专利名称：小立碗藓抗逆基因PpCor166及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和细胞系的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗逆基因 尸/7Cw766及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。
背景技术：
低温、千旱、高盐是限制植物生长发育、地理分布、形态建成等的重要环境 胁迫因素。这些胁迫因素作用的结果均导致植物细胞失水，影响植物细胞的渗透 压，进而影响植物正常的生理代谢，严重时导致植物的死亡。通过对一些模式植 物的研究发现这三种胁迫因素诱导表达的功能蛋白及转录因子相互交差，因此， 寻求同时具有忍耐低温、干旱、高盐胁迫的绿色植物来研究植物的非生物胁迫极 有必要。
对苔藓植物的基础研究标明苔藓植物是极地低温度环境的先锋植物之一， 同时它也分布在极端干旱的沙漠。在漫长的生物进化历程中，莒藓植物形成了一 套独特的适应低温干燥等恶劣环境的机制。对小立碗藓非生物胁迫研究发现(Frank 等，2005),与其他高等植物相比，小立碗藓(PhyscomytrellaPateuts)可以忍耐极 端的生态环境。如，拟南芥在100mM的NaCl处理下即受到伤害(Sunkar等，2003 )， 而小立碗藓可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐渐提高的盐处理条件下， 小立碗藓可以忍耐600mM的NaCl胁迫。500mM的山梨醇处理三天后，小立碗藓 仍可以幸存。当小立碗藓失水92%时仍可恢复正常生长发育。在脱水、盐渍和渗 透胁迫条件下，Frank等(2003)分析鉴定了一系列上调基因，其编码的蛋白主要有 胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase)、甜菜碱(glycine betaine)、三氢晚咯羧酸盐
(deltall-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、 钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAP kinase)等。在0。C低温胁迫七天后小立碗藓仍可恢复生长(Minami等，2005),且 在冷驯化过程中激活了 LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的转录，提高了其冰 冻耐受能力。
因此从苔藓植物中克隆抗逆相关基因并进一步通过转基因等技术应用于提高 农作物的抗逆性是目前研究的热点之一。
发明内容
为了解决上述问题提出并完成了本发明。 本发明的目的是提供一种高效的抗逆相关基因。 本发明的另一目的是提供上迷基因编码的蛋白质。 本发明的再一目的是提供含有上述基因的栽体。 本发明的再一目的是提供表达上述基因的转基因细胞系。
具体地，本发明的发明人将培养至15叶左右的小立碗藓茎叶体在ox:下处理
48小时，然后通过RT-PCR方法获得了一种具有显著抗逆特性的基因一小立碗藓 抗逆基因尸pCor 66,其#序列如SEQ ID No.l所示。
进一步，本发明还提供了上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明的完成过程中，还提供了包含上迷基因的栽体、以及表达该基因的 转基因细胞系。
本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用 该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。
图1显示了尸/ Cor/66基因的RT-PCR分析结果。图2显示了 /^CoW66诱导表达特异性的Nothern Blot分析结果。
具体实施方式
一、尸; Cw766基因的制备1、小立碗藓的培养及冷胁迫处理将小立碗藓培养至15叶左右，移入0'C处理48小时，该基因在此时显著表达。 附小立碗藓培养基配方及制备微量元素配制成1000X母液，4。C存放。 固体基本培养基，加入浓度为0.8%琼脂粉。磷酸緩冲液的配制取25g KH2P04溶解于100 ml蒸馏水，用4 M KOH调整 pH7.0， 4'C存放。大量元素Ca(N03)2.4H20FeS04.7H20MgS04.7H20微量元素CuS04.5H20ZnS04'7H20H3B03MnCl2.4H20CoCl2-6H20KINa2Mo04.2H20 Glucose 酒石酸铵 磷酸盐緩沖液0.055 mg/L 0.055 mg/L 0.614 mg/L 0.389 mg/L 0.055 mg/L 0.028 mg/L 0.025 mg/L0.8 g /L 0.0125 g/L 0.25 g/L5g/L 0.5g/L lml/L2、总RNA的提取(热酚法)1) 从-80。C冰取出约10g的小立碗藓茎叶体，加入液氮，在-20。C预冷的高温 灭菌的研钵中充分研磨成细粉状；2) 分装到1.5ml预冷的eppendorf管中；3) 立即加入80'C预热的水饱和酚和快速抽提液各500ul,涡旋15s后置于水上；4) 4。C，13000rpm, 10min离心；5) 从每管中吸取上清液约450 ul至另一 1.5 ml预冷的含500 ul 24: 1的氯仿 异戊醇eppendorf管，满旋15s;6) 4。C， 13000rpm离心lOmin;7) 从每管中吸取上清液约400 ul至另一 1.5 ml预冷的eppendorf管；加入40ul 3.0M的NaOAC (1/10)及800ul (2倍)无水乙醇，颠倒数次，放于-80。C沉淀过夜；8) 次日4°C, 13500rpm离心15min，弃上清；9) 预冷的500ul 80%乙醇洗涤，4匸，13500rpm离心5min,弃上清，稍离心， 吸去残留的水分；10) 在超净工作台内，冰上风干10分钟去掉残留乙醇；11) 在超净工作台内，每管加入30ul预冷的DEPC处理水，吸打溶解，并将 提取的总RNA合并混匀。12) 紫外分析测定純度，电泳检测总RNA完整性。
附总RNA快速抽提液配方(IOO ml):2M LiCl lMTris HC1 0.5M EDTA 10%SDS ddH205 ml 10 ml 2 ml 10 ml 73 ml上述试剂均用0.1% DEPC处理水配制。 3、总RNA逆转录按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0操作说明书进行，反应体系为:MgCl210XRT緩冲液 无Rnase的dH20 dNTP混和物(各10mM) Rnase举卩制剂 AMV逆转录酶 Oligo dT-接头引物 模板RNA2jil0.25^U 0.5^10,5^1lO.Ojil反应参数45 °C, 30min; 99 'C, 5min; 51: ， 5min。4、尸; CorM(5基因全长的获得利用该基因的5'端序列设计引物5-CTTTAGCGCAGACCAAGGGG-3,采用 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0中的M13primerM4作下游引物，将上述oligodT-接头来源的冷胁迫mRNA逆转录产物为摸板，反应体系及条件如下RT模板 2^15XPCR緩冲液 2^1dH20 4.25jilTaKaRa五;cr", 0.05^1Ppcorl66up 0.1^1 M13primerM4 0.1 piCorl66 lp_0.5^1反应参数: 94 °C 94 °C 54 °C2 min 30sec 30sec1个循环35个循环72 "C 1 min5、 PCR产物的回收将PCR产物在1%琼脂糖上电泳，紫外灯下切取目的条带并切碎胶块后，按 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0操作(由TaKaRa生产)。6、 PCR产物的连接和转化取纯化后的PCR产物各1 pl，与Promega公司的pGEM -T easy vector连接(按照其产品说明书操作)。将连接产物热击转化入E.coliDH5 ct感受态细胞，挑选阳性克隆测序。 二、 i^Cw766基因的分子水平表达分析1 、尸/ CoW66基因的RT-PCR分析将从冷处理0、 12、 24、 48、 72h的小立碗藓总RNA(见前)，按TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0操作说明书分别逆转录成cDNA。用特异性引物及内标引物， 按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作说明书进行PCR。PCR反应体系cDNA产物 lOpl5XPCR緩冲液 10^1dH20 27.25nlTaKaRa ExTaqHS 0.25^1Corl66 up 0.5(ilCor 166 lp 0.5nlActin up 0.5}xlActin lp 0.5|il-OT^n-反应参数94'C 2min 1个循环9化30sec, 54匸30sec， 72'Clmin, 23个循环。 所用尸/ CoW66的引物为PPCorl66Up: 5' —- CGGAAC TGCCCAAGACAA—3' PPCorl66Lp: 5' — AACCCACTCCACTTTACTGCTT—曙3'所用actin引物为 Actin up: 5' —TGGGTCGTTATCGTCTTCTTCACA-—3';Actin lp: 5' —TCATCTTCTCCCTGTTCGCCTTC —-3' 尸/7Coa7^5基因的RT-PCR分析结果如图1所示。测序结果显示，该基因全长 892bp，具有504bp的开放阅读框，编码167氨基酸的蛋白质。通过BLASTx搜索， 发现与来自小麦的基因AY148492编码的蛋白质具有大于25。/o的同一性，认为二者 具有相似的功能，即该基因编码一个与抗逆相关的蛋白(LEA蛋白)。 尸pO W66基因具有以下核苷酸序列 3tgccgct33 gsgcgctscc ggasctgccc ssgacssggc tggcc33gct 50 ggggactacg C3sgctcs33 ggccc33gct gctssgtctg scgcttccg3 100 cgcgaccgga gctgcccagc acaaggcagg cgaagctact gatgctgcta 150 aggataccat cacagcgagt tggtgacaag actgctgacg ctgctggagc 200 tgcaaaggsc saggc3tatg aggccaagga cgccgcaggc gggsaggccs 250 gcgagacggg tggctacttg ggtgacaagg caaaccaggt caagggtacc 300 gctgctgatg ccgctggcgc cactcaggac aaggcttcgg gtttggcgac 350 caccgcccaa c3g33ggctg gtgssggtgc 333tt3tgcc ssagsgsctg 400 cggtgsgcgc ca3gg3cacc gctggasacg ttttgcsgcs g3ccggtg3t 450 gctgtggcca scgtsttcaa ccgcgcgsag gaaactgtc3 cccc333gcs 500 gt33 550其编码的蛋白质的氨基酸序列为Met Pro Leu Arg Ala Leu Pro Glu Leu Pro Lys Thr Arg Leu Ala Lys Leu Gly Thr Thr Gin Ala Gin Arg Pro Lys Leu Leu Ser Leu Thr Leu Pro Thr Arg Pro Glu Leu Pro Ser Thr Arg Gin Ala Lys Leu LeuMet Leu Leu Arg lie Pro Se Gin Arg Val Gly Asp Lys Thr Ala Asp Ala Ala Gly Ala Ala Lys Asp Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala Ala Gly Giy Lys Ala Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Leu Gly Asp Lys Ala Asn Gin Val Lys Giy Thr Ala Ala Asp Ala Ala Gly Ala Thr Gin Asp Lys Ala Ser Gly Leu Ala Thr Thr Ala Gin Gin Lys Ala Gly Glu Gly Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Val Ser Ala Lys Asp Thr Ala Gly Asn Val Leu Gin Gin Thr Gly Asp Aia Val Aia Asn Val Phe Asn Arg Ala Lys Glu Thr Val Thr Pro Lys Gh2 、尸/ CorM6基因的Nothern blot分析将冷处理不同时间的总RNA定量后，控制每个泳道上样量一致(IO吗)，然 后在lOOv电压下进行变性胶电泳约2.5h。探针DNA为尸/ CoW66的RT-PCR回收 产物，按随才几引物标i己试剂盒Prime-a-Gene Labelling System(Promag, USA)说明书 进行探针的标记，杂交完成后，压磷屏及扫描图像，结果如图2所示。低温处理 后的Northern杂交结果表明尸pCor/6(5在12小时有微弱表达，48小时达到最强， 72小时后开始减弱，因此可以推断PpCorl66参与了植物的低温胁迫应答反应，与 小立碗藓的抗低温特性密切相关。
<110〉首都师范大学<120> —种小立碗藓抗逆基因PpCorl66及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和细胞系<160>3<210>1<211>892<212>DNA<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)<220><221>CDS<222>(1)...(504)<400>1atgccgctaagagcgctaccggaactgcccaagacaaggctggccaagct50ggggactacgcaagctcaaaggcccaagctgctaagtctgacgcttccga100cgcgaccggagctgccc昭cacaaggcaggcgaagctactgatgctgcta150aggataccatcacagcgagttggtgacaagactgctgacgctgctggagc200tgcaaaggacaaggcatatgaggccaaggacgccgcaggcgggaaggcca250gcgagacgggtggctacttgggtgacaaggcaaaccaggtcaagggtacc300gctgctgatgccgctggcgccactcaggacaaggcttcgggtttggcgac350caccgcccaacagaaggctggtgaaggtgcaaattatgccaaagagactg400cggtgagcgccaaggacaccgctggaaacgttttgcagcagaccggtgat450gctgtggccaacgtattcaaccgcgcgaaggaaactgtcaccccaaagca500 gtaa 550<210>2<211>167<212>PRT<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts ) <400>2Met Pro Leu Arg Ala Leu Pro Glu Leu Pro Lys Thr Arg Leu Ala 15 10 15Lys Leu Gly Thr Thr Gin Ala Gin Arg Pro Lys Leu Leu Ser Leu20 25 30Thr Leu Pro Thr Arg Pro Glu Leu Pro Ser Thr Arg Gin Ala Lys35 40 45Leu Leu Met Leu Leu Arg lie Pro Ser Gin Arg Val Gly Asp Lys50 55 60Thr Ala Asp Ala Ala Gly Ala Ala Lys Asp Lys Ala Tyr Glu Ala65 70 75Lys Asp Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Leu80 85 90Gly Asp Lys Ala AsnGln Val Lys Gly Thr Ala Ala Asp Ala Ala95 100 105Gly Ala Thr Gin Asp Lys Ala Ser Gly Leu Ala Thr Thr Ala Gin110 115 120 Gin Lys Ala Gly Glu Gly Ala AsnTyr Ala Lys Glu Thr Ala Val 125 130 135Ser Ala Lys AspThr Ala Gly AsnVal Leu Gin Gin Thr Gly Asp 140 145 150Ala Val Ala AsnVal Phe Asn Arg Ala Lys Glu Thr Val Thr Pro 155 160 165Lys Gin<210〉3<211>918<212>DNA<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)<400>3cattgccttt cttcttctta tctacttacg ttcttcttcc tctcttctac 50cgttttacag tcagtcattg tgtgtttcta gctcgcccca catctgtacg 100tttttctaga gctctgcatt tgagatcagt ctccgtcacc ggctttcgtc 150gagatgtcga ccttcgagca aaccaaggag caggctggaa agaaggcgga 200ggagaccaag gggtttggac aagagcaggc tggacacgcc aaggatgccg 250ctaagagcgc taccggaact gcccaagaca aggctggcca agctggggac 300tacgcaagct caaaggccca agctgctaag tctgacgctt ccgacgcgac 350cggagctgcc cagcacaagg caggcgaagc tactgatgct gctaaggata 400ccacacagcg agttggtgac aagactgctg acgctgctgg agctgcaaag 450gacaaggcat atgaggccaa ggacgccgca ggcgggaagg ccagcgagac 500gggtggctac ttgggtgaca aggcaaacca ggtcaagggt accgctgctg 550atgccgctgg cgccactcag gacaaggctt cgggtttggc gaccaccgcc 600caacagaagg ctggtgaagg tgcaaattat gccaaagaga ctgcggtgag 650cgccaaggac accgctggaa acgttttgca gcagaccggt gatgctgtgg 700ccaacgtatt caaccgcgcg aaggaaactg tcaccccaaa gcagtaaagt 750ggagtgggtt acttagtttt ggtgaatact acaatgggta漏cacat 800ttatttactg tcactccatc tcagctgcca gagaacttct agagattctc 850agttttgcga aagtgtacag tgttcagaat gaatattgaa aggtcaaatt 900taagccgtaa aaaaaaaa 918
权利要求
1、一种小立碗藓抗逆基因PpCorl66，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2、 权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序 列如SEQID No.2所示。
3、 含有权利要求1所述基因的载体。
4、 表达权利要求1所述基因的转基因细胞系。
全文摘要
本发明涉及生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗逆基因PpCor166及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。
文档编号C12N15/29GK101161814SQ20061011372
公开日2008年4月16日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者何奕昆, 李林辉, 慧 王 申请人:首都师范大学