专利名称：：GmPGIP3蛋白及其编码基因在培育抗根腐病和抗全蚀病植物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及GmPGIP3蛋白及其编码基因在培育抗根腐病和抗全蚀病植物中的应用。
背景技术：
：小麦根腐病是小麦生产上ー种难以防治的世界性小麦土传病害。近年来，在ー些地区小麦根腐病害已经由次要病害上升为主要病害，如我国华北麦区、黄淮麦区和东北麦区许多麦田均发现因根腐病造成的枯白穂。小麦根腐病是多元性复合侵染的病害，主要病原菌为禾旋孢腔菌[无性态为Bipolarissorokiniana(Sacc.ExSorok.)Shoem.，有性态为Cochliobolussativus(ItoetKurib.)Drechsl]。小麦根腐病是全生育期典型的多阶段性病害，从苗期到抽穗结实期都能发生。一般减产10%30%，严重地块减产超过50%。不仅如此，受害小麦的品质和商品价值也有很大损失。目前，生产上缺乏对小麦根腐病有效的化学药剂，化学防治效果较差。小麦根腐病的抗性遗传背景复杂，抗病种质资源较少且至今未找到免疫品种，抗根腐病小麦常规育种进展缓慢。因此，发掘、利用重要的抗病相关基因，开展抗根腐病的小麦基因工程育种非常重要。小麦全蚀病又称立枯病、黑脚病，是由子囊真菌--禾顶囊壳禾谷变种Gaeumannomycesgraminisvar.graminis(Sacc.ノWalkerJ和禾顶囊J=C小麦变种Gaeumannomycesgraminis(Sacc.MrxetOlivervar.tritici(Sacc.)Walker弓丨起的典型根部病害，是小麦的毁灭性病害，引起植株成簇或大片枯死，降低有效穗数、穗粒数及千粒重，造成严重的产量损失。该病在小麦苗期和成株期均可发生，以快成熟时病株症状最为明显，表现点片麦芒和麦穗发白。该病与小麦其他根腐型病害区别在于种子根和次生根变黑腐败，茎基部生有黑膏药状的菌丝体。该病原菌寄主范围较广，能侵染10多种栽培或野生的禾本科植物，如小麦、大麦、黒麦、燕麦、水稻等。目前，生产上缺乏对小麦全蚀病有效的化学药剂，化学防治效果较差。由于小麦根腐病和全蚀病属于土传病害,培育和利用抗病品种是防治小麦根腐病和全蚀病最经济有效的措施之一。目前，生产上大面积推广品种和育种材料对根腐病、全蚀病的抗性普遍较差，常规抗病育种进展缓慢，一方面是由于这些土传病害的抗性鉴定和选择比较困难，单株选择很不可靠；另一方面是缺乏高抗根腐病、全蚀病的小麦种质资源。因此，通过常规育种手段很难有效进行小麦根腐病、全蚀病的抗性育种。多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibitingprotein,PGIP)是ー种富含亮氨酸重复区域的细胞壁结合蛋白，能特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醒酶(endopolygalacturonases,PGs)活性。大豆的PGIP蛋白分为四个家族,分别命名为GmPGIPト
发明内容本发明的目的是提供GmPGIP3蛋白及其编码基因在培育抗根腐病和抗全蚀病植物中的应用。本发明提供了ー种培育转基因植物的方法，是将GmPGIP3蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。所述抗病可为抗根腐病和/或抗全蚀病。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，如小麦品种扬麦18。所述根腐病致病菌具体可为为平脐螺孢菌(Bipolarissorokiniana)。所述全蚀病致病菌具体可为Gaeumannomycesgramimsvar.tritici(Ggt)。所述GmPGIP3蛋白的编码基因具体可为如下I)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。所述编码基因具体可通过重组表达载体导入所述目的植物中。所述重组表达载体可为将所述GmPGIP3蛋白的编码基因插入单子叶植物表达载体PAHC25的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将所述GmPGIP3蛋白的编码基因插入单子叶植物表达载体PAHC25的SmaI和SacI酶切位点间得到的重组质粒。本发明还保护所述GmPGIP3蛋白或所述GmPGIP3蛋白的编码基因在培育抗病植物中的应用。所述抗病可为抗根腐病和/或抗全蚀病。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，如小麦品种扬麦18。所述根腐病致病菌具体可为为平脐婦抱菌(Bipolarissorokiniana)。所述全蚀病致病菌具体可为Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggtノ。本发明还保护ー种重组表达载体，为将所述GmPGIP3蛋白的编码基因插入单子叶植物表达载体PAHC25的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将所述GmPGIP3蛋白的编码基因插入单子叶植物表达载体PAHC25的SmaI和SacI酶切位点间得到的重组质粒。发明人构建了GmPGIP3蛋白的编码基因的单子叶高效表达载体，将其导入小麦后，可以得到抗根腐病、全蚀病的转基因小麦。本发明对于抗病植物的育种均有重大价值。图I为单子叶植物表达载体pAHC25的结构示意图。图2为重组质粒pA25_GmPGIP3的结构示意图。图3为转GmPGIP3基因株系T2代植株的基因水平PCR鉴定电泳图。图4为转GmPGIP3基因株系T2代植株的基因水平Southern杂交鉴定結果。图5为转GmPGIP3基因株系T2代植株的转录水平鉴定結果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。小麦品种扬麦18:购自江苏里下河地区农业科学研究所。实施例中所用的小麦根腐病致病菌为平脐螺孢菌(Bipolarissorokiniana),购自中国农科院植物保护研究所。实施例中所用的小麦全蚀病致病菌为Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt),购自西北农林科技大学。单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第I个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、⑶S、Nos终止子，⑶S两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子；又称pAHC25质粒；结构示意图见图I):參考文献ChristensenandQuail,1996;Uoiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionoiselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5,213-218;由作者之ー赠送，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。大豆品种中黄13:中国农业科学院作物科学研究所。实施例I、转GmPGIP3基因植物的获得一、重组表达载体的构建I、根据GmPGIP3基因cDNA序列设计ー对引物如下GmPGIP3-F:5/-ATGTCAAAGTTAAGCATTCT-3'；GmPGIP3-R:5/-TTAAGTGCATGGTGGAAGAG-3'。2、提取大豆品种中黄13叶片的总RNA，并反转录为cDNA。3、以步骤2的cDNA为模板，用GmPGIP3_F和GmPGIP3_R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的测序结果如序列表的序列2所示。4、以步骤3的PCR扩增产物为模板，用GmPGIP3_SMAF和GmPGIP3_SACR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。GmPGIP3-SMAF:5/-ATCCCGGGATGTCAAAGTTAAGCATTCT-3;；GmPGIP3-SACR:5/-GTGAGCTCTTAAGTGCATGGTGGAAGAG-3'。5、用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切步骤4的PCR扩增产物，回收酶切产物。6、用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切单子叶植物表达载体pAHC25，回收载体骨架(约7700bp)。7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒pA25-GmPGIP3。根据测序结果，对重组质粒pA25-GmPGIP3进行结构描述如下将单子叶植物表达载体pAHC25的SmaI和SacI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的GmPGIP3基因)。重组质粒pA25-GmPGIP3的结构示意图见图2。重组质粒pA25_GmPGIP3中，GmPGIP3基因表达受Ubi启动子(组成性启动子)控制,另外还具有I个受Ubi启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续选择利用双丙胺膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性。ニ、转GmPGIP3基因小麦的获得I、将1200块扬麦18的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pA25-GmPGIP3轰击到愈伤组织。(I)将愈伤组织在高渗透培养基(SD2培养基+0.2mol/L甘露醇+0.2mol/L山梨醇)上进行渗透处理4-6h(25°C，暗培养)将愈伤组织放置在培养皿中央直径约2.5cm范围内，每盘培养皿50块愈伤组织。(2)用重组质粒pA25-GmPGIP3包裹直径IlOiim金粉，采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Red公司生产)，选择IlOOPsi的可裂膜,载样距祀材料6cm进行轰击。(3)轰击后的愈伤组织继续在原培养基上培养16_18h(25°C，暗培养)。2、将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基+lmg/LVBl+150mg/L天冬门酰胺+2mg/L2,4-D)上，恢复培养2周(25°C，暗培养)。3、将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+lmg/La_萘こ酸+lmg/L激动素+4mg/L双丙胺膦)中，24-26°C光照培养14_21d。4、将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+2mg/L双丙胺膦)，24-26°C光照培养14-28天，获得了100株生根的再生植株。5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/La_萘こ酸)上，24_26°C光照培养约21天。6、将苗高7-8cm且根系发达的植株移栽到花盆，在移栽到温室3周以后，有95株植株成活(Ttl代)。7、将Ttl代植株自交并收获种子(T1代种子)，将T1代种子培育为T1代植株，将T1代植株自交并收获T2代种子，将T2代种子培育为T2代植株。8、基因水平的PCR鉴定分别将T1代植株、T2代植株和扬麦18(WT)进行如下鉴定在4叶期，每株植株取I个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，采用巢式PCR鉴定GmPGIP3基因。第一次PCR扩增的引物对如下PUBI-1910U:5'-GCTCTGCCTTCATACGCTA-3'(位于载体启动子3'端)；TN0S-TR4:5'-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3'(位于TNOS终止序列)。第一次PCR扩增的參数如下94°C3min；94°C45s、58°C45s,72°C90s，30个循环；72°C5min。第二次PCR扩增的引物对如下GMPG-OU:5'-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3'；GMPG-OL:5'-GACAAGTCCACGAACGCCA-3'。第二次PCR扩增的參数如下94°C3min；94°C40s、58°C40s、72°C35s，35个循环；72°C5min。巢式PCR扩增产物进行I.8%琼脂糖凝胶电泳，显示约351bp条带的为阳性植株。其中T2代植株PCR鉴定均为阳性的T1代植株为纯合的转GmPGIP3基因植株，共得到5个纯合的转GmPGIP3基因株系(分别命名为T908株系、T909株系、T910株系、T912株系和T913株系)。5个转GmPGIP3基因株系T2代植株的PCR鉴定电泳图为见图3。图3中M=IOObpDNAladder；CK:水；P:重组质粒pA25_GmPGIP3；WT:扬麦18；1:T908株系；2Τ909株系；3Τ910株系；4Τ912株系；5Τ913株系。9、基因水平的Southern杂交鉴定将4个转GmPGIP3基因株系的T2代植株和扬麦18(WT)分别进行如下鉴定(I)提取植株的基因组DNA；(2)用限制性内切酶DraI消化30μg步骤(I)得到的基因组DNA;(3)将步骤(2)的产物进行O.8%琼脂糖凝胶电泳，然后进行Southern杂交(采用的探针为a-32P-dCTP标记的序列表的序列2所示的GmPGIP3基因)。结果见图4。图4中=WT:扬麦18;1:T908株系；2:Τ909株系；3:Τ912株系；4:Τ913株系；Ρ:重组质粒pA25-GmPGIP3；Μ:λDNA/HindIIImarker。结果显示，T908株系、T909株系、T912株系和T913株系为4个不同转基因事件产生的转基因后代。以上结果表明GmPGIP3基因在转基因小麦中可以遗传，并整合到转基因小麦基因组的不同部位。10、转录水平鉴定将5个转GmPGIP3基因株系的T2代植株和扬麦18(WT)分别进行如下鉴定(I)提取植株的总RNA；(2)将步骤(I)的总RNA反转录为cDNA，用Actin基因特异引物对(ACT_A:5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3，;ACT-B:5，-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3，)调整各样本cDNA模板量均一化。(3)以步骤(2)的cDNA为模板，用GmPGIP3基因特异引物对(GMPG_QF:5’-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3’;GMPG-QR:5’-GACAAGTCCACGAACGCCA-3’)进行半定量RT-PCR表达分析。反应条件94°C预变性3min；94V30s、50°C30s、72°C30s,共35个循环；72°C延イ申5min。结果见图5A。在5个株系中，GmPGIP3基因均得到了表达。(4)以步骤(2)的cDNA为模板，用GmPGIP3基因特异引物对(GMPG_QF:5，-CCTAATCGGTCAAATCCCCT-3’；GMPG-QR:5’-GACAAGTCCACGAACGCCA_3’)在ABIPRISMR7300实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析。以Actin基因为内參(ACT-A:5，-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3，；ACT_B:5，-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3，)。反应条件94°C预变性Imin;94°C变性15s、60°C退火31s、45个循环。结果见图5B。在5个株系中，GmPGIP3基因均得到了高效表达。以上结果表明，5个抗根腐病的转基因小麦株系均可在RNA水平超量表达GmPGIP3基因。三、转空载体小麦的获得按照步骤ニ的方法，用单子叶植物表达载体pAHC25代替重组质粒pA25_GmPGIP3，得到转空载体小麦。实施例2、转GmPGIP3基因植物的根腐病抗性鉴定将实施例I得到的转GmPGIP3基因小麦的T2代植株(每个株系10株)、实施例I得到的转GmPGIP3基因小麦的T1代植株(每个株系20株)、实施例I得到的转空载体小麦的T2代植株(姆个株系10株)、实施例I得到的空载体小麦的T1代植株(姆个株系20株)和扬麦18(WT)(20株)分别进行如下鉴定在小麦分蘖盛期，将ー根布满小麦根腐病致病菌的牙签和一粒布满小麦根腐病致病菌的麦粒一起嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态；接种后喷水保湿5-7天，于蜡熟期进行病情调查。按照0-4级标准划分小麦根腐病的病级(IT)0级(IT0):全株无病；I级(ITI):叶鞘有少量病斑，MK1/4；M1=叶鞘上的病斑面积/叶鞘的表面积；2级(IT2):病菌侵入茎杆，1/4^M2C1/2；M2=茎杆上的病斑面积/茎杆的表面积；3级(IT3):病菌侵入茎杆，1/2含M2<3/4；M2=茎杆上的病斑面积/茎杆的表面积；4级(IT4):病菌侵入茎杆，M2^3/4，茎杆已软腐；M2=茎杆上的病斑面积/茎杆的表面积。病情指数Pi(0Z70)=(Oxxc^ixxjsxxjsxxjaxx4)/[(X0+X1+X2+X3+X4)]X4}XlOO；式中，XpXpXpXpXA分别表示0级、I级、2级、3级、4级茎杆数。结果见表I。表I转GmPGIP3基因小麦、转空载体小麦和扬麦18的根腐病病情指数(平均值)代数SI[itrWm,T908~T909l~T910IT912T913扬麦18_转空载体小麦T12520222022.34240T2222H.6!H.B2015.5■44.8"结果表明，扬麦18和转空载体小麦的病情指数没有显著差异，与扬麦18相比,转GmPGIP3基因小麦株系的群体对根腐病抗性显著提高。实施例3、转GmPGIP3基因植物的全蚀病抗性鉴定将实施例I得到的转GmPGIP3基因小麦的T2代种子(每个株系20粒)、实施例I得到的转空载体小麦的T2代种子(每个株系20粒)和扬麦18(WT)种子(20粒)分别进行如下鉴定将种子消毒、催芽后，移至已放入小麦全蚀病致病菌菌饼的花盆中(每粒种子ー个花盆，基质为I质量分河沙和2质量分营养土的混合物)，培养3个星期后拍照并对如下指标进行鉴定测量单株的总根长和黑(病)根长，计算黑根面积占总根面积的百分率(病根百分比)，据此将全蚀病严重度划分为五级(0-4级)0=0%,1=0-10%,2=10-30%,3=30-60%,4=60-100%。全蚀病情指数(TAI)WOXno+lOXni+SOXr^+eOXr^+lOOXr^)/(+!^+++)，其中Iii为病级为i的株数。结果见表2。表2转GmPGIP3基因小麦、转空载体小麦和扬麦18的全蚀病病情指数(平均值)权利要求1.ー种培育转基因植物的方法，是将GmPGIP3蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述抗病为抗根腐病和/或抗全蚀病。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述GmPGIP3蛋白的编码基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中。5.如权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。6.GmPGIP3蛋白或所述GmPGIP3蛋白的编码基因在培育抗病植物中的应用；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述抗病为抗根腐病和/或抗全蚀病。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述GmPGIP3蛋白的编码基因是如下I)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。9.如权利要求6至8中任一所述的应用，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。10.一种重组表达载体，为将GmPGIP3蛋白的编码基因插入单子叶植物表达载体PAHC25的多克隆位点得到的重组质粒；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。全文摘要本发明公开了GmPGIP3蛋白及其编码基因在培育抗根腐病和抗全蚀病植物中的应用。本发明提供的方法，是将GmPGIP3蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；所述GmPGIP3蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。发明人构建了GmPGIP3蛋白的编码基因的单子叶高效表达载体，将其导入小麦后，可以得到抗根腐病、全蚀病的转基因小麦。本发明对于抗病植物的育种均有重大价值。文档编号C12N15/82GK102649813SQ20121015060公开日2012年8月29日申请日期2012年5月15日优先权日2012年5月15日发明者党良,张增艳,徐慧君,杜丽璞申请人:中国农业科学院作物科学研究所