专利名称：胚胎干细胞自我更新和品系特化的控制及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及培养多能干细胞，以促使干细胞自我更新和防止或控制干细胞分化的培养条件和方法。本发明还提供了分离和维持多能干细胞的同源制备物的方法。所提供的方法和组合物适合培养和分离多能干细胞，例如胚胎干细胞(ES细胞)。
背景技术：
在含有血清和白血病抑制因子(LIF)的培养基中建立和维持体外多能干细胞培养物是众所周知的(Smith等(1988)Nature 336688-90)。这些方法被用于维持给予了许可的小鼠品系的多能胚胎干细胞(ES细胞)许多代。当干细胞在饲养细胞或其提取物，通常是小鼠成纤维细胞存在的情况下培养时，进一步支持多能干细胞培养物的维持和自我更新。在这些条件下，可以在培养物中维持人ES细胞许多代，而保持其多能状态。
在该领域中一直存在一个问题，即尽管进行了很大的努力，仍然只能只能从几种物种，甚至在这些物种中也不能从所有的胚胎衍生出ES细胞的多能培养物，并维持更长的时间。在一些情况下，可鉴别出多能细胞，但随之在培养物中不能维持足够的时间，因此不能研究这些细胞或其遗传控制。这特别见于啮齿类(除了有些小鼠品系)细胞。
另一个问题是，能够确实在培养物中维持在多能状态许多代的ES细胞仅能用含有血清或血清提取物的培养基维持，因此培养基成分是不确定的；或者用需要存在其它细胞，例如用于维持人ES细胞的成纤维细胞饲养细胞的细胞培养条件才行。然而，当试图对ES细胞随后控制其分化成所需细胞类型时，采用成分不明确的培养基或者或需要存在异源细胞是不利的。
通常用于培养多能干细胞的血清是胎牛(牛)血清，已知其含有复杂的细胞因子和其它信号传递分子混合物。为了控制分化途径，在培养基中引入未知的细胞因子是不利的，这些细胞因子对最终分化发生的影响是无法量化的，而且可能是有害的。另外，每批血清是独特的，在培养方案之间引入变动。
结果，在这种复杂培养基中培养获得的ES细胞及其任何分化的子代都有被培养基和或细胞(例如维持ES细胞所需的饲养细胞)污染的危险。这些因素阻滞了对ES细胞及其子代在治疗和其它应用中的优良制备规模的开发。
当从ES细胞培养物衍生出分化的细胞群时，需要能够将高比例的ES细胞转化成相同类型的子代-即尽可能的使细胞群维持同源。然而在实践中，观察到在分化后，获得含有异源细胞混合物的细胞群。因此，需要能够分化能获得更纯的子代群体的ES细胞群。
EP1077254描述了从脂肪组织分化基质细胞的方法和组合物，可包括白细胞介素、FGF和血清、足量的能诱导分化成平滑肌的TGF-β。
EP 0753574描述了体外人祖细胞扩增的方法和组合物。培养基含有基质细胞，通常是转化的成纤维细胞。
WO 00/05344描述了当与基因工程改造的果蝇细胞一起培养时，果蝇种系干细胞和其它物种体干细胞增殖的维持方法。
WO 96/40866描述了在含有蛋白胨、蛋白酶抑制剂和垂体提取物中至少一种培养基中无血清培养人造血祖细胞和干细胞的方法。
US2002/0028510描述了脐带血多能细胞分化成神经元细胞类型的方法和组合物。
US5750376描述了在添加至少一种生长因子的培养基中分化多能神经元干细胞的方法和组合物。
Wiles和Johansson，Exp.Cell Research，1999(247)pp241-248描述了在LIF和胎牛血清的存在下，维持未分化细胞系的方法。当ES细胞在无血清培养基中生长时，它们迅速的丧失其ES细胞表型，并发育成各种细胞类型，包括神经外胚层。
因此，本发明的一个目的是提供适用于多能干细胞的培养方法和培养基，能够支持所述干细胞以未分化的状态自我更新许多代。本发明的另一个目的是提供培养系统，从而能在体外维持多能干细胞，直到以受控方式诱导细胞的分化。本发明的另一个目的是提供增强多能干细胞分离，促使其从难以分离ES细胞或从没有分离过多能干细胞的器官中分离的方法和组合。
本发明基于观察结果，即在含有gp130(例如LIF)和TGF-β超家族(例如BMP4)信号传递途径的激动剂的无血清培养基中培养多能干细胞(例如ES细胞)，促使干细胞自我更新许多代。因此，在gp130信号传递的存在下，TGF-β超家族信号传递途径的激动剂提供了自我更新的刺激，而不是促分化信号。
发明简述因此，本发明的第一个方面提供了联合使用(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白，以促进培养物中多能细胞的自我更新。
可用TGF-β超家族的受体的激动剂激活TGF-β超家族受体下游的一个或多个信号传递途径。受体的例子是BMP受体和TGF-β受体，以及结合有活化素(nodal)和节交点的受体。优选通过BMP受体的激动剂实现一种或多种信号传递途径的活化。
可使用通过gp130作用的细胞因子，例如细胞因子或LIF受体的其它激动剂实现一种或多种gp130下游信号途径的激活。
TGF-β超家族受体的激动剂是信号传递因子的合适TGF-β超家族成员，优选是骨形态发生蛋白(BMP)，例如BMP-4。已知的BMP4同源物，例如BMP2和BMP7也是合适的，还有非哺乳动物的同源物，例如果蝇的十五褶(dpp)。用BMP-4、8和2获得了良好的结果。用BMP4和BMP8的嵌合体也获得了良好的结果，该嵌合体比BMP4更容易以分泌形式获得。术语“激动剂”还意味着包括TGF-β超家族信号传递多肽、片段、变体或其衍生物的模拟物、融合蛋白或嵌合体，它们能够激活TGF-β超家族的受体。
能够通过gp130作用，从而激活gp430信号转导的细胞因子包括LIF、CNTF、向心素、制瘤素M和IL-6+sIL-6受体。合适的细胞因子包括能够与gp130结合或通过gp130激活信号传递的模拟物、融合蛋白或嵌合体。
在血清的存在下，也很好的确立了细胞因子通过gp130作用的角色，但在不存在血清的情况下，这些细胞因子维持未分化细胞的能力是有限的。
从体内和ES细胞的开发研究得到的先前对BMP的数据指出其在驱动中胚层和表皮分化中具有活性。文献中没有证据表明激活BMP信号传递途径能够增强多能干细胞的自我更新。
Johansson和Wiles(Mol.Cell Biol.(1995)15(1)141-51)公开了含有LIF和BMP4的用于ES细胞分化的化学成分确定的无血清培养基。然而，该培养基还含有不明确的白蛋白成分，LIF和BMP4仅仅是混合用于促进ES细胞分化成中胚层和造血细胞的培养基中。5天后在培养物中观察到分化出表达中胚层标记基因Brachyury的细胞(见145页，第一段)。在不存在BMP4的情况下，补充了更高浓度的LIF的该化学成分确定的培养基能够最多维持ES细胞三代(见143页，第2栏)。所以，Johansson和Wiles描述了一种组合物，它能够通过形成多细胞聚集物诱导的分化和ES细胞的分化，而不是ES细胞的自我更新。
因此，本发明在一个实施例中提供了在无血清、无血清提取物、无饲养细胞和饲养细胞提取物的培养基中培养ES细胞的培养物。
当使用本发明一个具体实施例的含LIF和BMP4的培养基时，ES细胞可以延长传代。在一个实施例中，小鼠ES细胞已在3个月内维持了20代以上。根据接种细胞的密度，细胞每2-4天传代一次，虽然偶尔有细胞在低接种密度下可7-10天传代一次。
本培养系统的另一个优点是，与现在存在血清的培养相比，减少了ES细胞的分化。这是非常重要的，因为通常大部分多能ES细胞非常可能会在血清中分化，使其操作和扩增成问题。
检测培养物中的ES细胞，发现仍然维持ES细胞形态和表达ES细胞标记(碱性磷酸酶染色阳性)。当在ES细胞特异性Oct-4启动子控制下的GFP受体基因时，在ES细胞中见到绿色荧光。类似的，保持了Sox2启动子的β-半乳糖苷酶表达。表达了ES细胞mRNA标记，例如Oct4、Nanog、Rex1和Sox2，进一步证实了这些细胞是ES细胞。发现培养物中的细胞形态分化非常少，比含有血清的培养基中的ES细胞的比较培养物更少。因此，本发明的培养条件能够使ES细胞在没有血清的情况下自我更新。
报道过来自许多哺乳动物来源的胚胎干细胞，包括小鼠(Bradley等(1984)Nature 309255-56)、美国水貂(Mol Reprod Dev(1992)Dec；33(4)418-31)、猪和绵羊(J Reprod Fertil Suppl(1991)；43255-60)、仓鼠(Dev Biol(1988)May；127(1)224-7)和奶牛(Roux Arch Dev Biol(1992)；201134-141)。应理解本发明的方法和组合物适合培养其它的哺乳动物多能细胞培养物，包括人、灵长类和啮齿类、以及禽ES细胞。
特别是，对于人ES细胞，已知人ES细胞对LIF有反应，因此在本发明的培养基和方法中，将对LIF和BMP4的组合反应中获得自我更新刺激应用于人ES细胞。
本发明方法的合适的细胞密度可根据所用的多能干细胞以及任何所需子代的性质而不同。通过在单层培养物中培养胚胎干细胞，分离胚胎干细胞，然后以0.2-2.5×104细胞/cm2，更具体是0.5-1.5×104细胞/cm2的密度在培养物表面以单层培养物的方式培养胚胎干细胞，获得良好的结果。细胞增殖成为粘连的单层，并观察到与含血清和LIF的培养基中生长的ES细胞相当的倍增时间。
本发明ES细胞及其子代培养物的典型表面，是本领域知道的用于细胞培养的培养表面，包括塑料、金属、复合物表面，虽然通常是使用可广泛购得的塑料组织培养板表面。这些板通常直径几厘米。为了规模生产，可使用更大直径的这种类型的板，和许多重复的板单元。
培养表面包括细胞粘附蛋白也是常用的，通常包裹在表面上。细胞上的受体或其它分子与蛋白或其它细胞培养基质结合，这促进了细胞与表面的粘附，并促进细胞生长。明胶包裹的平板是通常可得的，适用于本发明，还可使用其它蛋白。
在本发明的一个实施例中，发现在至少一部分培养时间，在培养基中加入抑制分化的制剂，例如FGF受体抑制剂，能够抑制ES细胞分化的倾向。在一个实施例中，ES细胞在含有LIF和FGF受体抑制剂的成分明确的无血清培养基中培养特定的一段时间，然后除去FGF受体抑制剂，并用BMP信号传递途径(例如BMP4)的激动剂代替。合适的FGF受体抑制剂包括化合物SU5402和PD173074。此外，可使用FGF受体的竞争性抑制剂，适合的是该受体的可溶形式。
在另一个实施例中，可选择不除去FGF受体抑制剂。因此，在培养基中在存在或不存在BMP信号传递途径激动剂的情况下，FGF受体抑制剂再存在一段长时间。在存在LIF和FGF抑制剂，不存在BMP的N2B27培养基中，ES细胞可培养生长至少20代。如果不从培养基中除去FGF受体抑制剂，优选该抑制剂是一种特异性抑制剂，对其它受体几乎或没有活性。
本发明的第二个方面提供了一种可促进ES细胞自我更新的培养ES细胞的方法，包括将ES细胞维持在含有以下物质的培养基中(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白。
在一个实施例中，ES细胞培养方法包括将ES细胞维持在含有以下物质的培养基中(a)TGF-β超家族受体激动剂；和(b)通过gp130作用的细胞因子。
本发明的方法可用于刺激不含血清和血清提取物的培养基中的ES细胞的自我更新。这些细胞先前已在血清或血清提取物中传代过。优选该方法还可在无饲养细胞和/或饲养细胞提取物的情况下进行。例如，可进行ES细胞的培养，包括步骤在通过gp130作用的细胞因子和血清或血清提取物存在的情况下，优选在饲养细胞培养物上维持ES细胞在多能状态；至少使ES细胞传代一次；从培养基中撤去血清或血清提取物，以及饲养细胞(如存在)，从而使培养基无饲养细胞、血清和血清提取物；和随后在TGFβ超家族受体下游信号传递途径激活蛋白和gp130下游信号传递途径激活蛋白存在下，将ES细胞维持在多能状态。
在从培养基中撤去血清或血清提取物前后，可任选的在培养基中加入抑制分化的制剂，例如FGF-受体抑制剂。可任选的，在随后存在TGF-β超家族受体下游信号传递途径激活蛋白时维持细胞的同时撤去分化抑制剂。
本发明还提供获得转染的ES细胞群的方法，包括用编码一可选择标记的构建物转染ES细胞；接种ES细胞；在(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白的存在下，培养ES细胞；和选择表达该可选择标记的ES细胞。
可选择标记可以编码抗生素抗性，如EP-A-0695351中所述的细胞表面标记或另一种可选择标记。
在另一个实施例中，本发明提供了一种培养ES细胞的方法，包括如下步骤将一个ES细胞转移到培养容器中，例如平板上的一个孔中，并在TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白和gp130下游信号传递途径激活蛋白存在下培养ES细胞，从而获得ES细胞的克隆群，它们都是一个ES细胞的子代。
一旦获得稳定、同源的ES细胞培养物，可改变培养条件，指导细胞分化成选自外胚层、中胚层或内胚层细胞的一种或多种细胞类型。加入或撤去细胞因子和信号传递因子可实现高效率的衍生出特定分化的细胞群。可在通过gp130作用的细胞因子和BMP受体激动剂存在下维持ES细胞，然后撤去细胞因子同时维持BMP受体激动剂，和/或另一种能够指导分化的信号传递分子，实现ES细胞向非神经外胚层终末细胞的分化。
例如，在不存在LIF的情况下接触BMP4将导致诱生中胚层细胞类型。撤去gp130和TGF-β信号传递途径激动剂和/或阻断这两条途径可导致诱生神经外皮表型。另外，可在培养条件中加入其它信号传递因子，来指导其它分化途径，例如活化素、音速刺猬(shh)、Wnts和FGF。
在实践中，到ES细胞培养末，理想的是在分化开始前至少一次传代之时除去BMP4，以确保BMP信号消失，在随后的分化中没有BMP信号遗留。在一个实施例中，在培养物中加入FGF受体拮抗剂传代一或两次，同时从培养物中除去BMP。
本发明的其它方面提供了用于ES细胞自我更新的细胞培养基。这样的一种培养基包括基础培养基；TGF-β超家族受体下游信号传递途径激活蛋白；gp130下游信号传递途径激活蛋白；铁转运蛋白；其中培养基不含血清或血清提取物。
基础培养基是向ES细胞提供碳和/或维生素和/或矿物质的主要来源的培养基。基础培养基通常不含蛋白质，自身不能支持ES细胞的自我更新。铁转运蛋白提供了铁的来源，或提供了从培养基吸收铁的能力。合适的铁转运蛋白包括运铁蛋白和脱铁运铁蛋白。
优选培养基还含有胰岛素或胰岛素样生长因子，并且没有饲养细胞和饲养细胞提取物。
本发明还提供了细胞培养基，其含有(a)TGF-β受体激动剂；和(b)通过gp130起作用的细胞因子。
此培养基可任选的添加有ES细胞分化抑制剂，或者当需要分化时，加入能指导ES细胞分化成特定表型的信号传递因子。
优选培养基无血清或血清提取物。最优选培养基成分完全明确。
在本发明的一个优选例中，该培养基含有浓度为10U/ml-1000U/ml，更优选50-500U/ml，最优选100U/ml之间的gp130受体结合细胞因子LIF。
本领域技术人员应理解，激活TGF-β超家族受体下游信号传递途径会受到TGF-β受体上游激动剂(例如受体配体)、组成型活性受体或信号传递途径被活化的下游组分，例如SMAD信号转导分子的影响。类似的，gp130信号转导途径的上游效应物(例如细胞因子)和下游效应物(例如Stats)也能激活该途径。因此，本发明包括所有组合物，它们含有能激活TGF-β受体超家族信号传导途径和gp130信号传导途径的分子，以促进多能干细胞的自我更新。
根据本发明，更优选的是在粘附培养中进行细胞培养，在本发明的实施例中发现，细胞维持在多能状态后，可以高度均一方式和细胞高活性方式诱导分化。加入细胞粘附性蛋白可促进粘附性培养，在本发明的具体实施例中使用明胶作为培养基质的涂层。
还优选以单层培养物形式培养本发明的多能细胞，虽然可任选的细胞可在悬浮培养中生长或前细胞聚集体中生长；细胞还可以在珠或其它合适的支架，例如膜或其它立体结构上生长。
根据本发明培养多能细胞的培养基的另一种成分，也是优选存在的，是促进细胞存活和/或代谢的因子。在本发明的一个具体实施例中，细胞在胰岛素的存在下培养。另选的因子是胰岛素样生长因子，也可另选使用其它这样的存活和/或代谢促进因子。
本发明实施例中使用的培养基优选还含有血清白蛋白。这可以纯化或重组形式使用，如果是重组形式，则具有不含可能的污染因子、细胞因子等的优点。培养基不需要含有血清白蛋白，该成分可被省略，或被其它大蛋白或如Wiles等所述，用合成的聚合物(聚乙烯醇)替换。
本发明的一种特别优选的培养基是完全确定成分的。该培养基不含任何不确定的成分，即该成分的含量未知，或可能含有不确定或没有规定的可变化的因素。使用完全确定的培养基的优点是培养方法有效稳定，随后可衍生多能细胞的操纵。另外，发现能更有效和更有预见性的将细胞维持在多能状态，而且当诱导在成分确定的培养基中培养的细胞分化时，比使用不确定成分的培养基对分化信号的应答更加均一。
可用本发明的培养基培养来自任何成年组织的多能干细胞。
本发明的方法还包括获得分化细胞的方法，包括如所述培养多能细胞，并使得或导致细胞分化，其中细胞含有可选择标记，它能够在所需的分化的细胞中与其它细胞类型(包括多能干细胞)相比差异表达，从而可选择标记的差异表达实现所需的分化的细胞的优势分离和/或存活和/或分裂。
分化的细胞可以是组织干细胞或祖细胞，可以是终末分化的细胞。
本发明还提供了一种分离多能干细胞或EG或EC细胞的方法，包括在培养基中培养胚胎、胎儿或成年人组织，该培养基含有(a)通过gp130作用的细胞因子；和(b)TGFβ受体激动剂；和/或(c)FGF受体抑制剂。
优选培养基是完全成分确定的培养基。
在另一个实施例中，本发明提供了使用以下成分的组合(a)FGF受体信号传递抑制剂；和(b)gp130下游信号传递途径激动蛋白，以促进培养物中的多能细胞自我更新。
在附图中说明了本发明的方法和组合物，其中图1显示了在高或低细胞密度下，在本发明无血清的成分确定的培养基中生长的ES细胞的光学显微镜图像；在ES细胞特异性启动子Oct4，荧光控制下细胞表达了GFP蛋白；图2显示了在LIF和BMP4存在下，在无血清培养基中用pPCAG-tauGFP-IP稳定转染的ES细胞的光学显微镜图像；图3显示注射了图2表达GFP的ES细胞的胚泡，所产生的嵌合性小鼠胚胎(在胚胎期11天)；图4显示了在LIF和BMP4存在下，以低密度接种的单个ES细胞，以及接种后6天其衍生的克隆群的相差和荧光图像；图5显示了在添加有IGF-1或胰岛素、脱铁运铁蛋白、黄体激素、腐胺和亚硒酸钠的DMEM F12+神经基础培养基(比例1∶1)中生长的OS25和Oct4GFP ES细胞(第3代)；图6显示了在对ES细胞施用LIF/BMP4/TGF-β1/血清中的一种或多种之后15分钟和1小时，反映pSTAT3、STAT3、pSmad1和pSmad2磷酸化的免疫印迹结果；和图7显示了在对ES细胞施用LIF+BMP4+TGF-β1之后0、15、30分钟、1、2、4、8、和24小时，反映ERKs、p38、Smad1和2、和STAT-3磷酸化的免疫印迹结果。施用1小时后的磷酸化情况与施用LIF+血清后1小时的情况相比较。
具体实施例方式
用下列实施例说明了本发明。
实施例1在无血清无饲养细胞的成分确定的培养基中培养ES细胞的方法N2B27(补充了改良的N2的DMEM/F12培养基(25μg/ml胰岛素、100μg/ml脱铁运铁蛋白、6ng/ml黄体激素、16μg/ml腐胺、30nM亚硒酸钠和50μg/ml牛血清白蛋白)和补充了B27的神经基础培养基的1∶1混合物)在包裹了0.1％明胶的培养皿中，补充了LIF(100U/ml)和BMP4(100ng/ml)的N2B27培养基中培养ES细胞。为了传代，用标准的无蛋白细胞解离缓冲液分离细胞。
细胞的接种密度约为1-5×104/cm2。
在培养开始时，在培养基中补充SU5402(5μM)以抑制分化。2代后将细胞转移到无SU5402的培养基中。
将ES细胞维持在这些无血清条件下20代，经3个月。根据接种密度，细胞通常每2-4天传代一次。偶尔在以低克隆密度接种后，细胞每7-10天传代一次。
在多次传代后，ES细胞仍然是多能的。在除去LIF和BMP4后，细胞分化成表达Sox1的神经前体细胞。在存在BMP4但不存在LIF的情况下，ES细胞分化成具有特征性形态的大而扁平的细胞。
实施例2在无血清条件下培养的ES细胞中维持了Oct4-GFP表达在包裹了0.1％明胶的平板中，在补充有LIF和SU5402的N2B27(见实施例1)中培养Oct4GFP(克隆C1)ES细胞。2代后，在补充有LIF和BMP4的N2B27培养基中培养细胞。再过2代后，在相差条件下拍摄细胞的光学显微镜图像，显示形态和紫外荧光，以显示GFP的表达。图1显示了显微镜图像。
清楚的是GFP的形态和表达，表明在无血清培养基中传4代以后ES细胞保持其多能表型。
实施例3 ES细胞的稳定转染在补充有N2-B27添加剂和LIF、BMP4的DMEM F12+神经基础培养基中培养E14TG2A ES细胞。细胞在0.1％明胶包裹的平板中增殖，收集并用pPCAG-tauGFP-IP电穿孔转染。转染的细胞以105-106/皿的密度重新接种在10cm直径培养皿上。24小时后，加入0.5μg/ml嘌呤霉素选择阳性克隆。
在其后8-10天之间，将单个GFP阳性克隆挑到96孔板的单个孔中，如上所述在相同的培养基中培养细胞。
GPF绿色荧光表明ES细胞的稳定转染，并观察到形态上未分化ES细胞的扩增，如图2所示。
实施例4嵌合小鼠将如上文实施例3获得的表达GFP的ES细胞注射到胚泡中。表达GFP的ES细胞分布在嵌合小鼠胚胎的各种各样的细胞类型中，如图3所示(胚胎11日)。获得出生的活的嵌合小鼠，具有嵌合性毛皮，证实细胞是真正的ES细胞。
实施例5 ES细胞的克隆性自我更新挑出单个ES细胞，转移到96孔板的孔中，并如上文实施例3所述，在培养基中培养。
我们发现之前在无血清培养基中生长过至少一代的这些ES细胞克隆的效率与用含血清培养基获得的相似，即约10％效率。在LIF和BMP存在的情况下，这些克隆生长，并可与未分化的ES细胞一样传代和生长，如图4所示。
在先前的实验(数据未公布)中，我们发现在含血清培养基中生长的ES细胞当被直接转移到无血清培养基中时，显示克隆集落形成较少。
实施例6在成分完全确定的培养基中ES细胞的生长。
在成分完全确定的、无白蛋白的培养基中培养ES细胞。该培养基含有补充有IGF-1 10μg/ml(或胰岛素5-25μg/ml)、脱铁运铁蛋白100μg/ml、黄体激素6μg/ml、腐胺16μg/ml、和亚硒酸钠30nmol的DMEF F12+神经基础培养基(比例1∶1)。
用细胞解离缓冲液传代Oct4GFP ES细胞6次(细胞每隔6-8天传代一次)，在每次传代后以低细胞密度重新接种。第3代后拍摄的显微镜照片如图5所示。
实施例7使用无血清培养基和瞬时生长因子刺激最初，ES细胞在含有补充有N2-B27的DMEM F12+神经基础培养基(比例1∶1)的培养基中生长。以非常低的密度(3.5cm直径平板上约1000-10,000细胞)接种ES细胞，并在补充有LIF和BMP4的相同培养基上生长。
间或，在培养基中加入1-2ng/ml TGFβ或5ng/ml活化素，再次培养细胞。
我们观察到未分化的ES细胞数量增加，表明增殖增加或ES细胞存活增加，或两者。因此发现克隆效率的级别顺序是LIF/BMP4/活化素A(5ng/ml)＞LIF/BMP4/TGF-β(1-2ng/ml)＞LIF/活化素A＞LIF/BMP4＞LIF/TGF-β1＞仅LIF。
在再次传代(5-6代)后，效率的级别顺序改变为LIF/BMP4＞LIF/BMP4/活化素A＞LIF/BMP4/TGF-β＞LIF/活化素A＝只有LIF当继续存在TGFβ或活化素A时，观察到ES细胞持续分化。
观察到施用LIF和BMP4导致SMAD、ERK和STAT3的磷酸化(见图6和7)-证明BMP和gp130受体下游途径的活化。
实施例8在无血清和含血清培养基中生长的ES细胞的比较我们在包裹了0.1％明胶的6孔板中，以4×l05细胞/孔的密度在下列培养基中培养Oct4GFP ES细胞N2827+LIF、N2827+LIF+BMP4和GMEM 10％FCS+LIF。这些结果如表l所示。用细胞解离缓冲液解离细胞。传代5次后，在N2827+LIF中生长的细胞数量不足以继续培养。
本发明因此提供了许多物种的ES细胞自我更新的培养基和方法。
表1在无血清和含血清的培养基中培养ES细胞的比较
在包裹了0.1％明胶的6孔板中，以4×105细胞/孔的密度在所示培养基中培养Oct4GIP ES细胞。用细胞解离缓冲液解离细胞。传代5次后，在N2827+LIF中生长的细胞数量不足以继续培养。
权利要求
1.一种组合的用途，该组合包括(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白，其特征在于，用于促进培养物中的多能细胞自我更新。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白是TGF-β超家族受体的激动剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述TGF-β超家族受体的激动剂是骨形态发生蛋白。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述TGF-β超家族的受体激动剂是BMP4。
5.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述gp130下游信号传递途径激活蛋白是通过gp130作用的细胞因子。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述细胞因子是LIF。
7.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述gp130下游信号传递途径激活蛋白是可溶性的IL-6联合可溶性的IL-6受体。
8.如权利要求1-7任一所述的用途，其特征在于，ES细胞还在抑制分化的试剂存在下培养。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述ES细胞在FGF受体抑制剂存在下培养。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述FGF受体抑制剂是SU5402或PD173074。
11.如权利要求8-10任一所述的用途，其特征在于，首先在抑制分化的试剂存在下培养ES细胞，然后撤去该试剂。
12.如权利要求1-11任一所述的用途，其特征在于，用于培养选自哺乳动物和禽类多能细胞的多能细胞。
13.如权利要求1-12任一所述的用途，其特征在于，用于培养选自哺乳动物和禽类ES细胞的ES细胞。
14.如权利要求1-13任一所述的用途，其特征在于，用于培养选自啮齿类、牛、猪、羊和灵长类多能干细胞的多能细胞。
15.如权利要求1-14任一所述的用途，其特征在于，用于培养选自啮齿类、牛、猪、羊和灵长类ES细胞的ES细胞。
16.如权利要求12或13所述的用途，其特征在于，用于培养大鼠或小鼠细胞。
17.如权利要求12或13所述的用途，其特征在于，用于培养人细胞。
18.如权利要求1-17任一所述的用途，其特征在于，在无血清、血清提取物、饲养细胞和饲养细胞提取物的培养基中培养ES细胞。
19.如权利要求1-18任一所述的用途，其特征在于，在完全确定成分的培养基中培养ES细胞。
20.一种培养ES细胞从而促使ES细胞自我更新的方法，其特征在于，该方法包括在含有以下物质的培养基中维持ES细胞(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白是TGF-β超家族受体的激动剂。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述gp130下游信号传递途径激活蛋白是通过gp130作用的细胞因子。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述TGF-β超家族受体的激动剂是骨形态发生蛋白。
24.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述gp130下游信号传递途径激活蛋白是LIF、或IL-6+可溶性IL-6受体。
25.如权利要求20-22任一所述的方法，其特征在于，该培养基还含有FGF受体的抑制剂。
26.一种培养ES细胞的方法，其特征在于，该方法包括在通过gp130作用的细胞因子和血清或血清提取物的存在下，可任选的在饲养细胞上，在培养物中将ES细胞维持在多能状态；使ES细胞至少传代一次；从培养基中撤去血清或血清提取物，如存在，撤去饲养细胞，从而使培养基不含饲养细胞、血清和血清提取物；和随后在(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白的存在下将ES细胞维持在多能状态。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，包括在抑制分化的制剂存在下培养ES细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，在撤去血清或血清提取物前后在培养基中加入抑制分化的制剂。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，在TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白存在下维持细胞的同时或之后，撤去抑制分化的制剂。
30.一种获得转染的ES细胞群的方法，其特征在于，该方法包括用编码一可选择标记的构建物转染ES细胞；接种ES细胞；在(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白的存在下，培养ES细胞；和选择表达该选择标记的ES细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述可选择标记编码抗生素抗性或细胞表面标记。
32.一种培养ES细胞的方法，其特征在于，该方法包括将单个ES细胞转移到培养容器中；和在(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白存在下培养ES细胞，从而获得ES细胞的克隆群，它们都是一个ES细胞的子代。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，培养容器是平板上的一个孔。
34.一种引导ES细胞向神经表皮终末细胞分化的方法，其特征在于，该方法包括在通过gp130作用的激动剂和BMP受体存在下维持ES细胞；和从培养基撤去所述激动剂。
35.一种引导ES细胞向非神经表皮终末细胞分化的方法，其特征在于，该方法包括在通过gp130作用的激动剂和BMP受体激动剂存在下维持ES细胞；和撤去细胞同时(I)保留BMP受体激动剂；和/或(II)加入另一种能够引导分化的信号分子。
36.一种用于ES细胞自我更新的培养基，其特征在于，该培养基包括基础培养基；TGF-β超家族受体下游信号传递途径激活蛋白；gp130下游信号传递途径激活蛋白；铁转运蛋白；其中该培养基不含血清或血清提取物。
37.如权利要求36所述的培养基，其特征在于，还含有胰岛素或胰岛素样生长因子。
38.如权利要求36或37所述的培养基，其特征在于，所述培养基不含饲养细胞或饲养细胞提取物。
39.一种ES细胞培养基，其特征在于，该培养基含有(a)TGF-β受体激动剂；(b)通过gp130作用的细胞因子；和(c)ES细胞分化抑制剂。
40.一种ES细胞培养基，其特征在于，该培养基含有(a)TGF-β受体激动剂；(b)通过gp130作用的细胞因子；和其中培养物无血清和血清提取物。
41.一种ES细胞培养基，其特征在于，该培养基含有(a)TGF-β受体激动剂；(b)通过gp130作用的细胞因子；和其中该培养基成分完全确定。
42.如权利要求39所述的培养基，其特征在于，还含有抑制ES细胞分化的制剂。
43.如权利要求37-40任一所述的培养基，其特征在于，所述通过gp130作用的细胞因子是浓度为至少10U/ml，优选至少50U/ml的LIF。
44.如权利要求37-40任一所述的培养基，其特征在于，用于培养成年人组织的多能干细胞。
45.一种获得分化细胞的方法，其特征在于，该方法包括根据权利要求20-32任一所述的方法培养多能细胞，并使得或导致多能细胞分化，其中所述多能细胞含有能在所需的分化细胞中与其它细胞类型，包括多能干细胞中差异表达的可选择标记，而该可选标记的差异表达，可导致所需分化细胞优势分离和/或存活和/或分裂。
46.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述分化的细胞是组织干细胞或祖细胞。
47.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述分化的细胞是终末分化的细胞。
48.一种分离多能干细胞或EG细胞的方法，其特征在于，该方法包括在含有(a)通过gp130作用的细胞因子；和(b)TGFβ受体激动剂；和/或(c)FGF受体抑制剂。的培养基中培养胚胎、胎儿和成年人的组织。
49.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述培养基是成分完全确定的培养基。
50.一种以下物质组合的用途(a)FGF受体信号传递抑制剂；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白，其特征在于，用于促进培养物中的多能细胞自我更新。
51.一种获得分化的细胞的方法，其特征在于，该方法包括在含有(a)TGF-β超家族受体信号传递途径下游激活蛋白；和(b)gp130下游信号传递途径激活蛋白的培养基中维持ES细胞；从培养基除去(a)和(b)之一或两者；可任选的，在培养基中加入其它信号传递因子；和从而获得所需的分化细胞。
全文摘要
用TGF－β超家族下游信号传导途径激活蛋白和gp130下游信号传导途径激活蛋白的组合，促进多能细胞在培养物中的自我更新。
文档编号C12N15/09GK1659273SQ03812910
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月8日 优先权日2002年5月8日
发明者A·G·史密斯, 应其龙 申请人:爱丁堡大学