抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和 应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤标志物（Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正 常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它 们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以 帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
[0003] 在与恶性肿瘤的斗争中，医生、患者和家属往往最关心的是如何尽早发现肿瘤的 产生、发展、转移。X线诊断机、CT机、MRI机等诊断仪器和技术的发展，使得目前已能够发 现直径> 5mm的肿瘤，对早期检出肿瘤和评价治疗效果、帮助医生修改治疗方案提供了有 力的支持。但是，仍然有一部分肿瘤的"残渣余孽"因为其体积太小或位于体内特殊位置而 难以被识别出来，这些"漏网之鱼"在暗处悄悄长大，导致肿瘤复发、转移，最终夺去了不少 患者的生命。那么，有没有其他办法帮助识别出这些潜在的威胁呢？答案就是一类重要指 标，即目前在临床诊治中广泛应用的"肿瘤标记物"。它们是一类能通过化验血液、尿液或肿 瘤组织查出、并反映体内肿瘤情况的物质，与以上所述的影像学形态检查方法相比，可称之 为"无形表象"，是对形态诊断的有力补充。
[0004] 广义来说，肿瘤标记物是某些肿瘤细胞上存在或分泌、排出到体液中的物质，可大 致分为肿瘤细胞分泌物和肿瘤细胞表达物两类。前者是肿瘤细胞在发生、发展中产生的物 质，肿瘤生长越旺盛、其量越多，反之，肿瘤生长被压制、其产生量也减少。这些物质往往是 糖蛋白，可以通过检验血等体液查出并进行监测。目前常用的有肺癌肿瘤标记物群（CEA、 Cyfra21-1、NSE 等）、消化道肿瘤标记物群（CEA、CA199、CA242、CA724 等）、CA153 (乳腺癌 等）、CA125 (卵巢癌等）、AFP (肝癌等）、PSA (前列腺癌等）、HCG (绒癌等）[Tannous BA， Teng J(2011) "Secreted blood reporters ：Insights and applications"Biotechnol Adv. 29(6) :997_1003 ;Khunger M，Kumar U，Roy HK，Tiwari AK. (2014) "Dysplasia and cancer screening in21st century. ''APMIS 122(8) :674_682 ;Grunnet M? Mau- Sorensen M. (2014) "Serum tumor markers in bile duct cancer-a review. ''Biomarkers 19(6)： 437-443 ；Napier KJ， Scheerer M， Misra S. (2014) "Esophageal cancer ：A Review of epidemiology，pathogenesis，staging workup and treatment modalities. ''World J Gastrointest Oncol 6(5) :112_120. ]D它们往往在肿瘤很小时即可被检测出来，有助于早 期发现病灶；则提示疗效可能不佳；如手术切除肿瘤一段时间后标记物进行性升高，则往 往提示体内可能已经有肿瘤细胞增殖、生长，如在治疗后明显降低，则提示治疗有效，反之， 需严密监视。
[0005] 因此，有经验的肿瘤科医生往往会在对患者做影像检查、评估瘤体大小的同时抽 血检查、动态观察相应标记物，以了解肿瘤生长是否仍然活跃、治疗后其活性是否被抑制 等。它们的特点是反映灵敏、往往能早于CT、MRI等手段早期判断肿瘤生长状态，提醒医生 是否需要更换治疗方案；弱点是准确性较低、不如影像学诊断可靠，所以，往往需要共同检 验几个标记物、动态观察其变化、并结合其他临床表征做出判断。肿瘤标志物检测临床上常 用于：（1)早期预警肿瘤发生、发展；（2)动态监测以反映治疗效果；（3)在无法取得肿瘤标 本、明确病理诊断时对肿瘤性质做出某些提示、为试验性治疗提供参考依据。
[0006] 人癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA)是一种酸性糖蛋白，可广泛存在 于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，最初发现于结肠癌和胎 儿肠组织中，故名癌胚抗原。癌胚抗原是在胚胎时胃肠道、肝、胰腺合成的一种蛋白质。在 成年人胃肠道中也有少量合成，但不进入血液系统而是通过胃肠道排出，因此，在正常成年 人血清中只有微量的癌胚抗原。
[0007] 癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，CEA升 高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系 统的肿瘤[Grunnet M，Sorensen JB. (2012) "Carcinoembryonic antigen (CEA) as tumor marker in lung cancer. " Lung Cancer 76(2) : 138-43 ;Nagai Y，Beppu T，Sakamoto Y， et al. (2014) "Carcinoembryonic Antigen Half-life Is an Early Predictor of Therapeutic Effects in Induction Chemotherapy for Liver Metastases from Colorectal Cancer. ''Anticancer Res. 34(10) :5529_35;Chao YJ，Sy ED，Hsu HP，Shan YS. (2014) "Predictors for resectability and survival in locally advanced pancreatic cancer after gemcitabine-based neoadjuvant therapy. " BMC Surg.14 ： 72.]。此外，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预估计，CEA也是一个 较好的肿瘤标志物。
[0008] 癌旁正常粘膜CEA含量很少或为阴性。以胃癌为例，胃癌的CEA阳性率为85. 58%; 而其中胃粘液腺癌及印戒细胞癌（又称粘液细胞癌）的CEA阳性率为100% [Chung JK， Lee MC，Chung HK，Lim SM，Jang JJ，Koh CS(1995) "Concentration and distribution of tumor associated antigens TAG-72and CEA in stomach cancer. ''Ann Nucl Med. 9 (1)： 7-13.]。癌细胞质内CEA含量较多的原因与癌细胞CEA合成增加及CEA排出受阻有关。当 癌细胞变性坏死时，细胞内膜结构受损破裂，CEA可出现在胞质的基质内。粘液细胞癌CEA 分布在整个细胞膜和胞浆的膜结构中，CEA抗原决定基为糖蛋白，而肿瘤细胞的浸润和转移 均与细胞膜糖蛋白的糖基化改变也有关。另外粘液细胞癌还能分泌释放大量蛋白水解酶， 破坏癌细胞钙桥，溶解癌巢周围软组织。因此胃粘液细胞癌侵袭力强，转移率高。
[0009] 目前，基于CEA的影像学诊断尚未报道和应用。因此，获得能检测CEA蛋白的抗体 对于多种肿瘤的检测、影像学诊断和治疗显得非常有意义。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种抗人癌胚抗原抗体，该抗体为全人源抗人癌胚抗原抗体，与人 癌胚抗原具有高亲和力，能用于检测和治疗人体癌症疾病。
[0011] 一种抗人癌胚抗原抗体（简称抗人CEA蛋白抗体），包括重链可变区和轻链可变 区，所述重链可变区的三个高变区⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3的氨基酸序列分别为:GFAVSSN、 HRSGN、VPGFSRGQYEESWYFDL其轻链可夺厌的三个高夺厌CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列 分别为RASQSIDSYLN、GASNLRN、HQAYSPFT。
[0012] 其中，重链可变区的三个高变区⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3分别位于重链可变区的第 26~32位、第52~56位和第98~114位；轻链可变区的三个高变区⑶RL1XDRL2、⑶RL3 分别位于轻链可变区的第24~34位、第50~56位和第89~96位。
[0013] 在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性，而高变区之 间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的 互补，因此又被称为互补决定区（CDR)，不同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。
[0014] 优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述轻链可变区的氨 基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
[0015] 所述的抗人癌胚抗原抗体可以是全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述的全抗体 优选为IgGl型；所述的抗原结合部分优选为Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段或单链抗 体，更优选为单链抗体。
[0016] 抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域，又避免了 Fc片段的抗原性而 引起的副作用；其中单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度，免疫原性小，在体内循 环的半衰期短、易于清除，易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等 优点。
[0017] 抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促/化学裂解全抗体来制备。本发 明【具体实施方式】中以抗人癌胚抗原（CEA)单链抗体为例，其制备方法为：采用公开号为CN 1444651 A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛 选抗人CEA蛋白抗体。
[0018] 本发明还提供了所述的抗人癌胚抗原抗体的编码基因，具体地，重链可变区编码 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，轻链可变区编码基因如SEQ ID No. 4所示。
[0019] 本发明还提供了一种包含所述的编码基因的重组载体或表达系统。所述重组载体 的原始载体为PACT2或pET27b。
[0020] 本发明还提供了所述的抗人癌胚抗原抗体在制备肿瘤体外诊断试剂或肿瘤影像 诊断试剂中的应用。本发明抗人癌胚抗原抗体能够特异性地结合人癌胚抗原，可用于肿瘤 病人血清样本CEA肿瘤标志物的检测；也可将抗人癌胚抗原抗体注入人体内通过影像诊断 对肿瘤进行影像检测。
[0021] 其中，在上述两种应用中，所述人癌胚抗原是一种广谱性的肿瘤标志物，可用于多 种肿瘤疾病的检测和预防，例如：大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、 甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤等。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0023] 本发明抗人癌胚抗原抗体是一种既能用于检测多种肿瘤、也能治疗和预防人体疾 病的全人源抗人癌胚抗原抗体，具有非常高的亲和力，能够特异性结合人癌胚抗原，有效检 测多种肿瘤，对治疗相关肿瘤具有重要作用。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明抗人CEA蛋白单链抗体的结构示意图；
[0025] 图2为本发明抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-A的特异性ELISA分析；
[0026] 图3为本发明抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-A ELISA法检测多种肿瘤病人血清的 结果；
[0027] 图4为本发明抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-A检测小鼠肿瘤模型的影像结果；
[0028] A为白光条件下肿瘤模型裸鼠的照片；
[0029] B为在暗室中用620nm激发光观察人CEA的单链抗体hCEA-