专利名称：用于胚胎干细胞未分化增殖的包括大田软海绵酸的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于人类胚胎干细胞未分化增殖的包括大田软海绵酸(okadai c acid)的培养基组合物，并涉及一种在该培养基组合物中诱导人类胚胎干细胞未分化增 殖的方法。
背景技术：
人类胚胎干细胞(hESCs)是来自胚胎的细胞，它们具有分化为构成人体所有器官 的细胞的潜力。自从Thomson小组(Thomson JA等，Science 1998， 282: 1145-1147 ) 和Reubinoff小组(Reubinoff B等，Nat Biotechnol 2000， 18: 399-404)建立了多 潜能干细胞hESCs以来，多潜能干细胞hESCs已经被用作有效治疗被认为是不治之症的 细胞来源。通常，它们的培养需要MEF (小鼠胚胎成纤维细胞)飼养细胞的支持。不幸 地是，当将hESCs与该小鼠细胞共同培养时，来自该异种饲养的病原具有交叉迁移的风 险，从而限制了它们的医学应用。
为克服该缺点，致力于获得人类细胞来源的饲养培养系统或者无饲养培养系统的广 泛研究已经进行(Richards M等，Nat Biotechnol 2002, 20: 933-936; HovattaO等， Hum R印rod 2003， 18: 1404-1409; Amit M等，Biol R印rod 2003， 68: 2150-2156; Richards M等，干细胞2003, 21: 546-556; XuC等，Nat Biotechnol 2001, 19: 971-974; Rosier等,DevDyn2004， 229: 259-274; Carpenter等,DevDyn 2004， 229: 243-258; Amit等，Biol R印rod 2004, 70: 837-845; SatoN等,Nat Med2004， 10: 55-63; Xu R-H等，Nat Methods 2005, 2: 185-190; XuC等，干细胞2005, 23: 315-323 )。 Hovatta 小组(Hum R印rod 18: 1404, 2003 )报道了一种培养系统，在该培养系统中人包皮成 纤维细胞被用作饲养细胞，以刺激人类胚胎干细胞的产生。Amit (Biol R印rod68: 2150, 2003)和Richards (干细胞21: 546, 2003 )也提供了用于未分化hESCs的生长的人类 来源的饲养细胞系统。Xu小组(Nat Biotechnol 18: 399, 2000)使用MEF来源的CM (条件培养基)和例如昆布氨酸和基质胶的基质建立无饲养培养系统。通过采用由Xu 小组建立的该条件培养基，Rosier (Dev Dyn 229: 259, 2004 )成功地在无祠养条件下 供养hESCs—年或更长。然而，这种条件培养基遭受着将小鼠源的成分保留在培养基中 的缺点。Xu等在2005年发现保持在bFGF中的培养物，既可以单独地也可以与其它因子
结合，显示出与MEF-CM对照培养物相似的特性，从而得到即使在没有条件培养基的情 况下，碱性成纤维细胞生长因子支持未分化人类胚胎干细胞生长的结论(干细胞23: 315, 2005)。同样Sato等报道到在缺乏饲养细胞(Nat. Med 10: 55, 2004)时使用GSK-3-特异抑制剂BIO通过激活Wnt信号通路可使小鼠和人类胚胎干细胞保持未分化。Xu小组 同样在补充了 bFGF和BMP拮抗剂Noggin基因(Nat Methods 2: 185， 2005 )的无饲养 培养基中成功供养hESCs。
本发明人在这种背景下在无饲养条件下对hESCs的增殖进行集中并透彻的研究，结 果发现大田软海绵酸允许未分化的hESCs在缺乏饲养细胞时进行增殖并显示包括正常干 细胞标记物和染色体组型稳定的特性，从而导致本发明。
发明内容
因此本发明的一个目的是提供用于诱导胚胎干细胞未分化增殖的包括大田软海绵 酸的培养基组合物。
本发明的另 一个目的是提供诱导胚胎干细胞在所述培养基组合物中进行未分化增 殖的方法。
图1显示在无饲养条件下大田软海绵酸对胚胎干细胞生长的影响。大田软海绵酸在 (A, B)中添加lnM的量，在(C)中添加0. lnM的量，在(D)中未添加。
图2显示人类胚胎干细胞在饲养细胞层(A)和在缺乏饲养细胞(B-D)中的生长。 图3显示人类胚胎干细胞在无碱性成纤维生长因子(bFGF)培养系统(A)和在包括
InM大田软海绵酸的无碱性成纤维生长因子(bFGF)培养系统(B)中的饲养细胞层中的生长。
图4显示在根据本发明的无饲养条件下人类胚胎干细胞的生长具有正常染色体组型。
图5显示在根据本发明的无饲养条件下生长的人类胚胎干细胞上有表达的未分化标 最佳实施方式
在研究干细胞和其使用中的一个十分重要的技术目标是在分化开始前的未分化状
态下供养并增殖胚胎干细胞。
根据本发明中的一个实施例，本发明涉及包含能够诱导胚胎干细胞进行未分化增殖 的大田软海绵酸的培养基组合物。
在此使用的术语"胚胎干细胞"指来自胚胎的细胞，该细胞在维持其多能性的同时 具有增殖的潜力。
能够用于本发明中的胚胎干细胞来源于包括人类，猴子，猪，马，牛，羊，狗，猫， 小鼠，老鼠等的任意动物，并且优选使用哺乳动物的胚胎干细胞，更优选使用人类的胚 胎干细胞。
在此使用的术语"增殖"指细胞数量上的增加，与"生长"具有相同的意思。
在此使用的术语"未分化增殖"指胚胎干细胞增殖，但不增殖为特异性细胞而是增 殖为与该胚胎干细胞具有相同特性的细胞，既增殖为多能性细胞。对本领域的技术人员 显而易见的是未分化细胞可以从已分化的细胞中容易地辨别出来。例如，未分化细胞的 特征是核子对细胞质的比例高并且核仁突出。
本发明人观察到胚胎干细胞可以在大田软海绵酸的存在下在无饲养细胞的培养基 中在未分化的状态下增殖。
作为蛋白磷酸酯酶2A ( PP2A )的抑制剂，已知大田软海绵酸抑制ciyc的降解并增 加c-myc的稳定性(Yeh E等，Nat Cell Bio12004， 6: 208-318)。然而，没有发现关 于大田软海绵酸在胚胎干细胞增殖中扮演角色的报道。在本发明的一个实施例中，通过 检测所有未分化ES标记物nanog, oct-4， rexl和Tert,并观察到正常染色体组型，证 实胚胎干细胞在包括大田软海绵酸的培养基中甚至在15次继代移植后保持未分化。因 此，即使在缺乏飼养细胞的情况下，大田软海绵酸允许胚胎干细胞经历稳定的未分化增 殖。
而且，大田软海绵酸代替生长因子bFGF起作用，生长因子bFGF通常使用于胚胎千 细胞的增殖中。因此，大田软海绵酸可以代替例如bFGF的典型的分化抑制物或与其结 合使用，用于传统的胚胎干细胞培养使用的饲养细胞和基质中。
在此使用的术语"培养基"指确保干细胞在体外生长和存活的介质，并且它可以包 括通常使用在本领域中所有有关的培养基。该培养基和条件根据干细胞的种类决定。优 选细胞培养基础培养基(CC丽)，其通常包括碳源，氮源和微量元素。CCMM的实施例包 括，但不限于，DMEM (达尔伯克改良伊格尔培养基)，MEM (最低必需培养基)，BME (基 本培养基)，RPMI1640, F-IO， F-12, aMEM ( a最低必需培养基),GMEM (格拉斯哥最低
基本培养基)，和伊斯科夫改良达尔伯克培养基。在该CCMM中，可以添加例如青霉素， 链霉素，庆大霉素等的抗生素。
为了实现本发明的目的，诱导胚胎干细胞的未分化增殖，将大田软海绵酸添加到对 培养基种类或培养类型不受限制的胚胎干细胞培养基中。在这点上，大田软海绵酸可以 单独或与 一种或多种分化抑制剂结合使用。
该培养基必须包括大田软海绵酸的有效浓度。该术语"有效浓度"指大田软海绵酸 足以诱导胚胎干细胞的未分化增殖的量。由于低于该有效浓度的浓度不能显示所需要的 效果并且高于该有效浓度的浓度显示出细胞毒性，大田软海绵酸应该在该有效浓度范围 中使用。决定大田软海绵酸有效浓度的因素包括胚胎干细胞的来源，培养基的种类，该 培养基的成分，在该培养基中共同使用的分化抑制剂等等。例如，当大田软海绵酸作为 单一的分化抑制剂在人类胚胎干细胞的培养中使用时，它的有效浓度可以是0. 5至 1. 5nM的数量级。
根据另一个实施例，本发明涉及诱导胚胎干细胞未分化增殖的方法，该方法包括在 包含大田软海绵酸的培养基中培养它们。
根据本发明，在包括大田软海绵酸的培养基中，胚胎干细胞可以在非自发分化下增 殖并将未分化保持到所需要的时间点。
胚胎干细胞可以使用传统方法获得。例如，人类胚胎千细胞的制备可以根据Thomson 的方法实现(U. S.专利号5843780; Science282; 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133ff. , 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA92: 7844， 1995 )。才艮据本发明包括大田软海 绵酸的培养基确保胚胎干细胞在不被来自异种饲养例如那些来自病毒和动物的病菌污 染的情况下下完成未分化增殖。
本发明的更好的理解可以通过下面的实施例给出，这些实施例出于说明的目的，而 不是对本发明的限制。
实施例1: hESCs的培养
13.5天的CF1小鼠胎(ORIENT)作为饲养细胞培养hESC系HSF-6 (加利福尼亚大 学，旧金山)。该饲养细胞在DMEM(高糖，Invitrogen)中培养，并补充10%的FBS (HyClone), 0. ImM的0-巯基乙醇，和0. ImM的非必需氨基酸，并随后用lOug/ml的 丝裂霉素C (sigma)处理1.5小时以结束它们的有丝分裂。随后，用丝裂霉素C处理过 的饲养细胞以每孔6. 1 x 104细胞密度接种在0. 1%凝胶涂覆的四孔培养皿中。在接种了 该饲养细胞后的当天，接种hESC,并在5-7天时间间隔以机械方式继代培养。
该hESC在达尔伯克改良伊格尔培养基/F12 (面EM/F12,无丙酮酸盐)中培养，补 充20%的无(knockout)血清替代品(SR) (Gibco/BRL, Invitrogen, Carlsbad， CA)， 0. 1 mM的e -巯基乙醇，1%的非必需氨基酸(Gibco/BRL ), 100U/ml青霉素G, 100g/ml 链霉素，和4ng/ml的hr-bFGF (人类重组碱性成纤维细胞生长因子，Invitrogen)。在 图2A中，显示CF1小鼠饲养细胞层上的hESC。
实施例2:大田软海绵酸对人类胚胎干细胞的影响
大田软海绵酸对在饲养细胞层上生长的hESCs的影响用大田软海绵酸在人类胚胎干 细胞培养基中的各种浓度(0.01， 0.1， 1, 10， 100nM)进行评估。在添加10或100nM 的大田软海绵酸后的第二天(24小时)，由于大田软海绵酸的细胞毒性，该胚胎干细胞和 该饲养细胞都在该培养基中裂解。相反，在包括lnM或更少的大田软海绵酸的培养基中， 该胚胎干细胞增殖，显示与在没有大田软海绵酸的培养基中培养的对照组相似的形态， 没有观察到大田软海绵酸的毒性。
实施例3:大田软海绵酸在无饲养条件下对人类胚胎干细胞的影响。 在没有饲养细胞下评估大田软海绵酸对hESCs的影响。0. OlnM, 0. lnM,和lnM的 大田软海绵酸添加到使用培养系统中，该培养系统没有条件培养基。在没有使用例如昆 布氨酸和基质胶的基质的情况下，与前面使用这些基质的培养系统对照，四孔培养皿在 室温下用0. 1%的凝胶涂覆30分钟后，该胚胎干细胞机械地分裂。随后，该胚胎干细胞 在包括O. OlnM, 0. lnM,和lnM的大田软海绵酸的培养基中接种。
结果，在0. OlnM和O. lnM大田软海绵酸(图1C)中的该人类胚胎干细胞以与在没 有大田软海绵酸(图1D)的对照组中相似方式增殖，并且在三次继代移植后由于所有细 胞都经历了分化因此没有观察到未分化的干细胞。相反，在lnM大田软海绵酸培养基中 的该人类胚胎干细胞甚至在三次继代移植后(图2B-D)仍保持未分化，没有分化的迹象。 同时观察到在该祠养细胞层上的该胚胎干细胞中核子对细胞质的比例高(图2D)。
实施例4:在没有bFGF下大田软海绵酸对在飼养细胞层上生长的胚胎干细胞的影响 在胚胎干细胞的未分化增殖中bFGF通常的使用浓度是4ng/ml。分析胚胎干细胞在 没有bFGF的包括lnM的大田软海绵酸的培养基中的增殖和分化。在既不包括大田软海 绵酸也不包括bFGF的培养基中，观察到生长在饲养细胞层上的所有胚胎干细胞在两次 或多次继代移植后分化(图3A)。在两次继代移植后，观察到在包括lnM大田软海绵酸 而没有bFGF的培养基中(图3B)的人类胚胎千细胞保持未分化。由此证实大田软海绵 酸代替bFGF起作用。
实施例5:在无飼养条件下ES标记物在hESCs上的表达和hESCs的染色体组型 为检测hESCs在没有饲养细胞下是否表达正常ES标记物，使用RT-PCR。使用Trizol 试剂(Invitrogen)分离总RNA。使用500ng的总RNA，低聚(dT ) 12-18mer引物 (Invitrogen ),和AMV反转录酶(Roche Molesular Biochemical)进行反转录(RT )以 产生cDNA。对于RT-PCR,使用lul的cDNA,每个引物lOpmol,和PCR预混剂(1U Tag DNA聚合酶，250uM dNTPs， lOnMTris-HCL, 40nMKCL和1. 5mM MgCL2 Bioneer, Korea )。 在ES中表达的特异性的对未分化的ES基因标记物nanog ( SEQ ID NOS. : 1和2 )， oct-4 (SEQ ID NOS. : 3和4 ), rexl (SEQ ID NOS. : 5和6)和hTert (SEQ ID NOS.: 7和8)的寡核苷酸在RT-PCR中作为引物使用。)3-肌动蛋白引物(SEQ ID NOS. : 9和 10 )作为阴性对照。就cDNA来说，它来自生长在没有饲养细胞的5, 10和15次继代移 植的hESCs中，而生长在饲养细胞层上hESCs作为阳性对照。图5中的RT-PCR数据显 示所有ES标记物nanog， oct-4， rexl和该ES表达蛋白hTert在没有饲养细胞下生长 的hESCs中的表达，作为阳性对照。委托Samkwang Medical Laboratories染色体组型 分析证实在没有饲养细胞的15次继代移植后得到的细胞显示正常染色体组型。因此， 大田软海绵酸允许在其存在下在无詞养培养系统中hESCs生长，与在饲养细胞层(图4) 生长的那些hESCs具有相同的基因表达特性和染色体组型。
工业实用性
在此所述,根据本发明的包括大田软海绵酸的培养基组合物允许hESCs的未分化增 殖，而没有从来自例如那些病毒和其它动物的异种饲养的病菌交叉迁移的风险。
权利要求
1.一种用于诱导人类胚胎干细胞未分化增殖的培养基组合物，包括大田软海绵酸。
2. 根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述胚胎干细胞来源于人类。
3. 根据权利要求2所述的培养基组合物，其特征在于，所述组合物包括0. 5至1. 5nM 的大田软海绵酸。
4. 一种用于诱导胚胎千细胞未分化增殖的方法，包括在权利要求1所述的培养基组 合物中培养所述的胚胎干细胞。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞来源于人类。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养基组合物包括0.5至 1. 5nM的大田软海绵酸。
全文摘要
本发明公开了一种用于人类胚胎干细胞未分化增殖的培养基组合物，所述的培养基组合物中含有大田软海绵酸，和一种在该培养基中诱导人类胚胎干细胞未分化增殖的方法。
文档编号C12N5/0735GK101180388SQ200580049660
公开日2008年5月14日 申请日期2005年11月18日 优先权日2005年11月18日
发明者全恩暻, 刘承权, 尹炳善, 文哉喜, 朴才汝, 柳炅秀, 郑惠年, 金埔那, 金明珍, 金淇东 申请人:银怎株式会社