专利名称：诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的方法
技术领域：
本发明涉及一种胚胎干细胞向神经细胞的分化的方法，尤其是涉及一种诱导小鼠 胚胎干细胞向神经细胞分化的方法。
背景技术：
胚胎干细胞来自囊胚内细胞团，在体外可长期自我复制，并且具有分化出内、中、 外3个胚细胞的多潜能性。很多研究表明小鼠胚胎干细胞(mouseembryonic stem cells, mESCs)可在体外被定向诱导分化为神经细胞。目前，国内外诱导方法大致可以分为两大类基因修饰和基因外诱导。基因修饰， 是将一个神经特异性基因转染入胚胎干细胞(Embryonic stemcells，ESCs)，再通过筛选报 告基因或标志基因而得到神经细胞。基因外诱导，是在基因外即细胞水平对胚胎干细胞进 行诱导使其分化，包括使用特异性诱导剂、基质细胞共培养法和序贯诱导法等。序贯诱导法是模仿体内胚胎细胞的生长、分化环境，按ESCs生长阶段逐步改变血 清浓度及培养液成分，逐步添加生长因子、神经营养因子等，诱导ESCs定向分化。最常用的 特异性诱导剂是维甲酸，但其缺点是需要将mESCs先培养形成拟胚体，而由于拟胚体中含 有3个胚层的细胞，不利于分析和研究神经细胞分化的调节，而且使用诱导剂还可能干扰 神经形成的模式和神经元的均一性。目前小鼠胚胎干细胞体外向神经细胞方向诱导分化其 分化的过程难控制，实验的操作方法复杂，分化比率低仅达50% 70%。干细胞等未分化 或低分化细胞混杂现象依然存在，严重影响后续研究和应用。如何在体外定向、高效、稳定 地诱导胚胎干细胞向神经细胞分化是本研究领域的难点之一，亟需建立一种小鼠胚胎干细 胞诱导分化为神经细胞的稳定、高效、简便的实验方法。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的问题而提供一种稳定、高效、简便的 小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法。本发明小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法，包括如下步骤(1)、饲养层细胞制备采用原代鼠胚成纤维细胞(PMEF)作为饲养层；取无菌孕12-15天小鼠胚胎，剪碎， 然后采用重量百分含量为0. 125-0. 25%的胰蛋白酶，20-25°C消化30-60分钟，共1_2次，用 含有高糖DMEM和体积分数为10%胎牛血清为培养液，置于37°C、含体积分数为5%的C02 环境下，培养5-10天，使用第2-4代增殖状态好的PMEF，加入10mg/L的丝裂霉素C，37°C， 作用2. 5小时，充分洗涤后得饲养层细胞备接种用；(2)、小鼠胚胎干细胞(mESCs)的培养将mESCs以l.OXloSL-Ll.OXlO9!/1的密度接种于饲养层细胞上，置于37°C、含体 积分数为5%的C02环境下培养，每隔24-48小时换PMEF培养液，每3-4天按1 4 1 6 比例传代，使小鼠胚胎细胞逐渐得到扩增和纯化；
(3)、小鼠胚胎干细胞(mESCs)的诱导分化将扩增和纯化后的小鼠胚胎细胞将接种于无饲养层、无包被的培养板中，使用神 经干细胞培养液和mESCs培养液的混合液，置于37°C、含体积分数为5 %的C02环境下培养； 换液后使用神经干细胞培养液，逐渐更换为完全使用无血清添加碱性成纤维细胞生长因子 的神经细胞培养液，直至第5-10天；上述神经干细胞培养液，为DMEM-F12，体积分数为5 %胎牛血清、5 %马血清和 mESCs培养液含高糖DMEM、0 -巯基乙醇、非必需氨基酸、体积分数为15%胎牛血清，重组 人白血病抑制因子，即按照mESCs培养液与神经干细胞培养液的比例1 1培养，换液后使 用神经干细胞培养液培养，逐渐更换为完全使用无血清添加浓度为lOy g/L碱性成纤维细 胞生长因子的神经细胞培养液培养，其中含有DMEM-F12、N2、B27和碱性成纤维细胞生长因 子。本发明在诱导时均使用6孔培养板，每次只改变1个条件，保证其余条件不变。 选择3个实验条件即(1)诱导时首次接种所用培养液的胎牛血清浓度梯度；(2)诱导时 mESCs首次接种的密度梯度；(3)完全更换为无血清培养液的时间梯度进行优化；逐步降 低培养液的血清浓度和添加细胞生长因子，进行神经方向的定向诱导；在mESCs诱导分 化时首次接种所用培养液的最佳血清浓度为12.5%，首次接种mESCs的最佳接种密度为 1. OX lO8!/1，完全更换为无血清培养液的时间为第5天。本发明与现有技术比较的优点如下本发明操作简单、细胞毒性小，既不需要形成拟胚体也不需要联合共培养，易 于控制培养条件，便于观察诱导期间细胞的形态变化，并对诱导后细胞进行免疫荧光染 色和流式细胞仪检测，该方法而且产生的神经元纯度较高；首次得出了诱导分化比率为 89. 91 士2. 03%。本发明实验周期短，实验方法简便，诱导效果稳定、高效，并能快捷的完成 一个细胞培养周期，利于后续实验的进行。
图1具体实施例中，倒置荧光显微镜下观察未分化mESCs的照片，生长于饲养层上 的未分化mESCs聚集呈圆形或椭圆形集落样生长，细胞排列紧密，集落边界清楚。A为放大 100倍的照片；B为放大400倍的照片。图2具体实施例中，优化诱导第4天显微镜下mESCs放大100倍照片。出现细胞 呈多角形，伸出突起，向四周伸展。图3是具体实施例中，优化诱导第10天显微镜下mESCs放大100倍照片。图3黑 箭头分化细胞突起逐渐变长、变细，与邻近分化细胞交织呈网状。贴壁分化细胞大多为双极 细胞，胞体圆亮，两极各有一细长突起，至诱导第10天有的突起可达胞体长度的10倍以上。 也有小部分分化细胞胞体呈多边形，有多个短突起，仅有1个细长突起，类似多级神经元。 高倍镜下可见一些突起末端与其他细胞突起接触，末端膨大，类似突触样结构；见图3白箭 头还有的细胞突起末端膨大，类似生长端样结构。图4是是具体实施例中，分化细胞至优化诱导的免疫荧光染色照片，神经元特异 性标志物巢蛋白、神经细胞微管蛋白Jl(TUJl)、神经元特异性核蛋白、神经细胞黏附分 子1表达阳性，神经胶质细胞标志物胶质细胞纤维酸性蛋白表达阴性。A为第4天放大400倍照片；B、为第10天放大400倍照片。图5是具体实施例中，蛋白免疫印迹检测未分化mESCs、分化第4天和分化第10天 细胞神经细胞特异性抗TUJ1的灰度值图，与未分化mESCs相比，诱导分化第4天和第10天 的细胞蛋白免疫印迹检测神经细胞微管蛋白J1表达升高(P<0.05)。图6是具体实施例中，流式细胞仪检测各阶段神经元样细胞阳性细胞计数。图7是流式细胞仪检测各阶段神经元样细胞神经元特异性核蛋白阳性细胞百分 比图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例详细描述本发明实施例1本发明小鼠胚胎干细胞培养及诱导分化的方法，包括下述步骤1、饲养层细胞制备采用PMEF作为饲养层，无菌取孕13. 5d鼠胚，去头、尾、四肢和内脏，剪碎，0. 25% 胰蛋白酶-EDTA消化30分钟，应用PMEF培养液，在37°C、含体积分数为5%的C02环境下 培养，培养8天，使用第2代增殖状态好的PMEF，加入10mg/L的丝裂霉素C，作用2. 5小时， 充分洗涤后接种于75ml培养瓶内，接种密度1. OXIOV1 ；2、mESCs 的培养mESCs以1. OX lO8!/1的密度接种于饲养层细胞上，每隔24 48小时换液，每3天 以1 4比例传代，见图1 ；当细胞达80%融合时，用重量百分含量为0.25%的胰蛋白酶消 化成单细胞悬液，接种于原培养瓶中，使用PMEF培养液，37°C孵育2小时，离心以去除PMEF， 计数后备重新接种用。3、mESCs的诱导分化将在饲养层细胞接种培养的mESCs，接种于无饲养层、无包被的6孔培养板中，使 用神经干细胞培养液和mESCs培养液，二者比例为1 1，在37°C、含体积分数为5%的C02 环境下培养，记为第1天。以后每24小时进行换液，使用神经干细胞培养液；逐渐更换为完 全使用无血清添加浓度为10 u g/L碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液，再继续每 48小时换液1次，直至第5天。实施例2本发明小鼠胚胎干细胞培养及诱导分化的方法，包括下述步骤1、饲养层细胞制备采用PMEF作为饲养层，无菌取孕13. 5d鼠胚，去头、尾、四肢和内脏，剪碎，0. 125% 胰蛋白酶-EDTA消化30分钟，应用PMEF培养液，在37°C、含体积分数为5%的C02环境下培 养，培养10天，使用第4代增殖状态好的PMEF，加入10mg/L的丝裂霉素C，作用2. 5小时， 充分洗涤后接种于75ml培养瓶内，接种密度1. OX lO8!/1 ；2、mESCs 培养mESCs以1. 0X 108广的密度接种于饲养层细胞上，培养48小时，更换培养液，弃去 未贴壁细胞，根据细胞生长情况，每4天全量换液一次，待细胞达90 %融合时，用重量百分 含量为0.125%的胰蛋白酶消化，然后按1 6比例传代接种于原培养容器中，使用PMEF培养液，37°C孵育2小时，离心以去除PMEF，计数后备重新接种用；3、mESCs的诱导分化将在饲养层细胞接种培养的mESCs，接种于无饲养层、无包被的6孔培养板中，使 用神经干细胞培养液和mESCs培养液，二者比例为1 1的混合液培养，37°C、含体积分数 为5 %的C02环境下培养，记为第1天；以后每48小时进行换液，使用神经干细胞培养液培 养，逐渐更换为完全使用无血清添加浓度为10 y g/L碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞 培养液，每48小时换液1次，直至第10天。实施例3本发明小鼠胚胎干细胞培养及诱导分化的方法，包括下述步骤1、本发明的诱导分化条件优化在诱导时均使用6孔培养板，每次只改变1个条件，保证其余条件不变。优化序贯 诱导法的3个实验条件即(1)诱导时首次接种所用培养液的胎牛血清浓度梯度①血清浓 度10%。②血清浓度12. 5%。③血清浓度15%。(2)诱导时mESCs首次接种的密度梯度 ①接种密度1. OX lCTL—1。②接种密度1. OX lO9!/1。③接种密度1. OX lO8!/1。④接种密度 LOXlCfL—1。(3)完全更换为无血清培养液的时间梯度①首次接种后第4天。②首次接种 后第5天。③首次接种后第6天。2、本发明的诱导条件的优化结果(1)诱导时首次接种所用培养液的最佳血清浓度为12. 5% “序贯诱导法”是在分 化时利用血清饥饿办法，逐步降低血清浓度，诱导干细胞分化。于是在诱导时首次接种应用 的培养液为神经干细胞培养液，血清总浓度为10%，但实验发现首次接种即从培养mESCs 时15%的血清浓度直接降为10%的血清浓度，会使得分化后的细胞特别不易贴壁，尤其是 接种在盖片上时，贴壁细胞更少，不利于后续的免疫荧光实验。但如果首次接种仍用血清浓 度为15%的mESCs培养液，又会由于血清浓度偏高，分化后细胞依然如胚胎干细胞一样的 呈集落样生长，不形成单细胞，不利于分化。最终实验得出首次接种所用培养液的血清总浓 度为12.5%，即按照mESCs培养液与神经干细胞培养液1 1的比例，可以使分化后细胞既 易于贴壁生长，又可形成单细胞。(2)诱导时首次接种mESCs的最佳密度为1. OX lO8!/1 为了将诱导分化时mESCs 接种的密度进行量化，本实验又进行了密度梯度实验。结果发现，当mESCs的接种密度为 1. 0X 109广，甚至更高达1. OX lO"!—1时，细胞之间空隙狭小，随着分化的进行，细胞排列更 加紧密，无法见到形成突触。当接种密度为l.OXlO7!/1，细胞密度又太小，细胞之间空隙 较大，随着分化的进行，细胞突触之间形成连接直至网状需要很长时间，延迟了整个分化进 程。而当接种密度为l.OXlO8!/1，细胞密度适中，既利于形成突触，又使得彼此邻近的分化 细胞容易很快交织呈网状。(3)完全更换为无血清培养液的时间为第5天根据大量的实验，发现在诱导第4 天，分化细胞已开始由神经前体细胞/神经干细胞向成熟神经细胞分化，那么由含体积分 数为10%血清的神经干细胞培养液，逐步更换为无血清培养液，直至最终完全使用为无血 清培养液的时间应为诱导第5天，以后继续每48h换液1次，直至第10天，可以既高效又快 速地完成一个细胞培养周期。本发明通过实验优化后，确定了在诱导分化时首次接种所用培养液的最佳血清浓
6度为12.5%，首次接种!1￡3(^的最佳接种密度为l.OXlO8!/1，完全更换为无血清培养液的 时间为第5天。本发明方法诱导分化的细胞于第2天出现一定的形态变化，细胞呈多角形，诱导 第4天起开始出现明显形态变化，细胞逐渐伸出突起，向四周伸展，见图2。随后，分化细胞 突起逐渐变长、变细，与邻近分化细胞交织呈网状。贴壁分化细胞大多为双极细胞，胞体圆 亮，两极各有一细长突起，至诱导第10天有的突起可达胞体长度的10倍以上。也有小部分 分化细胞胞体呈多边形，有多个短突起，仅有1个细长突起，类似多级神经元。高倍镜下可 见一些突起末端与其他细胞突起接触，末端膨大，类似突触样结构(见图3黑箭头)；还有 的细胞突起末端膨大，类似生长端样结构，见图3白箭头。可见，本发明可将mESCs高比例 的诱导为神经元样细胞。免疫荧光法检测神经细胞特异性抗原取生长于盖片的PMEF、mESCs和诱导第4 天，第10天细胞，体积分数为10%的甲醛溶液固定，0. 2% Triton X-100透化，5% BSA封闭 后，用下列一抗兔抗鼠巢蛋白、兔抗鼠神经细胞黏附分子1、兔抗鼠胶质细胞纤维酸性蛋 白、鼠抗鼠神经元特异性核蛋白、鼠抗鼠神经细胞微管蛋白J1，室温孵育1小时。二抗 均为对应荧光抗体FITC、TRITC，室温30分钟，lmg/L DAPI作用1分钟复染细胞核。95%甘 油封固，倒置荧光显微镜下观察。诱导后第10天细胞免疫荧光法检测神经元特异性标志物 巢蛋白、神经细胞微管蛋白J1、神经元特异性核蛋白、神经细胞黏附分子1表达阳性，神 经胶质细胞标志物胶质细胞纤维酸性蛋白表达阴性。即分化细胞至诱导第4天和第10天， 可以表达多种神经细胞标志物见图4。蛋白免疫印迹检测神经细胞特异性抗原取mESCs和诱导第4天和第10天细胞， 提取细胞蛋白。采用考马斯亮兰法(G-250)测定样品中的蛋白质含量。根据检测结果，用 裂解缓冲液将各个样品蛋白浓度调至相同。制备10%分离胶和4%浓缩胶，上样蛋白量为 40iig，进行电泳。经过转膜印迹，加入一抗鼠抗鼠TUJ1进行杂交。结果采用FlourChem V2. 0凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析。检测显示，与 未分化鼠胚胎干细胞相比，诱导分化第4天和第10天的细胞蛋白免疫印迹检测神经细胞 3 -微管蛋白J1表达升高(P < 0. 05)。见图5。流式细胞仪测定神经元样阳性细胞数，并计算诱导分化比率取PMEF、mESCs、诱 导第4天和第10天细胞，加入胰酶消化后，用培养液终止。体积分数为10%的甲醛溶液固 定，0.2% Triton X-100透化。加入一抗鼠抗鼠NeuN，室温孵育30分钟。二抗为对应荧光 FITC抗体，室温30分钟，PBS洗1次，即可应用流式细胞仪检测阳性细胞数，并用统计软件 计算诱导分化比率。PMEF培养液、mESCs培养液诱导第4天和第10天神经元样阳性细胞 计数分别为(4. 56 士0. 22) %，(8. 27 士0. 63) %，(36. 67 士 5. 39) %和(93. 62 士 2. 03) %，与 PMEF培养液相比，诱导第4天和第10天差异均有显著性意义(P < 0. 05)，而mESCs培养液 与PMEF培养液相比，差异无显著性意义(P > 0. 05)。经计算得出至分化第10天，诱导分化 比率为(89. 91 士2. 03)%，见图6，图7。通过对诱导分化条件进行优化，分化后的细胞密度适中，分散均勻，既易于贴壁生 长，又可形成单细胞；既利于形成突触，又使得彼此邻近的分化细胞容易很快交织呈网状。 该方法重复性好、稳定性佳，显著提高了胚胎干细胞向神经前体细胞/神经干细胞及成熟 神经细胞分化的效率。
权利要求
一种小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法，其特征在于包括如下步骤(1)、饲养层细胞制备采用原代鼠胚成纤维细胞作为饲养层；取无菌孕12 15天小鼠胚胎，剪碎，然后采用重量百分含量为0.125 0.25％的胰蛋白酶，20 25℃消化30 60分钟，共1 2次，用含有高糖DMEM和体积分数为10％胎牛血清为培养液，置于37℃、含体积分数为5％的CO2环境下，培养5 10天，使用第2 4代增殖状态好的PMEF，加入10mg/L的丝裂霉素C，37℃，作用2.5小时，充分洗涤后得饲养层细胞备接种用；(2)、小鼠胚胎干细胞的培养将mESCs以1.0×108L 1 1.0×109L 1的密度接种于饲养层细胞上，置于37℃、含体积分数为5％的CO2环境下培养，每隔24 48小时换PMEF培养液，每3 4天按1∶4～1∶6比例传代，使mESCs逐渐得到扩增和纯化；(3)、小鼠胚胎干细胞的诱导分化将扩增和纯化后的mESCs接种于无饲养层、无包被的培养板中，使用神经干细胞培养液和mESCs培养液的混合液，置于37℃、含体积分数为5％的CO2环境下培养；换液后使用神经干细胞培养液，逐渐更换为完全使用无血清添加碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液，直至第5 10天；上述神经干细胞培养液，为DMEM F12，体积分数为5％胎牛血清、5％马血清和mESCs培养液含高糖DMEM、β 巯基乙醇、非必需氨基酸、体积分数为15％胎牛血清，重组人白血病抑制因子，即按照mESCs培养液与神经干细胞培养液的比例1∶1培养，换液后使用神经干细胞培养液培养，逐渐更换为完全使用无血清添加浓度为10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液培养，其中含有DMEM F12、N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法，其特征在于还 包括在mESCs诱导分化时首次接种所用培养液的最佳血清浓度为12. 5%，首次接种mESCs 的最佳接种密度为1.0 XIO8!/1，完全更换为无血清培养液的时间为第5天。
全文摘要
本发明涉及的是一种诱导小鼠胚胎干细胞(mESCs)向神经细胞分化的方法，该方法采用原代鼠胚成纤维细胞(PMEF)作为饲养层，取mESCs接种于饲养层上，接种于神经干细胞、mESCs培养液的混合液及神经干细胞培养液培养；逐渐更换为完全使用无血清添加碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液培养。其中首次接种所用混合液的最佳血清浓度为12.5％，首次接种mESCs的最佳接种密度为1.0×108L-1，完全更换为无血清培养液的时间为第5天。经本发明方法诱导，小鼠胚胎干细胞在体外可分化为神经细胞。该方法实验周期短，实验方法简便，诱导效果稳定、高效，并能快捷的完成一个细胞培养周期，利于后续实验的进行。
文档编号C12N5/0735GK101892191SQ20101022229
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者刘朝阳, 庞希宁, 施萍, 李晓丰, 顾文佳 申请人:中国医科大学