(见以下全长扩增)。全长扩增利用基因特异性引物(见表6)，以原始EST为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)获得对应于PpCK-l、PpCK-2和PpCK-4的全长克隆。反应条件是PWODNA聚合酶(Roche)的标准条件。祁》据标准条件和生产商说明实施PCR(Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"BiometraT3Thermocycler)。反应^lt为941!5分钟，随后5个循环(94t！l分钟、50'Cl分钟和72t！1.5*)。然后是25个循环(94"l分钟、65"1M和72'C1.5分钟)。通过利用表6中给定的基因特异性引物的重复RACE方法，分离PpPK-4(SEQIDNO:7)的全长克隆。根据生产商说明，采用QIA快速^L提取试刑盒(Qiagen)从琼脂糖凝败提取扩增的片段，并连接^TOPOpCR2.1栽体(Invitrogen).在标准条件下将重组栽体转化入Top10细胞(Invitrogen)(Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY),在含有100mg/ml羧千青霉素、0.8mgX-gal(5-溴4-氯-3-丐l咮-z3-D-半乳糖苷)和0.8mg1PTG(异丙基琉代_p-D-半乳糖苷)的LB琼脂上37'C过夜生长以选择转化的细胞。选择白色的菌落，用于接种含有100mg/ml氨爷青霉素的3ml液体LB，并于37"过夜生长。根据生产商说明，使用QIApr邻SpinMiniprepKit(Qiagen)提取质粒DNA。根据标准的分子生物学技术分析随后的克隆和限制性图镨(Sambrook等Aj1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。表6用于克隆全长克隆的方案和引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>实施例7-婆定对^于&CXJ时癍潘脊母0及F。酿酒酵母中编码酪蛋白激酶I的ORF760基因，首次描述于MetanomicsInc.递交于2003年9月30日的欧洲专利申请号03022225.1。Metanomics的专利申请在此处整体引用作为参考。通过用于扩增操作的PfuDNA聚合酶或PfulTaqDNA聚合酶混合物(Herculase)标准方法，分离ORF760基因。通过^电泳分析扩增的ORF片段。每个引物由1个通用5，端和ORF特异的3，端组成，依上所述的通用序列对于正向和反向引物不同(正向引物序列对酵母含有EcoRI或者对大肠杆菌含有Smal，反向引物序列对酵母含有Smal或对大肠杆菌含有SacI),从而进行单向克隆。扩增的PCR反应物包括lxPCR緩冲液、.2mMdNTP、100ng酿酒酵母基因组DNA(S288C)或60ng大肠杆菌K-12基因组DNA(MG1655)、25pmol反向引物、2.5uPfu或HerculaseDNA聚合酶.反应条件包括94匸3分钟1个循环；接着是25个循环，94"30秒、55"30秒和72"C5-6分钟；接着是在6-10分冲1个循环，然后于4"C不确定时间，ScCK-l(ORF760)的正向序列是5，-GGAATTCCAGCTGACCACCATGTCCCAACGATCTTCACAACAC-3，(SEQIDNO:33)ScCK-l(ORF760)的反向序列是5，-GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAAAAAAAAAAAGGAAAAAGAGAAAAG-3，(SEQIDNO:34).实施例8-婆定^/^T:f5"Or"、i"ar-2、5wCU、5wCKW和J/fCJT-5好欽辦磁衷做F.收获组织、分离RNA和构建cDNA文库在多种条件和处理下生长油菜植物，并在各个发育阶段^不同的组织，以策略性方式进行植物生长和收获，使在至少一个或更多产生的文库中获得^可表达基因的概率最大化.如实施例3所il^每个收集的样品中分离mRNA，并构建cDNA文库.在生产文库过程中不采用扩增步骤，以最大程度减少样品中的基因冗余并保留表达信息。所有的文库都从寡聚dT柱纯化的mRNA的3，产生。随;Mfe选cDNA文库转化入大肠杆菌的菌落，并置于微量滴定板上。探针杂交从大肠杆菌菌落中分离质粒DNA，然后点在膜上。一组288个"P放射性标记的7核苷酸的寡核苷酸依次与这些膜杂交。为提高通量，处理双份膜。每次杂交后，通过磷屏图像扫描捕捉印迹图像，产生每一寡核苷酸的杂交镨。经由UMS将这一初步的数据图像自动传送至计算机。通过对图像盒、过滤器以及盒中方位进行条形编码，使其保持完全一致。然后用相对温和的条件处理过滤器以除去结合的探针，并送回到杂交箱进行下一轮杂交。重复杂交和成^^的循环，直至完成该组288个寡聚体。完成杂M，对于每一斑点(代表一个cDNA插入片段)均产生了关于288个33P^t射性同位素标记的7核苷酸的寡核苷酸中哪些与该特定点(cDNA插入片段)结合，以及结合到什么程度的镨。该谦被定义为由该克隆产生的识别标志。将v^每个克隆产生的识别标志与相同生物产生的所有其它识别标志比较，以鉴定相关识别标志的簇。此方法在测序前将来自一个生物的所有克隆"^Et"为簇.基因分离根据这些克隆相同或相似的杂交识別标志，将其M入不同的簇.簇应该是单个基因或基因家族的表达提示。该分析的副产物是在特定文库中每个基因丰度的表达诰。采用从5，端的单程测序，通it^序列数据库中进行相似性和基序搜索，预测特定克隆的功能.将酿酒酵母ScCK-l(SEQIDNO:9)的全长DNA序列对私有的油菜叠连群数据库进行比对，E值为E-10(Altschul，St邻hen等A^GappedBLASTandPSI一BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprogram,NucleicAcidsRes.25:3389-3402),分析对于推测的全长序列的所有命中的叠连群，并对代表推测的全长叠连群的最长克隆进行全长测序.从私有叠连群数据库中分离的5个这样的叠连群为BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5'在表8-12中显示了BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5的M酸序列与现有技术已知最近基因的同源性。BnCK-l与相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度(使用成对比较:空位罚分10;空位拓展罚分0.1;分数矩阵blosum62)基因名称公共数据库序列蛋白质名称物种序列同一性(％)序列相似性(％)BnCK-lQ93Z18丝氨必苏氨酸蛋白激酶拟南芥53.965.1表9BnCK-2与相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成对比较空位罚分10;空位拓展罚分0.1;分数矩阵blosum62)基因名称公共数据库序列蛋白质名称物种序列同一性(％)序列相似性(％)BnCK-2NP一680447推测的i^白激酶拟南芥91.394.7表IOBnCK-3与相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成对比较空位罚分10;空位拓展罚分0.1;分数矩阵blosrnn62)基因名称公共数据库序列蛋白质名称物种序列同一性(％)序列相似性(％)BnCK-3NP_567812推测的B^"白激酶拟南芥92.595.6表llBnCK-4与相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成对比较空位罚分10;空位拓展罚分0.1;分数矩阵blosum62)基因名称公共数据库序列蛋白质名称物种序列同一性(%)序列相似性(%)BnCK~4Q9SE85絲白激酶I相似蛋白质甘蓝(Brassicaoleracea)91.291.4表12BnCK-5与相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成对比较空位罚分10;空位拓展罚分0.1;分数矩阵blosum62)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>实施例9一遞i^过量在迷印CU、i^OT-2、i^O^、i^i^4、&C:U、丑/iCJS:-7、JJwCJT-2、5wCJT-3、丑wCiT-4々5wCr-5差厉，欢it^^jL^遂考菱遂拟^齐在炎.'二元栽体构建dBPS-JH001。根据生产商说明，用HindIII(Roche)消化pLMNC53质粒构建体(Mankin，2000，Ph.D.thesis,UniversityofNorthCarolina),并用Klenow酶和0.1mMdNTP补平。用琼脂糖凝胶纯化该片段，并根据生产商说明通过QIA快速^J^提取试剂盒(Qiagen)提取.然后再用EcoRI(Roche)消化纯化的片段，琼脂糖凝欧纯化，并根据生产商说明使用QIA快速MJ^提取试剂盒(Qiagen)^取。得到的1.4kb片段，庆大霉素盒，包括nos启动子、aacCI基因和g7终止子。#>据生产商说明用EcoRI和Smal(Roche)消化pBlueScript栽体，再根据生产商说明用QIA快速^R提取试剂盒(Qiagen)，从琼脂糖^J^提取产生的片段。根据生产商说明用T4DNA连接酶(Roche)将消化的pBluescript栽体和庆大霉素盒片段连在一起，使两个分别的EcoRI位点相连，平端化的扭ndIII位点和Smal位点相连.采用标准条件，将重组栽体(pGMBS)转化进入Topl0细胞(Invitrogen).在含有100pg/ml羧爷青霉素、0.8mgX-gal(5-溴-4-氯-3-吲味-p-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(异丙基疏代-P-D-半乳糖苷)的LB琼脂上37"过夜生长，筛选转化细胞。选择白色菌落，用于接种含有100mg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB，并在37'C过夜生长。根据生产商说明，使用QIApr印SpinMiniprepKit(Qiagen)提取质粒DNA。棉4t标准的分子生物73学技术(Sambrook等人1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)，分析随后的克隆和限制性图镨。根据生产商说明用Xbal和Kpnl(Roche)消化pGMBS载体和plbxS叩erGUS栽体，从pGMBS上切下庆大霉素盒，并从plbxSuperGUS载体产生骨架。根据生产商说明，利用QIA快速^J^提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶提取产生的片段，根据生产商说明利用T4DNA连接酶(Roche)将这两个片段相连。采用标准条件，将产生的重组栽体(pBPS-JHOOl)转化进入ToplO细胞(Invitrogen),在含有100|tg/ml羧千青霉素、0.8mgX誦gal(5-溴-4-氯画3-吲味-p-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(异丙J^L代-P-D-半乳糖苷)的LB琼脂上37'C过夜生长，筛选转化细胞.选择白色菌落，用于接种含有100mg/ml氨节音霉素的3ml液体LB，并在37"C过夜生长。根据生产商指南，使用QIAprepSpinMinipr邻Kit(Qiagen)提取质粒DNA,根据标准分子生物学技^Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.),分析随后的克隆和限制性图谮.将PdCK-1、PdCK-2、PdCK4、PpPK~4、ScCK-l、BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK~4和BnCK-5亚克隆入二元栽体,根据生产商说明，采用限制性酶两端消化，从重组的PCR2.1TOPO栽体中切下含有不同小立碗藓S^白激酶的片段(见表13),再根据生产商说明，用QIA快速^J^提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶切下随后的片段，连接入二元载体,用合适的酶裂解(见表13)，并在连接之前去磷酸化.产生的重組栽体含有处于組成型超级启动子控制之下的对应正义方向的酪蛋白激酶。表13列出用于植物转化的小立碗藓酪蛋白激酶构建体的名称。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>将ScCK-l亚克隆1二元栽体,将ScCK-l基因亚克隆l含有bar基因(由其T-DNA上的masl启动子驱动)的二元栽体(Velten等人1984，EMBOJ.3:2723-2730;Mengiste等人1997，PlantJ.，12:945-948),该T-DNA的克隆盒前^^有一个组成型启动子，后面为nos终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.l(6):561-573)。克隆盒由序列5，-GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCAATTCCCGGGGATC-3，(SEQIDNO:37)组成。其它选择系统和启动子为本领域所公知，并可在本发明中有相似应用(例如，AHAS标记物、泛素启动子(Callis等人J.Biol.Chem.19卯，265:12486"12493;US5，510，474;US6,020,190;Kawalleck等人，1993，PlantMol.Biol.21:673-684)、34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673))。利用供应商(MBIFermentas，德国)提供的标准方法，用EcoRI和Smal消化二元栽体和ORF760基因(100ng).使用Qiagen柱(Qiagen，Hilden，德国)纯化ORF760基因，并根据标准方法(Maniatis等人)与限制性消化的二元栽体(30ng)相连.农杆菌转化。根据标准条件，将重组载体转化3iAjL瘤农杆菌C58C1和PMP卯中(Hoefgen和Willmitzer，1990;Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)。植物转化。根据标准条件，生长并转化拟南芥生态型C24(Bechtold，1993，Acad.Sci.Paris.316:1194-1199;Bent等人，1994，Science265:1856-1860)。筛选含有小立碗藓基因的转化植抹。根据标准方法对Tl种子进行灭菌(Xiong等人，1999，PlantMolecularBiologyReporter17:159-170)。在添加1%蔗糖和2pg/ml苯来特(benomyl)(Sigma-Aldrich)的1/2Murashige和Skoog培养基(MS)(Sigma-Aldrich)、0.6%琼脂上筛选种子。于4。C春化处理平板上的种子4天。这些种子在气温221:、光密度40微摩尔/米2秒(白光；PhilipsTL65W/25荧光管)的气候室中萌发，并采用16小时光照和8小时黑暗的循环。14天后筛选转化的幼苗并转移至添加了0.6%琼脂、1%蔗糖的1/2MS培养基中，使其恢复5-7天。>^有小立碗蘚基因的转化植抹的千旱耐受性筛选将T1幼苗转移至培养niL中的干燥无菌滤纸，并使其在Sanyo生长箱MLR-350H，徵學尔/米2秒(白光；PhilipsTL65W/25荧光管)中，以80%RH(相对湿度)干燥2小时.然后将RH降为60y。，再干燥幼苗8小时，然后移出幼苗，置于添加2ng/ml苯来特的1/2MS0.6yn琼脂平板上，5天后记录.然后筛选干旱耐受性提高的转基因植林。在干旱胁迫条件下，过量表达PpCK-l的拟南芥植抹干旱胁迫的存活率为50%(10个受胁迫植林中存活5个)，过量表达PpCK-2的拟南芥tt^干旱胁迫的存活率为52%(31个受胁iitt抹中存活16个)，而过量表达PpCK-4的拟南芥植林干旱胁迫中的存活率为14%(7个受胁迫植抹中存活1个)，相对未转化的对照tt^在干旱胁迫中的存活率为11%(9个受胁iMt林中存活1个)，在三个独立的实验中，筛选含有ScCK-l基因的转基因拟南芥;lt^的干旱耐受性。笫一个实验将植林置于为期12天的干旱条件下.12天之后筛选转基因植林中干旱耐受性提高者。如其膨胀的外观和持续的绿色所示，含ScCK-l转基因的转基因植林(ll个植林)保持活力，其存活时间比未转化的野生型对照相L林平均多2.2天。第二个实验中采用来自多个独立转基因抹系的植林。将含有ScCK-l转基因的三周龄的转基因植林置于干旱胁迫条件下。如其膨胀的外，见和持续的绿色所示，含ScCK-l转基因的转基因植林(6个植林)保持活力，其存活时间比未转化的野生型对照检昧平均多0.3天。第三个实验中，采用来自一个独立转基因林系的多个植林。将含有ScCK-l转基因的三周龄的转基因柏:林置于干旱胁迫条件下。结果如表14显示。含ScCK-l转基因的转基因植抹的光合产量显著高于未转化的野生型对照植林。对于ScCK-l，列出了5个重复;ti林的平均结果；对于野生型植林，列出了20-25个,的平均结果。表14<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>16对含有小立碗藓基因转化植株的水冻耐受性筛选将幼苗转移至含有添加2%蔗糖和2|ig/ml苯来特的1/2MS0.6%琼脂的培养i中.4天后，4X3下温育幼苗1小时，再用水屑覆盖。然后把幼苗放置在EnvironineiitalSpecialistES2000环境室中，从-1.0。C开始，每小时降低-1.0。C，温育3.5小时.此后将这些幼苗在-5.0。C孵育24小时，然后在5。C融化12小时.将^#出，S^记录幼苗.筛选这些转基因植^MI:高的水冻耐受性，证明转基因表达能赋予冰冻耐受性.在水冻胁迫条件下，过量表达PpCK-l的拟南芥;tiL^在水冻胁迫中的存活率为100。/。(14个受胁迫^t抹中存活14个)，相比而言，未转化的对照植林存活率为2%(48个受胁il^中存活1个)。盐耐受性筛选盐耐受性筛选前的晚上，将幼苗转移至浸泡在1/2MS的滤紙上，并置于添加2pg/ml苯来特的1/2MS、0.6%琼脂上.为了盐耐受性筛选，将载有幼苗的滤纸转移到无菌滤纸纸堆上，浸泡于50mMNaCl的培养DIL中.2小时后，将载有幼苗的滤纸转移到无菌滤纸纸堆上，浸泡于200mMNaCl的培养亚中。2小时后，将栽有幼苗的滤纸转移到无菌滤纸纸堆上，浸泡于600mMNaCl的培:^中。IO小时后，将幼苗转移到添加2/ig/ml苯来特的1/2MS、0.6%琼脂的培养脏中。5天后记录幼苗。筛选过量表达转基因的转基因植抹的盐耐受性，证明转基因表达赋予盐耐受性。在冰冻胁迫条件下，过量表达PpCK-l的拟南芥植林在冰冻胁迫中的存活率为0%(20个受胁迫植林中存活0个)，过量表达PpCK-2的拟南芥植林在水冻胁迫中的存活率为10%(10个受胁迫植林中存活1个)，过量表达PpCK-4的拟南芥植林在水冻胁迫中的存活率为0%(6个受胁迫植林中存活O个)，相比而言，未转化的对照植林在水冻胁迫中的存活率为13%(23个受胁迫植林中存活3个)，在水限制条件下的生长筛选在组成型启动子控制下，于拟南芥中it4达pCK-l、PpCK-2、PpCK-4和PpPK4基因。测定转基因林系的水利用效率(WUE)，并在干旱循环后测定某些林系的生物量(图8).SC024代表空栽体对照，BPSC24代表用于转化的拟南芥生态型。DW表示干重，E代表植物水利用.测定柱下面的字母^独立的实验，在组成型启动子驱动表达时，测定的转基因抹系中，EST289(PpCK4)转基因林的干重显著提髙。EST142(PpCK4)转基因^t干旱循环4Hf下的WUE和生物量显著提高，EST194(PpCK-l)在干旱循环^H^下的生物量显著提高.对于所有的转基因林，每一参数的平均值与两个对照相比都有提髙，WUE为5-8。/。，DW为11-19%,E为6-9。/。.可以用转基因表达水平和转基因插入位点的差异来解释基因与基因之间的表型差异.特殊的字母指定每一独立的测定.表15在组成型启动子控制下于拟南芥中过量表达ScCK-l(ORF760)。测定转基因林系的干燥耐受性，在野生型对照死亡后测量存活的平均天数。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例10—在脊差厉拟4《孩祷^發浙脊差厉。为检测转基因拟南芥林系中转基因的存在，如下例对污染RNA样品的基因组DNA进行PCR。根据生产商说明，采用r辨DNA聚合Sl(RocheMolecular股ochemicals)，在50piPCRM使用2.5微升RNA样品。在其中克隆入每个基因的二元栽体质粒用作PCR反应中的阳性对照，而野生型C24基因组DNA用作PCR反应中的阴性对照.在0.8%的琼脂糖-溴乙咬凝胶上分析10piPCR反应物.PcCK-1:用于反应的引物是GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC(SEQIDNO:38)GCGTTAACATGCCCATCTTCTCATACTCAGACC(SEQIDNO:39)PCR程序如下94"l分钟、62"1分钟和72"4分钟，进行30个循环，然后72'CIO分钟.从阳性对照和转基因植林中产生1.7kb的片段。PcCK-2:用于及"虔的引物是GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC(SEQIDNO:40)GCGTTAACCTTAGGAATCGTATGGCAGAGAGCT(SEQIDNO:41)PCR程序如下94。Cl分钟、62'C1分钟和72。C4分钟，进行30个循环，然后72。CIO分钟。从阳性对照和转基因植林中产生1.9kb的片段。PpPK-4:用于M的引物是5，ATCCCGGGAGGCATTGAACTACCTGGAGTGAG3，(SEQIDNO:42)5，GCGATATCGTTGAACTAGTAATCTGTGTTAACTTTATC3，(SEQIDNO:43)PCR程序如下94"lM、62"1^和72t！4分钟，进行30个循环，然后72"IO分钟。从阳性对照和转基因植林中产生1.7kb的片段。从T1转基因抹系中成功扩增了转基因，但野生型C24中则没有。该结果提示Tl转基因植林含有至少一个转基因拷贝.没有迹象显示在未转化的拟南芥对照中存在相同或非常相似的基因，所M因可以通过此法从野生型拔眛中扩增.实施例11一逸过过#表遂i>/d-/、/^CU、、JP/^JiT4、5"cOST-i、5"cjr-j、丑"CK-2、丑"CX"3、5"cx^/成5ncr-5差厉，政i^遂^^爱'胜义^^fc沐，用70%乙醇对大豆种子进行表面灭菌，在室温下持续摇晃4分钟，接着加入添加0.05%(v/v)吐温的20%(v/v)Clorox持续摇晃20分钟，然后，用蒸镏水洗涤种子4次，并于培养脏中湿润的无菌滤纸上在室温下留置6-39小时。剥去种皮，从胚轴上除去子叶。检查胚轴确定没有破坏分生組织区.将切开的胚轴收集于半开的无菌培养脏中，并在封口的培^jdl中用空气干燥至水分含量少于20%(鲜重)，以备后用.^入合适选择试剂的LB固体培养基上的单菌落制备根瘤农杆菌，使单菌落生长于液体LB培养基中，直至其600irni下光密度为0.8。然后于室温以7000rpm离心7分钟使细菌培养物沉淀，并重悬浮于加入100乙酰丁香酮的MS(Murashige和Skoog，1962)培养基中，使用前在此预诱导培养基中于室温孵育细菌培养物2小时。使水分含量约为15%的大豆合子种子胚轴在室温下吸收预诱导的农杆菌重悬物2小时。从吸中取出胚，转移到加入2。/。蔗糖的含有固体MS培养基的培^:中，室温下黑暗中孵育2天。或者将胚置于培养i中湿润的(液体MS培养基)无菌滤纸顶端，于上述同样条件下温育。其后，将胚胎转移到含有500mg/L羧苄青霉素或300mg/L头孢嚷肟的固体或液体MS培养基中，以杀死农杆菌。利用液体培养基润湿无菌滤纸。在150(onoln^秒"和12小时光周期下，将胚胎在25"孵育4周。一旦幼苗生长出根，将其转移到无菌的Metromix土壤。在将植物转移至土壤之前，洗去体外植林的培养基.将植抹在塑,盖下保持l周，以促进其环境适应过程。然后转移植林到生长室，在其内150nmoln^秒"光密度和12小时光周期下，于25"袢育约80天。根据实施例9所述的筛选方法，筛选转基因植林提高的干旱、盐和冷冻耐受性，证明转基因表达能赋予胁迫耐受性和/或提高水利用效率.这耐爱遂磁衷;^磁衷扭梯，此处描述的植物转化方法也可应用于芸苔和其它作物.用70%乙醇对油菜种子在室温进行持续摇晃的表面灭菌4分钟，接着加入含0.05n/。(v/v)吐温的20。/。(v/v)Clorox，室温下持续摇晃20分钟。然后用蒸镏水洗涤种子4次，并室温下在培养亚中湿润的无菌滤纸上留置18小时.然后剥去种皮，在半开的培养亚中空气干燥过夜.此过程中种子会失去约85%的水含量，接着将种子保藏在室温密闭的培^中直至进一步使用.DNA构建体和胚吸收作用如实施例10所述.用PCR分析初级转基因植抹样品(T0)，以确认存在T-DNA。用Southern杂交确认此结果，其中DNA在1。/。的琼脂糖凝胶上电泳并转移到带有正电荷的尼龙膜上(RocheDiagnostics),利用PCRDIG探针合成试剂盒(RocheDiagnostics)通过PCR制备标记有地高辛配基的PCR探针，并根据生产商推荐的方法使用，根据实施例9所描述的筛选方法，筛选转基因植M高的胁迫耐受性，证明转基因表达赋予胁迫耐受性和/或提高的水利用效率.实施例13通过过量表达PpCK0-1PpCL-2PpPK-4ScCK-1必"CiST-J、丑"CJT-2、5"CA"5、J5"CJJT-4^丑"CJ^-5差厉，攻i^遵^^爻'丝好玉术>2^#。利用Ishida等人，1996，NatureBiotech.14745-50中描述的方法用目标基因转化玉米(ZeaMaysL.)。将未成熟胚与带有"超级二元，，栽体的根瘤农杆菌共同培养，通过器官形成回收转基因植林。此方法的转化效率在2.5%-20%之间。根据实施例9所述的筛选方法，筛选转基因档:林提高的干旱、盐和冷冻耐受性，证明转基因表达赋予胁迫耐受性和/或提高水利用效率。实施例14一遞过过:f^迷i^CU、i^OT-2、i^CA^/、i^i^一、5^CA"7、丑"Ciir-j、u"cjt-2、丑"cjj:-3、5"cjs:-4ig丑nc:jsr-5差厉，攻ii^遂^A爻'胜'/、老孩祷，采用Ishida等人1996年描述的方法(Ishida等人1996，NatureBiotech.14745-50)用目标基因转化小麦。将未成熟胚与带有"超级二元，，栽体的根瘤农杆菌共同培养，通过器官形成回收转基因植林。此方法的转化效率在2.5%-20%之间。根据实施例9所述的筛选方法，筛选转基因植林提高的胁迫耐受性，证明转基因表达赋予胁迫耐受性和/或提高水利用效率.实施例15—婆定^潘;^弄糸差厉。基因序列可用于从cDNA文库或基因组文库中鉴定同源或异源基因。可使用如cDNAi^通过核酸杂交分离同源基因(例如全长cDNA克隆)。根据目标基因的丰度，铺板100,000到l，OOO，OOO个重組噬菌体并转移其至尼龙膜上.碱变性后，通过UV交联将DNA固定在膜上。在高严4MHf下进行杂交，在水溶液中，以1MNaCl的离子强度和温度68"的M进行杂交，通过如放射性^P)缺口转录标记(HighPrime,Roche，Mannheim,德国)，产生杂交探针。通过放射自显影检测信号。可用与上述操作相似的方法，使用低严格度的杂交和皿条件鉴定相关但不完全相同的部分同源或异源的基因。对于水相杂交，通常保持离子强度为1MNaCl而将温度从68。C逐步降低至42。C.利用合成的放射标记的寡核苷酸探针，分离只在一个明显结构域(如10-20个M酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列，利用T4多核苷酸激酶通过磷酸化两条互补寡核苷酸的5，端，来制备放射性标记的寡核苷酸。将互补的寡核苷酸退火，并连接形成串联体。然后用如缺口转录方法，放射性标记该双链串联体。通常在低严格条件下，采用高浓度的寡核苷酸进行杂交。寡核苷酸杂交溶液6xSSC0.01M磷酸钠1mMEDTA(pH8)0.5%SDS100ng/ml变性鲑精DNA0.1%脱脂干奶粉杂交过程中逐步将温度降低到估测寡核苷酸Tm的5-10"以下或降至室温，然后进行洗脱步骤和放射自显影。在低严格条件下洗脱，如采用4xSSC洗脱3次.更多细节见述于Sambrook，J等人1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress或者Ausubel，F.M.等Aj1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons。实施例16—^拔琳谬遂《^Jt^蒌定^谬差厉，cDNA克隆可用于在如大肠杆菌中生产重组蛋白质(例如QiagenQIAexpresspQE系统).然后通常用Ni-NTA亲和层析(Qiagen)亲合纯化重组蛋白质.此后使用如兔免疫的标准技术，将重组蛋白质用于生产特异性抗体.如Gu等人，1994，BioTechniques17:257-262所述，用重组抗原饱和的Ni-NTA柱亲合纯化抗体。该抗体可用于筛i^达cDNA文库，以通过免疫筛选鉴定同源或异源基因(Sambrook,J.等人，1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubel，F.M.等人，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley和Sons).实施例17—琳^资爻。可以通过经由大肠杆菌或其他微生物(例如芽孢杆菌(5fla7/"ss/j;p.)或酵母如酿酒酵母)的质粒DNA(或其它载体)传代，进行微生物的体内诱变，其破坏维持遗传信息完整性的能力。典型的突变菌林在DNA修复系统基因具有突变(例如mutHLS、mutD、mutT等，参见Rupp,W.D.，1996,DNArepairmechanisms,in:EscherichiacoliandSalmonella,p.2277-2294，ASM:Washington.作为参考)。此类菌林为本领域技术人员所公知。此类菌林的使用见于如Greener,A.和Callahan,M.，1994，Strategies7:32-34。优选在微生物筛选和测试之后，将突变的DNA分子转入植物。根据本发明文档中不同的说明例，生产转基因植林。实施例18—琳/浙脊差厉4浙^/、立碗岸差厉好甜雜。酶活性和动力学M的确定已经为本领域所熟知。确定任一给定的改变酶活性的实验，必须与野生型酶的特异性活性相适应，并为本领域的技术人员的能力所及。对酵类的一般说明，以及关于结构、动力学、原理、方法、应用和许多确定酶活性的实例可见于以下参考文献Dixon，M.和Webb，E.C.，1979，Enzymes.Longmans:London;Fersht，1985，EnzymeStructureandMechanism.Freeman:NewYork;Walsh，1979，EnzymaticReactionMechanisms.Freeman:SanFrancisco;Price,N.C.，Stevens,L.，1982，FundamentalsofEnzymology.OxfordUniv.Press:Oxford;Boyer，P.D.编辑，1983,TheEnzymes,第3版.AcademicPress:NewYork;Bisswanger，H.，1994，Enzymkinetik，第2版.VCH:Weinheim(ISBN3527300325);Bergmeyer,H.U.，Bergmeyer,J"Gra/1，M.编辑，1983-1986，MethodsofEnzymaticAnalysis,第3版，巻I-XII，VerlagChemie:Wdnheim;以及UHmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,1987，巻A9，Enzymes.VCH:Weinheim,352-363页，可以用若干明确的方法如DNA条带转移测定(也叫做亂欧阻滞测定)，测定结合DNA的蛋白质活性。用报告基因测定法可测量此类蛋白质对其它分子表达的影响(如Kolmar，H.等人，1995，EMBOJ.14:3895-3904及其所引的文献)，报告基因测试系统众所周知，并已使用如--半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和一些其他种类的酶，建立用于原核和真核细胞中.根据如Gennis,R.B.，1989，Pores，ChannelsandTransporters,inBiomembranes，MolecularStructureandFunction,笫85-137、199-234和270-322页，Springer:Heidelberg.所述的技术，可以确定膜转运蛋白的活性。实施例19一^挣必i參^^^厚坎产^。利用本领域公知的多种方法，可以从植物材料(即小立碗藓或拟南芥)、真菌、藻类、纤毛虫、谷氨酸棒杆菌细胞或其它用此处所述核酸序列转化的细菌细胞中，或上述培养物的上清液中回收目的产物.如果目的产物并非从细胞分泌，则可用低速离心从培养物中收获细胞，并采用标准技术如机械力或超声裂解细胞。可以从其他组织或器官;Wfe分离植物器官.匀浆后，离心除去细胞残骸，保留含有可溶蛋白质的上清液部分以进一步纯化得到目的化合物.如果该产物为目的细胞所分泌，则用低速离心将这些细^培#^除去，并保留上清液部分用于进一步纯化'W^—纯化方法得到的上清液进行合适树脂的层析，其中目的分子被层析树脂保留而样品中的许多杂质则不能被保留，或者杂质被树脂保留而样品不被保留，必要时可采用相同或不同的层析树脂，重复这些层析步骤.本领域技术人员熟练掌握合适层析树脂的选择，及其对特定待纯化分子的最有效应用方法。可用通过过滤或超滤浓缩纯化的产物，并保存于该产物最稳定的温度下。很多纯化方法为本领域所公知，并不仅限于前面描述的纯化方法。这些纯化技术已述于如Bailey，J.E.和Ollis，1986，D.F.BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hill:NewYork,此夕卜，可利用>^领域标准技术评定分离化合物的特征和纯度，这些包括高效液相色谱(HPLC)、分光法、染色方法、薄层层析、NIRS、酶测定或者微生物方法。这些分析方法的综述见于Patek等人，1994，Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人，1996，Biotekhnologiya11:27-32;和Schmidt等人,1998,BioprocessEngineer.19:67-70;UImann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,1996，巻A27，VCH:Weinheim，第89-卯页，521-540页，540-547页，559-566、575-581和581-587页；Michal，GL，1999，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWiley和Sons;FaUon,A.等人，1987，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,巻17中的ApplicationsofHPLCinBiochemistry。权利要求1.用编码多肽的核酸转化的转基因植物细胞，其中该多肽如SEQIDNO2所定义。2.权利要求1的转基因植物细胞，其中该核酸包含如在SEQIDNO:l中定义的多核苷酸。3.用编码多肽的核酸转化的转基因植物细胞，其中该多肽在植物细胞中的表达使该植物细胞相对于该植物细胞野生型品种对选自干旱和温度低于或等于O'C中的一种或多种环境胁迫的耐受性增加；其中所述核酸在严格M下与SEQIDNO:l序列及SEQIDNO:l序列的全长互补序列中至少一个序列杂交；且其中所述严格条件包括于65'C在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中杂交.4.用编码多肽的核酸转化的转基因植物细胞，所迷多肽与SEQIDNO:2定义的多肽之间具有至少80%的序列同一性，其中多肽在植物细胞中的表达使该植物细胞相对于该植物细胞野生型品种对选自干旱和温度低于或等于O'C中的一种或多种环境胁迫的耐受性增加。5.含有权利要求1、2、3或4中任一项的转基因植物细胞的转基因植物。6.含有权利要求l、2、3或4中任一项的转基因植物细胞的种子.7.由含有权利要求l、2、3或4中任一项的植物细胞的转基因植物产生的种子，其中所述种子含有编码多肽的核酸，其中所述种子为相对于该植物细胞野生型品种对环境胁迫的耐受性增强的真实遗传，且其中环境胁迫选自千早和温度低于或等于0°C中的一种或多种。8.分离的编码多肽的核酸，其中所述核酸包含编码如SEQIDNO:2所定义多肽的多核苷酸。9.权利要求8的核酸，其中所述核酸包含如SEQIDNO:l定义的多核苷酸。10.分离的编码多肽的核酸，其中所述多肽在植物细胞中的表达使该植物细胞相对于该植物细胞野生型品种对选自干旱和温度低于或等于o。c中的一种或多种环境胁迫的耐受性增加；其中所述核酸在严格条件下与SEQIDNO:l序列及SEQIDNO:l序列的全长互补序列中至少一个序列杂交；且其中严格条件包括于65'C在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中杂交。11.分离的编码多肽的核酸，所述多肽与SEQIDNO:2定义的多肽之间具有至少80%的序列同一性，其中该多肽在植物细胞中的表达使该植物细胞相对于该植物细胞野生型品种对选自干旱和温度低于或等于0'C中的一种或多种环境胁迫的耐受性增加.12.包含权利要求8、9、10或11中任一项的分离的核酸的种子。13.包含权利要求8、9、10或11中任一项的核酸的分离的重组表达野生型品种对环境胁迫的耐受性增强，且其中环境胁迫选自干旱和温度低于或等于O'C中的一种或多种.14.产生含有编码多肽核酸的转基因植物的方法，包括a.使用权利要求13的表达栽体转化植物细胞；和b.从该植物细胞产生表达所述多肽的转基因植物；其中该多肽如SEQIDNO:2所定义。15.产生含有编码多肽核酸的转基因植物的方法，其中所述多肽在植物中的表达使该植物相对于该植物的野生型品种对环境胁迫的耐受性增强，包括，a.使用权利要求13的表达载体转化植物细胞；和b.从该植物细胞产生表达多肽的转基因植物；其中所述核酸在严格条件下与SEQIDNO:l序列及SEQIDNO:l序列的全长互补序列中的至少一个序列杂交;其中严旨降包括于65aC在6x氯化钠/杼檬酸钠(SSC)溶液中杂交；且其中环境胁迫选自干旱和温度低于或等于O'C中的一种或多种.16.产生含有编码多肽核酸的转基因植物的方法，其中所述多肽在植物中的表达使该植物相对于该植物的野生型品种对环境胁迫的耐受性增强，包括，a.使用权利要求13的表达载体转化植物细胞；和b.从该植物细胞产生表达多肽的转基因植物；其中所述多肽与SEQIDNO:2定义的多肽之间具有至少80%的序列同一性，且其中环境胁迫选自干旱和温度低于或等于0'C中的一种或多种。17.用编码多肽的核酸转化的转基因植物细胞，所述多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQEDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20定义多肽的中央蛋白激酶结构域具有至少50%的序列同一性，其中多肽在植物细胞中的表达使该植物细胞相对于该植物细胞野生型品种对选自干旱和温度低于或等于0'C中的一种或多种环境胁迫的耐受性增加。18.权利要求17的转基因植物细胞，其中所述核酸编码的多肽所具有的中央蛋白激酶结构域包含a.第一区，从位置l的甘氨酸残基开始，且在其位置3为甘氨酸而在位置5为苯丙氛酸残基；b.位于第一区下游的第二区，从位置l的缬氨酸残基开始，且在位置4为赖氨酸，位置6谷氨酸残基、位置14谷氨酰胺残基，位置15亮氨酸残基，位置18谷氨酸残基，位置22酪氨酸残基，位置32脯氨酸残基，位置38甘氨酸残基，位置44天冬酰胺残基，位置50和51为亮氨酸残基，位置52甘氨酸残基，位置53脯氨酸残基，位置55亮氨酸残基，位置58亮氨酸残基，位置59苯丙氨酸残基，位置62半胱氨酸残基，位置66苯丙氨酸残基，位置69赖氨酸残基，位置70苏氨酸残基，位置77谷氨酰胺残基，位置79异亮氨酸残基，位置86组氨酸残基，位置93精氨酸残基，位置94天冬氨酸残基，位置96赖氨酸残基，位置97脯氨酸残基，位置99天冬酰胺残基，位置100苯丙氨酸残基，以及位置101为亮氨酸残基；c.位于第二区下游的第三区，从位置l的天冬氨酸残基开始，且其位置5为丙氨酸残基，位置6赖氨酸残基，位置8酪氨酸残基，位置10天冬氨酸残基，位置13苏氨酸残基，位置16组氨酸残基，位置17异亮氨酸残基，位置18脯氨酸残基，位置19酪氨酸残基，位置20精氨酸残基，位置23赖氨酸残基，位置27甘氨酸残基，位置28苏氨酸残基，位置29丙氨酸残基，位置30精氨酸残基，位置31酪氨酸残基，位置33丝氨酸残基，位置35天冬酰胺残基，位置37组氨酸残基，位置39甘氨酸残基，位置41谷氨酸残基，位置43丝氨酸残基，位置44精氨酸残基，位置45精氨酸残基，位置46天冬氨酸残基，位置47天冬氨酸残基，位置49谷氨酸残基，位置52甘氨酸残基，位置57酪氨酸残基，位置58苯丙氨酸残基，位置63亮氨酸残基，位置64脯氨酸残基，位置65色氦酸残基，位置66谷氨酰胺残基，位置67甘氨酸残基，以及d.位于第三区下游的笫四区，从位置l的脯氨酸残基开始，且其位置12为精氨酸残基，位置14亮氨酸残基，位置16苯丙氨酸残基，位置20脯氨酸残基，位置21天冬氨酸残基，位置22酪氨酸^fc，位置41天冬氨酸残基，位置45天冬氨酸残基，以及位置46色氨酸残基。19.含有权利要求17的转基因植物细胞的转基因植物。20.含有权利要求18的转基因植物细胞的转基因植物。21.含有权利要求17的转基因植物细胞的种子，22.含有权利要求18的转基因植物细胞的种子。23.由含有权利要求17的植物细胞的转基因植物产生的种子，其中所述种子含有编码多肽的核酸，其中所述种子为相对于该植物细胞野生型品种对环境胁迫的耐受性增强的真实遗传，且其中环境胁迫选自干旱和温度低于或等于O'C中的一种或多种，24.由含有权利要求18的植物细胞的转基因植物产生的种子，其中所述种子含有编码多肽的核酸，其中所述种子为相对于该植物细胞野生型品种对环境胁迫的耐受性增强的真实遗传，且其中环境胁迫选自干旱和温度低于或等于or中的一种或多种。25.分离的编码多肽的核酸，所述多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20所定义多肽的中央蛋白激酶结构域具有至少80°/。的序列同一性，其中多肽在植物细胞中的表达使该植物细胞相对于该植物细胞野生型品种对选自干旱和温度低于或等于0'C中的一种或多种环境胁迫的耐受性增加。26.权利要求25的分离的核酸，其中所述核酸编码的多肽具有的中央蛋白激酶结构域包含a.第一区，从位置l的甘氨酸残基开始，且在其位置3为甘氨酸而在位置5为苯丙氨酸残基；b.位于第一区下游的第二区，从位置l的缬氨酸残基开始，且其位置4为赖氨酸，位置6谷氨酸残基、位置14谷氨酰胺残基，位置15亮氨酸残基，位置18谷氨酸残基，位置22酪氨酸残基，位置32脯氨酸残基，位置38甘氨酸残基，位置44天冬酰胺残基，位置50和51为亮氨酸残基，位置52甘氨酸残基，位置53脯氨酸残基，位置55亮氨酸残基，位置58亮氨酸残基，位置59苯丙氨酸残基，位置62半胱氨酸残基，位置66苯丙氨酸残基，位置69赖氨酸残基，位置70苏氨酸残基，位置77谷氨酖胺残基，位置79异亮氨酸残基，位置86组氨酸残基，位置93精氨酸残基，位置94天冬氨酸残基，位置96赖氨酸残基，位置97脯氨酸残基，位置99天冬酰胺残基，位置100苯丙氨酸残基，以及位置101为亮氨酸残基；c.位于第二区下游的第三区，从位置l的天冬氨酸残基开始，且其位置5为丙氨酸残基，位置6赖氨酸残基，位置8酪氨酸残基，位置10天冬氨酸残基，位置13苏氨酸残基，位置16组氨酸残基，位置17异亮氨酸残基，位置18脯氨酸残基，位置19酪氨酸残基，位置20精氨酸残基，位置23赖氨酸残基，位置27甘氨酸残基，位置28苏氨酸残基，位置29丙氨酸残基，位置30精氨酸残基，位置31酪氨酸残基，位置33丝氨酸残基，位置35天冬酰胺残基，位置37组氨酸残基，位置39甘氨酸残基，位置41谷氨酸残基，位置43丝氨酸残基，位置44精氨酸残基，位置45精氨酸残基，位置46天冬氨酸残基，位置47天冬氨酸残基，位置49谷氨酸残基，位置52甘氨酸残基，位置57酪氨酸残基，位置58苯丙氨酸残基，位置63亮氨酸残基，位置64脯氨酸残基，位置65色氨酸残基，位置66谷氨酰胺残基，位置67甘氨酸残基，以及d.位于第三区下游的第四区，从位置1的脯氨酸残基开始，且其位置12为精氨酸残基，位置14亮氨酸残基，位置16苯丙氨酸残基，位置20脯氨酸残基，位置21天冬氨酸残基，位置22酪氨酸残基，位置41天冬氨酸残基，位置45天冬氨酸残基，以及位置46色氨酸残基。全文摘要由酪蛋白激酶胁迫相关多肽(CKSRP)的编码核酸转化的转基因植物，其中核酸序列在植物中的表达使其相对于该植物野生型对环境胁迫的耐受性增强。本发明还提供了由该转基因植物产生的包括种子在内的农产品。还提供了分离的CKSRP、分离的CKSRP编码核酸以及含有后者的载体和宿主细胞。文档编号C07K14/415GK101102665SQ200580046694公开日2008年1月9日申请日期2005年11月17日优先权日2004年11月17日发明者A·雪莉,D·艾伦,L·V·米尔斯,N·范蒂伦,O·达寇斯塔伊希尔法,陈若英申请人:巴斯福植物科学有限公司