专利名称：免疫磁珠分选去除分化体系中胚胎干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫磁珠分选去除分化体系中胚胎干细胞的方法，更确切地说是采用免疫磁珠分选系统(MACS)将胚胎干细胞从其分化细胞中分离并去除，以期移植纯化的分化细胞入动物体内以减少致瘤性的方法，属于医学生物技术领域。
背景技术：
中枢神经系统损伤修复一直是医学界的重要难题，传统药物治疗和手术干预方法都存在着难以克服的问题。随着生物医学技术的迅猛发展，在过去二十年中细胞治疗(cell therapy)正越来越受到重视。细胞治疗指将同种的或异种的、自体的或者异体的活细胞经过或者不经过加工后，移植于患者的脑内或脊髓内的特定区域，从而治疗某种疾病。这种方法为解决神经细胞移植治疗帕金森病等神经系统疾病提供了可能。
已有研究表明，将原始胚胎干细胞移植入动物体内会造成畸胎瘤，故除去胚胎干细胞分化细胞中的原始细胞、获取大量纯化的分化细胞已成为解决移植后致瘤性问题的关键。
传统的将分化细胞提纯方法有流式细胞仪分选、差速离心等，但上述方法均存在纯度不高、仪器设备昂贵、影响细胞活力等不足，因此在实际工作中难以广泛应用。免疫磁珠分选系统(Magnetic Cell Sorting，MACS)是一种新兴的细胞分离技术，被广泛用于细胞分离、蛋白质核酸纯化等诸多领域，目前MACS已用于干细胞研究。此技术的核心是在磁珠表面包被具免疫反应原性的抗体，直接与靶细胞的抗原分子或间接与事先结合在靶细胞表面的抗体进行抗原抗体反应，在外加磁场中，这些结合了磁珠的细胞就会与其它未被结合的细胞分群，具超强顺磁性的磁珠脱离磁场后立即消失磁性，这样就可以提取或去除所标记的细胞，从而达到阳性或阴性选择细胞的目的。此外，MACS具有孵育时间短、操作过程快、且不影响细胞在流式检测中的散射特性与细胞的功能和活性的特点。另外，磁珠会在细胞培养的过程中生物降解，而无需再对磁珠进行专门的去除。从这些特点分析，磁珠分选能够分离出高纯度的细胞，且细胞活性保持完好。
目前尚未有如何分离去除胚胎干细胞分化体系中的原始胚胎干细胞的成熟的方法学报导。在本发明中，我们尝试利用免疫磁珠分选系统(MACS)降低分化体系细胞中原始胚胎干细胞的比例，并经流式细胞仪检测其纯度，以从方法学上探讨纯化分化细胞，筛除其中原始细胞的具体途径，为进一步将纯化后的分化细胞移植入小鼠体内以进行降低致瘤性的研究奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、效果显著的用免疫磁珠分选去除胚胎干细胞分化体系中原始细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案免疫磁珠分选去除胚胎干细胞分化体系中原始细胞的方法，包括如下步骤(1)制备单细胞悬液取培养的胚胎干细胞分化期细胞，用0.25％胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA消化2-4min，加血清终止消化，打散后离心，弃上清；用MACS缓冲液重悬细胞，过40μm滤网获得单细胞悬液，调整细胞密度至107/ml；(2)MACS分离纯化分化细胞按1∶100的稀释比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗体，使总体积为500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的抗体；用80μl MACS缓冲液重悬细胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗体的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入1ml MACS缓冲液洗涤两次，离心去除磁珠抗体，弃上清，重新用500μl MACS缓冲液重悬细胞；2ml缓冲液预洗LD磁性分选柱后，将500μl细胞悬液过柱；1ml缓冲液洗柱两次，去除非标记阴性细胞；移柱出磁场，用MACS缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。
本发明首次将MACS间接阴性分选运用于胚胎干细胞的分化细胞的筛除分选中，筛除抗体结合阳性的细胞，保留纯化后的阴性细胞，为MACS用于干细胞的研究提供了新的领域。胚胎干细胞特异性表面抗体(Special Stage Embryonic Angent-1，SSEA-1)是国际公认的常用的鼠胚胎干细胞的特异性胞膜表面标记物，和荧光二抗FITC有很高的结合效率，是分选顺利进行的基础，但由于其无磁珠直接结合，故只能用间接分选法。分选成功的前提是寻找胚胎干细胞的特异性标记物SSEA-1的适当作用浓度、作用温度以及作用时间，以保证获得最佳的分筛结果。出于有效性和保持细胞活性两点考虑，经过多次实验筛选，最终按1∶100的比例稀释SSEA-1抗体即可获得合适的作用浓度；经过多次不同温度及不同作用时间的SSEA-1抗体检测，最终选择4℃作用10min为最佳筛选方式。
作为本领域常规操作，本发明中Trypsin-EDTA消化的时间为3min。离心的速度和时间为1000rpm，3min。这些数据可以根据具体实验内容进行调整，并非本发明的创新点所在。
本发明的优点是在此优化的SSEA-1作用条件下，分筛后的分化细胞中原始细胞的比例可以明显降低，差异有统计学意义，说明此方法简便、有效。为进一步进行裸鼠体内移植分化细胞，进行致瘤性研究打下基础。MACS方法操作简便迅速，无须昂贵的实验设备，且纯度较高，分筛后的细胞有较好的存活率，分离效果可得到细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜、以及PCR等分子生物学方法的确认。因此，本发明在干细胞研究中将有广阔的应用前景。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，并不以任何方式限制本发明，凡是依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为SSEA-1作用浓度梯度图。
图2为SSEA-1于37℃作用时间梯度图。
图3为SSEA-1于4℃作用浓度梯度图。
图4-A为细胞分选实验的阴性对照图。
图4-B为细胞分选实验的分筛前SSEA-1阴性细胞中阳性比例图。
图4-C为细胞分选实验的分筛后SSEA-1阴性细胞中阳性比例图。
具体实施例方式
下述实施例中使用的材料及来源1.鼠胚胎干细胞(murine embryonic stem cells，mESC)系sv129株，ATCC编号为CRL-11379。
2.主要试剂及仪器小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗体(R&D公司，美国)；包被羊抗小鼠IgM的免疫磁珠(Miltenyi Biotech公司，德国)；FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗小鼠IgM(Jackson ImmunoResearch公司，美国)；Mini MACS磁珠分选系统(Miltenyi Biotech公司，德国)；孔径40μm筛网(Millipore公司，美国)，FACS Calibur型流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)。
实施例1.诱导胚胎干细胞分化成神经前体细胞一.方法(公知方法)1.培养胚胎干细胞未分化的mESC在含有1000U/mL人类白血病抑制因子(hLIF，human Leukemia Inhibition Factor，CHEMICON)的ESC培养基(DMEM(Dulbecco’smodified eagle’s medium)，GIBCO；15mL/L胎牛血清(fetus bovine serum，FBS)，GIBCO；2mM非必需氨基酸(Non-essensial amino acid)，Invetrogen；0.55mM β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，GIBCO；2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，GIBCO；青链霉素(Penicillin-Stroptomyicn liquid)，Invetrogen)中进行体外扩增，隔天换液，约5天细胞长满瓶底后按1∶5比例传代。
2.诱导胚胎体形成用0.25％Trypsin-EDTA(Invetrogen)消化mESC，离心，1000rpm，3min，弃上清；加入1ml ESC培养基重悬细胞，用巴斯德管轻轻吹打至单细胞；按2.5×104/cm2的细胞密度把消化后的ES单细胞接种于低黏附性培养皿(Petridish)中，用不含hLIF的ESC培养基的培养6天，细胞由接种时的单细胞长成悬浮的圆形细胞团，即胚胎体(Embryonic body，EBs)。
3.筛选nestin阳性细胞当EBs形成后，将胚胎体接种于0.1％明胶铺底的普通培养皿中加入不含LIF的ES培养基，24h后将ESC培养基更换为无血清的ITSF筛选培养基(DMEM/F-12，GIBCO；其中加入5μg/mL胰岛素(Insulin)，GIBCO；50μg/mL转铁蛋白(Transferrin)，Sigma；5μg/mL纤维连接蛋白(Fibronectin)，Sigma；30nmol/L硒酸钠(Sodium selenium)，Sigma)培养6-10天。
4.Nestin阳性细胞扩增用0.25％胰酶消化筛选后的细胞，离心，1000rpm，3min；按2×105/cm2的密度接种细胞于预先铺有15μg/mL多聚鸟氨酸(Poly-L-OrnithineSolution，Sigma)和1μg/mL鼠层连蛋白(Laminin，GIBCO)的培养皿中；加入增殖培养基(DMEM/F12中加入1×N2，1×B27，GIBCO；10μg/mL bFGF，R&D；1μg/mLLaminin)扩增Nestin阳性细胞，隔日换液，连续培养6天。
5.定向诱导分化扩增完毕后，培养基更换为分化培养基(DMEM/F12中加入1×N2，1×B27；1mg/L Laminin；200μM Ascorbic Acid，Sigma)诱导分化6～15天。
二.结果mESC在铺有明胶的培养皿底生长为边缘大致规则的近似圆形的细胞团。打散的胚胎干细胞在petri dish中悬浮培养，并撤除hLIF，可形成球形的EBs。之后将EBs打散用ITSF培养基筛选，细胞仍倾向聚集成团生长，但有很多散在呈梭形的细胞。经有丝分裂原的扩增后分化细胞数量增加，培养细胞中散在的梭形细胞多见。最后在诱导分化培养基内原先呈梭形的细胞逐渐变为圆形，细胞之间有丰富的突起连接。
实施例2.探索最适合的SSEA-1抗体与ES细胞作用浓度、温度和作用时间一.方法1.培养胚胎干细胞未分化的mESC用含有1000U/mL hLIF的ESC培养基中，置于37℃，5％CO2孵箱中连续培养，隔天换液。约2-4天可长满一皿，经0.25％胰酶消化后得细胞悬液，最终每皿可收集细胞量约为2×106/ml。
2.对mESC做不同浓度的小鼠SSEA-1抗体结合分析，了解SSEA-1最佳的作用浓度mESC弃去培养液，0.01M PBS(pH7.4)洗一遍，0.25％胰酶消化，离心，300g，3min；4％多聚甲醛重悬细胞，于4℃20min；0.01M PBS溶液洗一遍；滴加SSEA-1一抗稀释液，4℃过夜，稀释比例分别为①号管1∶25，②号管1∶50，③号管1∶100，④号管1∶500，⑤号管1∶1000。次日，PBS溶液清洗3遍；滴加1∶100稀释的荧光二抗FITC工作液，避光，室温孵育2h；PBS溶液清洗3次；标记后的细胞最终重悬于500μlPBS溶液中，做流式细胞分析。
3.根据上一步的实验结果选择适当的SSEA-1作用浓度，对mESC做不同作用时间的SSEA-1抗体结合分析，了解SSEA-1最佳的作用时间mESC弃去培养液，0.01MPBS洗一遍，0.25％胰酶消化，离心，300g，3min；4％多聚甲醛重悬细胞，于4℃20min；0.01M PBS溶液洗一遍；滴加1∶100稀释的一抗SSEA-1工作液，分别在4℃和37℃作用时间分别为①号管5min，②号管10min，③号管15min，④号管30min，⑤号管60min；最终将标记过的细胞重悬于500μl PBS溶液中，做流式细胞分析。
二.结果1.最佳SSEA-1作用浓度不同SSEA-1作用浓度比例比较如图1。结果显示SSEA-1按1∶100比例稀释，即可达到理想效果。
2.最佳SSEA-1作用温度和时间不同SSEA-1作用时间的结果比较如图2，3。结果显示37℃5min或4℃10min可得到理想效果。
实施例3.分离、纯化分化细胞一.方法1.制备单细胞悬液取实施例1得到的分化期细胞，0.25％胰酶消化3min，加血清终止消化，巴斯德管轻轻吹打约20次，离心，1000rpm，3min，弃上清。用MACS缓冲液重悬细胞，过40μm滤网以获得单细胞悬液。镜下计数并调整细胞密度至107/ml。
2.MACS分离纯化分化细胞按1∶100的稀释比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1 IgM抗体，使总体积为500μl，4℃孵育10min；用2mlMACS缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm，3min，以去除多余的抗体；用80μl MACS缓冲液重悬细胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗体的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS缓冲液洗涤，1000rpm，3min，弃上清，重新用500μl缓冲液重悬细胞；2ml MACS缓冲液预洗LD柱(MACS配件，MiltenyiBiotech公司，德国)后，将500μl细胞悬液过柱；1ml缓冲液洗柱两次，以去除非标记阴性细胞；移柱出磁场，3ml缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。分别按2×104/cm2细胞密度接种于培养皿中，收集其余细胞，待做后续实验。
3.细胞活性检测纯化前后分别取10μl细胞悬液与10μl 0.4％台盼蓝溶液混合后，滴入细胞计数板置于显微镜下观察。不着色、发亮的为活细胞，着色、胞体膨大者为死细胞，计数细胞总数及活细胞百分比。
4.细胞分筛后的流式细胞仪检测将洗脱的SSEA-1阴性细胞和阳性细胞分别离心，1000rpm，3min；4％预冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗两遍；加1∶100稀释的FITC结合的抗小鼠IgM荧光二抗室温孵育2小时；PBS洗两遍；500μl PBS重悬细胞，上机检测。采用SPSS 10.0软件进行两样本均数的t检验，分析纯化前后SSEA-1阴性细胞的纯度及细胞活力的差别。
二.结果1.纯化前分化细胞中原始细胞的比例平均为(11.61±5.34)％，纯化后SSEA-1阴性细胞中原始细胞的比例平均为(0.325±0.255)％(P＜0.01)(图4-A至图4-C)2.纯化前细胞存活率为(93.0±2.5)％，纯化后为(92.6±0.7)％(P＞0.05)，这说明应用Mini MACS筛除分化细胞中的SSEA-1阳性细胞可明显提高分化细胞的纯度而基本不影响细胞活力。
权利要求
1.免疫磁珠分选胚胎干细胞分化细胞中原始细胞的方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备单细胞悬液取培养的胚胎干细胞分化期细胞，用0.25％Trypsin-EDTA消化2-4min，加血清终止消化，打散后离心，弃上清；用MACS缓冲液重悬细胞，过40μm滤网获得单细胞悬液，调整细胞密度至107/ml；(2)MACS分离纯化分化细胞按1∶100的稀释比例加入小鼠抗小鼠SSEA-1IgM抗体，使总体积为500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS缓冲液洗涤细胞两次离心，去除多余的抗体；用80μl MACS缓冲液重悬细胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗体的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS缓冲液洗涤离心，弃上清，重新用500μl缓冲液重悬细胞；2ml缓冲液预洗LD柱后，将500μl细胞悬液过柱；1ml MACS缓冲液洗柱两次，去除非标记阴性细胞；移柱出磁场，用缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠分选去除胚胎干细胞分化细胞中原始细胞的方法，其特征在于所述胰蛋白酶-EDTA消化的时间为3min。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠分选胚胎干细胞分化去除细胞中原始细胞的方法，其特征在于所述离心的速度和时间为1000rpm，3min。
全文摘要
本发明公开了一种免疫磁珠分选去除分化体系中胚胎干细胞的方法，属于医学生物技术领域。本发明包括如下步骤(1)制备单细胞悬液；(2)MACS分离纯化分化细胞按1∶100的稀释比例加入小鼠抗小鼠SSEA－1 IgM抗体，使总体积为500μl，4℃孵育10min；用2ml MACS缓冲液洗涤细胞两次离心，去除多余的抗体；用80μl MACS缓冲液重悬细胞，加入包被羊抗小鼠IgM抗体的免疫磁珠20μl，4℃放置15min；加入MACS缓冲液洗涤离心，弃上清，重新用500μl缓冲液重悬细胞；2ml缓冲液预洗LD柱后，将500μl细胞悬液过柱；1ml缓冲液洗柱两次，去除非标记阴性细胞；移柱出磁场，用缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。本发明的优点是操作简便快速，无须昂贵的实验设备，纯度较高，分筛后的细胞存活率高。
文档编号C12N5/06GK1932008SQ20061011361
公开日2007年3月21日 申请日期2006年10月9日 优先权日2006年10月9日
发明者关云谦, 朱宛宛, 任萍, 王淑艳, 徐艳玲, 张愚 申请人:首都医科大学宣武医院