专利名称：靶向csnk2a2抗ev71、乙脑及流感病毒寡核苷酸的结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向酪蛋白激酶2，α原肽(CSNK2A2, casein kinase 2， alpha prime polyp印tide)治疗 EV71(肠道病毒 71 型)病毒(Human enterovirus 71)。感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
背景技术：
病毒性疾病感染危害严重，尤其是EV71病毒、脑炎病毒、流感病毒。EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。其它同属于肠病毒群之病毒尚包括小儿麻痹病毒(Polioviruses ；具3种型别)、柯萨奇病毒(Coxsackieviruses ；A型具23种型别、B型具6种型别)、伊科病毒(Echoviruses ；具 31种型别)及肠病毒(Enteroviruses 68 72型)。肠道病毒71型(英文名为Human enterovirus 71)。简称EV71。1957年，新西兰首次爆发大规模疫情并报道。1958年，首次 ^1 ^!^ '^! (Coxsackieviruses)。 1959 $，(hand—foot and mouth disease ；HFMD)的命名。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。人是肠道病毒唯一的传染来源，人群对肠道病毒EV71 普遍易感，感染后可获得免疫力。由于不同病原型别感染后抗体缺乏交叉保护力，因此，人群可反复感染发病。而且，该病易于传播，容易发生流行，预防控制难度大。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利等国家相继暴发以中枢神经系统疾病为主要临床特征的EV71型手足口病流行，并导致较高的病死率和致残率。1997年以来，EV71感染为主的手足口病在马来西亚、中国台湾、新加坡等地大规模暴发流行。1998年中国台湾发生迄今最大的一次主要为EV71型手足口病流行，共报告129106例手足口病或疱疹性咽峡炎病例，其中重症患1405 例，死亡78例。中国内地自1981年在上海始见本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北及广东等十几个省市均有EV71型手足口病的发生和流行。特别值得注意的是近年来本病流行有蔓延增多趋势。2008年3月10日至5月31日短短时间内安徽阜阳共报告手足口病7470例，共发现111例重症病例，其中死亡23例，病死率0. 31%。目前肠病毒感染除了小儿麻痹病毒有疫苗外，其余肠病毒感染并无特殊治疗药物，故临床上对无并发症患者之治疗只能采取支持性疗法，而对有并发症的患者也只能对症治疗，采取一些降颅压、降温、辅助抗病毒等的治疗。目前为止抗EV71病毒的治疗药物只有利巴韦林等广谱抗病毒药物，但抗病毒疗效一般。所以，有效的预防和控制EV71病毒的方法已成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒的药物对治疗与预防手足口病具有重要的显示意义。流行性乙型脑炎是亚洲一种最常见的经虫媒传播的人畜共患的病毒性脑炎，据统计，乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)每年至少造成至少50000例临床病例，其中多数为十岁以下儿童，导致约10000人死亡，有15000人左右留有神经精神性后遗症。但是目前还没有针对乙脑的特异性治疗方法，接种疫苗仍是唯一最重要的控制措施， 目前临床尚无特效的治疗药物。流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。 甲型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流感〃在全球范围内造成了 2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2) 所致的"亚洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感病毒(HlNl)所致的"俄罗斯流感"、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV， avian influenza virus)，以及2009年出现的甲型流感病毒感染，都严重威胁了人们的健康和正常生活。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。由于流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺 (remantadine)对人体内流感病毒几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如达菲和帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒的方法已成当务之急。根据以上分析，研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的药物对治疗与预防这些病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。经研究已经证实，酪蛋白激酶2，α原肽(CSNK2A2)是抗肿瘤药物的重要靶点之一。CSNK2A2表达过多可以促使凋亡的发生，抑制CSNK2A2的表达可以减少细胞的凋亡。目前，有报道发现CSNK2A2抑制剂有影响雄性生殖细胞的功能和抗白血病的作用，但还没有抗EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的报道。EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒感染都能够引起细胞病变凋亡，抑制CSNK2A2的表达可以减少细胞的凋亡，因此，设想研究出抑制CSNK2A2蛋白表达的核酸药物可能具有抗EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的作用，从而对EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒等感染相关疾病的治疗起到良好的效果。核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15 30个核苷酸。 通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CSNK2A2阻断EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒复制、抑制这些病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。本研究的内容是结合抗EV71的人的基因表达谱(表达谱编号GSE16358)和 HPRD(人蛋白相互作用网络)，利用子网辨识的方法设计了一个含100多个节点的核心子网，然后选择拓扑上的重要节点筛选出基因CSNK2A2。利用网上服务器Soligo设计了 5条针对CSNK2A2的反义寡核苷酸，从设计的这5条20个碱基长度的反义寡核苷酸序列中进行初步筛选。结果显示CSNK2A2-3抑制病毒所致细胞病变作用最佳。在RD细胞系中以CSNK2A2-3 为代表进一步评价了抑制EV71病毒复制和致细胞病变的特性。而且，对CSNK2A2-3抑制乙脑病毒及流感病毒感染的作用评价结果显示CSNK2A2-3也能剂量依赖且序列特异性地抑制乙脑病毒及流感病毒的致细胞病变作用，提示CSNK2A2-3也可发展成为治疗乙脑病毒或流感病毒的新型药物。表1反义寡核苷酸的分子设计
权利要求
1.与csnk2a2mrna互补的寡核苷酸，分布在5’非编码区、编码区和3’非编码区，其长度是10-30个碱基。
2.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构选自下列之1)actctctcattgttggtgat2)ttccaccacgaaggttctcc3)gtgtctttgacacggggtcc4)gtggatctaggtctatgtga5)tcggaagtgaggtttgatat6)aaggaccccgtgtcaaagacac7)aggaccccgtgtcaaagacacc8)gtctttgacacggggtcc9)gtgtctttgacacggggt10)tgtctttgacacggggtcι Dgtgtctttgacacggg12)ctttgacacggggtcc13)gtctttgacacggggt14)tgtctttgacacgggg15)tctttgacacggggtc16)gtgtctttgacacg17)ttgacacggggtcc18)tctttgacacgggg19)gtctttgacacggg20)ctttgacacggggt21)tgtctttgacacgg22)tttgacacggggtc
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构选自下列之一1)gtgtctttgacacggggtcc2)gtctttgacacggggtcc3)gtgtctttgacacggggt4)tgtctttgacacggggtc5)gtctttgacacggggt
4.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构如下 gtgtctttgacacggggtcc。
5.根据权利要3所述的寡核苷酸，其特征为所述的反义寡核苷酸包含了与 gtgtctttgacacggggtcc具有60%及其以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。
6.根据权利要求1-5所述寡核苷酸，其特征是该反义寡核苷酸经过不同化学修饰。
7.根据权利要求6所述寡核苷酸，其化学修饰为硫代修饰、脂肪链修饰。
8.权利要求1-7中所述的任一寡核苷酸或其组合在制备治疗和预防EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染及其相关性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现靶向酪蛋白激酶2，α原肽，同时具有抗肠道病毒71型、乙型脑炎病毒及流感病毒的反义寡核苷酸的结构以及这些反义寡核苷酸在制备治疗EV71、乙脑病毒及流感病毒感染及其相关性疾病的药物中的用途。
文档编号A61P31/16GK102296066SQ20111018864
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者伯晓晨, 何丽娜, 刘娟, 张莉, 李康, 杨静, 王升启 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所