作为血栓溶解剂的靶向性纤溶酶原激活物融合蛋白的制作方法

专利名称：作为血栓溶解剂的靶向性纤溶酶原激活物融合蛋白的制作方法
专利说明作为血栓溶解剂的靶向性纤溶酶原激活物融合蛋白 发明领域 本发明涉及用作血栓溶解剂的新型融合蛋白，其包括可操作地连接至纤维蛋白-选择性纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的靶向性蛋白。在一个优选实施方案中，所述靶向性蛋白结合活化的血小板或活化的内皮细胞的表面。

背景技术：
动脉血栓形成是每年影响数百万人的威胁生命的疾病，它由在受损的血管内不受控制的血液凝固和血小板聚集引起。血管内形成的过量纤维蛋白和血小板凝块阻断血流，引起重要的组织或器官的局部缺血性损伤。用于治疗动脉血栓形成例如心肌梗死的经批准的治疗方法使用与抗血小板药和抗凝剂相组合的纤溶酶原激活物。目前使用的纤溶酶原激活物包括组织型纤溶酶原激活物(“tPA”)、尿激酶(“uPA”)和链激酶。这些血栓溶解剂在闭塞性血栓情况下的施用增强了纤维蛋白降解的速率、恢复动脉开放和流向局部缺血组织的血流。冠状动脉血栓溶解疗法已减少了急性心肌梗死患者中的死亡率(参见Collen，D.和Lijnen，H.R.，Blood(1991)，第78卷，第3114-3124页；Topol，E.J.，Prog.Cardiovasc.Dis.(1991)，第34卷，第165-178页)；Verstraete，M.等人，Drugs(1995)，第50卷，第29-42页；Verstraete，M.和Zoldhelyi，P.，Drugs(1995)，第49卷，第856-884页；和Huber，K.和Maurer，G.，Semin.Thromb.Hemost.(1996)，第22卷，第15-26页)。目前的血栓溶解疗法的主要局限性包括出血，最显著的是颅内出血，不能达到足够的心肌再灌注，和冠状动脉再闭塞。然而，由于目前给药方案(例如，前负载的tPA)的引入，已取得了进一步改善冠状动脉血栓溶解速率和程度、或者减少出血危险的少许进展。如此，需要更新的试剂。
已开发了具有改善的血栓溶解特性的纤溶酶原激活物。TNK-tPA是通过重组DNA技术产生的tPA变体。TNK-tPA对于由纤溶酶原激活物抑制剂-1(“PAI-1”)所产生的抑制更有抗性，在循环中具有更长的半衰期，并且可以作为单次快速浓射进行施用(Collen，D.等人，Thromb.Haemost.(1994)，第72卷，第98-104页；和Keyt，B.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)，第91卷，第3670-3674页)。瑞替普酶是仅由tPA的kringle 2和蛋白酶结构域组成的未糖基化蛋白质。瑞替普酶具有的血浆半衰期比tPA更长，但纤维蛋白特异性比tPA低(Martin，U.等人，Thromb.Haemost.(1991)，第66卷，第569-574页)。目前，TNK-tPA和瑞替普酶已批准用于临床使用。
当前血栓溶解疗法的主要局限性之一是出血危险(Rao，A.K.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1988)，第11卷，第1-11页；和Arnold，A.E.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1989)，第14卷，第581-588页)。大约5-10％用血栓溶解疗法治疗的患者经历出血事件。在这些出血事件中，接近10％是颅内出血，这可以是致命的(参见Chesebro，J.H.等人，Cardiol.Clin.(1988)，第6卷，第119-137页；Topol，E.J.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1987a)，第9卷，第1205-1213页；Topol，E.J.等人，J.Am.Coll.Cardiol.(1987b)，第9卷，第1214-1218页；PRIMI Trial Study Group，Lancet(1989)，第1卷，第863-868页；和ISIS Collaborative Group，Lancet(1992)，第339卷，第753-770页)。出血主要是由于纤维蛋白原的非特异性切割和外源性纤溶酶原激活物对于年老的(老的)止血纤维蛋白凝块的过度蛋白水解。除了出血外，血栓溶解剂具有其他局限性。高达25％的急性心肌梗死患者对目前的血栓溶解方案具有抗性。在这些患者中，对于局部缺血的心脏没有显著的心肌再灌注。在另外30-40％的患者中，疗法只在90分钟内达到部分再灌注，所述90分钟是最小化在局部缺血组织中的细胞死亡的临界时间窗(GUSTO AngiographicInvestigators，N.Engl.J.Med.(1993)，第329卷，第1615-1622页；和Barbagelata，N.A.等人，Am.Heart J.(1997)，第133卷，第273-282页)。此外，大约30％的患者在血栓溶解疗法后经历急性冠状动脉再闭塞。闭塞性血栓中正在进行的血小板激活被认为极大地促进血栓溶解疗法的失败(Fay，W.P.等人，Blood(1994)，第83卷，第351-356页；Stringer，H.A.等人，Arterioscler.Thromb.(1994)，第14卷，第1452-1458页；Torr-Brown，S.R.和Sobel，B.E.，Thromb.Res.(1993)，第72卷，第413-421页；Jang，I.K.等人，Circulation(1989)，第79卷，第920-928页；和Kunitada，S.等人，Blood(1992)，第79卷，第1420-1427页)。在体外和体内研究中，发现富含血小板的凝块比富含纤维蛋白、缺少血小板的凝块对血栓溶解更有抗性(Bode，C.等人，Circulation(1991)，第84卷，第805-813页；和Coller，B.S.，N.Engl.J.Med.(1990)，第322卷，第33-42页)。
P-选择素是～140kDa的糖蛋白，其主要贮藏于静止血小板的α颗粒中。在血小板激活后，P-选择素迅速移位至细胞表面，在那里它促进在受损的血管壁中血小板和白细胞的相互作用。在活化的血小板上P-选择素的细胞表面表达持续不超过数小时(McEver，R.P.，Thromb.Haemost.(1991)，第65卷，第223-228页；McEver，R.P.，Curr.Opin.Immunol.(1994)，第6卷，第75-84页；和Lasky，L.A.，Science(1992)，第258卷，第964-969页)。除了血小板外，P-选择素还存在于正常内皮细胞的怀布尔-帕拉德体中。在内皮细胞被组胺和凝血酶激活后，P-选择素迅速再分布至细胞表面。活化的血小板是新形成的血栓内的主要细胞组分，并且活化的内皮细胞在血管损伤部位附近很丰富。相反地，在年老的(老的)止血栓子中的主要组分是纤维蛋白分子。
4种tPA样蛋白质来源于吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)的唾液DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ(Gardell，S.J.等人，Biol.Chem.(1989)，第264卷，第17947-17952页；和Kratzschmar，J.等人，Gene(1991)，第105卷，第229-237页)。这些中，DSPAα1是最长的蛋白质，并且在结构上最类似于人tPA。与切割纤维蛋白原和纤维蛋白的其他纤溶酶原激活物不同，DSPAα1对于纤维蛋白是高度特异的(Bringmann，P.等人(1995)，第270卷，第25596-25603页)。DSPAα1具有的纤维蛋白特异性比tPA大几百倍(Bringmann，P.等人(1995)，同上；参见Toschi，L.等人，Eur.J.Biochem.(1998)，第252卷，第108-112页；Stewart，R.J.等人，Biol.Chem.(1998)，第273，第18292-18299页；和Schleuning，W.D.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1992)，第667卷，第395-403页。在血栓溶解的动物模型中，DSPAα1比tPA更有效(Gardell，S.J.等人，Circulation(1991)，第84卷，第244-253页；Witt，W.等人，Blood(1992)，第79卷，第1213-1217页；和Witt，W.等人，Circulation(1994)，第90卷，第421-426页)。DSPAα1(去氨普酶)处于用于治疗中风的临床开发中。
美国专利号6,008,019公开了这4种DSPA蛋白质，并要求保护DSPAα1作为血栓溶解剂的用途。美国专利号5,830,849公开并要求保护DSPAα2作为血栓溶解剂的用途。
在结构上，DSPAα1和DSPAα2由4个不同的结构域组成纤连蛋白样指(“指”)结构域、表皮生长因子(“EGF”)结构域、三环结构域(kringle domain)和丝氨酸蛋白酶结构域；DSPAβ由3个不同的结构域组成EGF结构域、三环结构域和丝氨酸蛋白酶结构域；和DSPAγ由2个不同的结构域组成三环结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
结构-功能分析证实，指结构域有助于DSPAα1的纤维蛋白依赖性和选择性(Bringmann，P.等人(1995)，同上)。DSPAα1相比tPA而言具有增加的纤维蛋白特异性似乎是由于DSPAα1具有1个三环结构域，而tPA具有2个三环结构域这一事实(Stewart，R.J.等人(1998)，同上)。其他结构-功能分析提示了进行天然t-PA氨基酸序列的不同修饰(例如在cymogene triade中)以便增加t-PA的纤维蛋白特异性(EP 1 308 166 A1)。
发明概述 本发明提供了充当血栓溶解剂的新型融合蛋白，其包括可操作地连接至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的靶向性蛋白，其中所述靶向性蛋白结合血管损伤相关的生物学结构。根据本发明的“血管损伤相关的生物学结构”是其在量方面或在质方面是血管损伤的指示的任何生物学分子或结构。关于血管损伤相关的生物学结构的例子是血小板或内皮细胞表面上的表面分子，其在血栓生成应答(thrombogenic response)过程中已被激活(“刺激”)(例如通过凝血酶的刺激)。这些活化的细胞的表面通常显示比未活化的血小板或内皮细胞明显更高的这些表面分子的表达水平。此类表面分子的一个具体例子是P-选择素(CD62p)。活化的内皮细胞或活化的血小板在血管损伤部位附近很丰富，因此P-选择素代表了“血管损伤相关的生物学结构”。
本发明的血管损伤相关的生物学结构的其他例子是溶酶体缔合性膜蛋白(CD63)(Joern A.Zeller等人，“Circulating plateletsshow increased activation in patients with acute cerebralischemia”Thromb Haemost.，第81卷，第373-377页，1999)或CD40L(Patrick Andre等人，“CD40L stabilizes arterial thrombiby a beta3 integrin-dependent mechanism”Nature Medicine，第8卷，No.3，第247-252页，March 2002)或糖蛋白1bα(JanetteBurgess等人“Physical Proximity and Functional Associationof Clycoprotein 1b alpha and Protein-disulfide Isomerase on thePlatelet Plasma Membrane”The Journal of Biological Chemistry，第275卷，No.13，第9758-9766页，2000)或蛋白质二硫键异构酶(Zaverio Ruggeri，“Platelets in atherothrombosis”NatureMedicine，第8卷，No.11，第1227-1234页，November 2002)。
纤溶酶原激活物可以是任何类型的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。在一个实施方案中，优选使用具有相比天然t-PA而言增加的纤维蛋白特异性或具有kringle 2结构域的修饰/删除的纤溶酶原激活物。特别优选使用最初来源于吸血蝙蝠的纤溶酶原激活物去氨普酶(DSPA)或其部分。优选地，DSPA包括丝氨酸蛋白酶结构域和选自指结构域、EGF结构域和kringle结构域的至少一个其他结构域或其类似物、片段、衍生物或变体。
本发明的血栓溶解融合蛋白靶向并结合血管损伤相关的生物学结构，例如在急性动脉血栓中活化的血小板的表面，随之在新形成的血管损伤(例如富含血小板的血栓)位点处产生高局部浓度的纤溶酶原激活物，允许减少血栓溶解剂的全身剂量，从而最小化对更老的富含纤维蛋白的凝块的溶解效应并达到更广泛的治疗比率。所述融合蛋白可用于治疗下列疾病动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction)、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风。
在另一方面，本发明提供了包括主题血栓溶解融合蛋白的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了用于诱导患者中血栓溶解的方法，包括给所述患者施用治疗有效量的所述血栓溶解融合蛋白。
在另一方面，本发明涉及用于治疗和预防患者中的下列疾病的方法动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风，包括给所述患者施用治疗有效量的血栓溶解融合蛋白。
在另一方面，本发明涉及用于在中风发作后超过3小时，优选超过6小时或甚至超过9小时治疗患者中的急性缺血性中风的方法。
在另外一方面，本发明涉及包括靶向性蛋白的试剂盒，所述靶向性蛋白结合活化的血小板的表面，并可操作地连接至纤维蛋白选择性纤溶酶原激活物。备选地，试剂盒可以包括编码所述血栓溶解融合蛋白的组分的多核苷酸序列。
还公开了重组和合成地制备本发明的血栓溶解融合蛋白的方法。
附图简述

图1。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白和表达质粒的示意图。(A)靶向P-选择素的DSPA融合蛋白。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白由2条Ig轻链和2条Ig重链组成。轻链的组成为SZ51轻链的可变区(VL)，随后为人Igκ的恒定区。重链的组成为SZ51重链的可变区(VH)，随后为人IgG1的恒定区CH1、CH2和CH3，以及成熟的分泌形式的DSPAα1。(B)HuSZ51-DSPAα1表达质粒。轻链构建体pLNOSZ51VK/Hygro-kappa是CMV启动子驱动的表达质粒，其包括选择标记潮霉素。重链构建体pLNOSZ51VHDSPA/Neo是CMV启动子驱动的表达质粒，其包括选择标记新霉素。
图2。HuSZ51-DSPAα1的氨基酸序列。(A)HuSZ51-VLCκ轻链(SEQID NO1)。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的轻链由信号肽(氨基酸1-19)、SZ51轻链的可变区(氨基酸20-128)和人Igκ的恒定区(氨基酸129-235)组成。(B)HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1重链(SEQ ID NO2)。HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的重链由信号肽(氨基酸1-19)、SZ51重链的可变区(氨基酸20-137)、人IgG1的恒定区CH1、CH2和CH3(氨基酸138-467)以及成熟的分泌形式的DSPAα1(氨基酸468-908)组成。
图3。HuSZ51-DSPAα1的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。(A)SDS-PAGE。纯化的HuSZ51-DSPAα1融合蛋白、重组DSPAα1和人IgG1在非还原和还原条件下在4-10％的SDS-PAGE凝胶上分离，并随后用考马斯蓝染色。(B)蛋白质印迹法。在通过SDS-PAGE进行分离后，将HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1和IgG1转移到硝化纤维膜上。DSPAα1通过用生物素化的抗-DSPA单克隆9B3并随后用HRP-抗生物素蛋白进行染色来检测，并且IgG1通过用缀合有HRP的山羊抗人IgG Fc进行染色来检测。
图4。HuSZ51-DSPAα1与P-选择素的特异性结合。(A)硝化纤维膜结合测定法。所示量的重组P-选择素通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维膜上。与固定化的P-选择素结合的HuSZ51-DSPAα1和HuSZ51通过用缀合有HRP的山羊抗人IgGFc进行染色来检测。(B)ELISA。将用重组P-选择素包被的96孔板与所示浓度的HuSZ51-DSPAα1、IgG1或BSA一起孵育。与P-选择素结合的抗体通过用缀合有HRP的蛋白L进行染色来检测，所述蛋白L结合Igκ轻链。
图5。HuSZ51-DSPAα1与SZ51竞争结合P-选择素。基于ELISA的竞争性P-选择素结合测定法用于比较SZ51和HuSZ51-DSPAα1的体外P-选择素结合亲和力。将用重组P-选择素包被的96孔板与所示浓度的HuSZ51-DSPAα1或人IgG1一起孵育，还加上固定量的SZ51。SZ51与固定化的P-选择素的竞争性结合通过与缀合有过氧化物酶的抗小鼠IgG一起孵育，随后与TMB/E底物一起孵育来检测，所述抗小鼠IgG结合SZ51但不结合HuSZ51-DSPAα1。
图6。HuSZ51-DSPAα1与经凝血酶激活的血小板的特异性结合。(A)人血小板。将用经凝血酶激活的血小板包被的96孔板与所示浓度的HuSZ51-DSPAα1、SZ51或人IgG1一起孵育。与活化的血小板结合的抗体通过用缀合有HRP的蛋白L进行染色来检测，所述蛋白L结合Igκ轻链。(B)犬血小板。将用经凝血酶激活的血小板包被的96孔板与所示浓度的HuSZ51-DSPAα1或人IgG1一起孵育。与活化的血小板结合的抗体通过用缀合有HRP的蛋白L进行染色来检测，所述蛋白L结合Igκ轻链。
图7。HuSZ51-DSPAα1对生色底物的催化活性。S-2288(D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺二盐酸盐)是大范围丝氨酸蛋白酶的生色底物。S-2765(α-苄氧羰基-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺二盐酸盐)是丝氨酸蛋白酶因子Xa的生色底物。HuSZ51-DSPAα1和DSPA对来自这些生色底物的对硝基苯胺的水解通过405nm处的吸光度的增加来检测。
图8。HuSZ51-DSPAα1在凝块溶解测定法中的纤维蛋白溶解活性。纤溶酶原激活物例如DSPAα1将纤溶酶原转化为纤溶酶，其反过来降解纤维蛋白。对于HuSZ51-DSPAα1(12.5、25和50nM)和对于等摩尔量的DSPAα1(25、50和100nM)，测定通过405nm处的吸光度监测的纤维蛋白降解速度。在纤维蛋白凝块溶解测定法(上图)中，将纤维蛋白原和纤溶酶原与HuSZ51-DSPAα1或DSPAα1混合；然后将这些混合物加入至凝血酶。血浆凝块溶解测定法(下图)类似于纤维蛋白凝块测定法，除了使用人血浆作为纤溶酶原和纤维蛋白的来源外。
图9。HuSZ51-DSPAα1在缺少血小板和富含血小板的血浆凝块溶解测定法中的血栓溶解活性。在使用缺少血小板(上图)或富含血小板(下图)的血浆的血浆凝块溶解测定法中比较了HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1和uPA的纤维蛋白溶解活性。
发明详述 本发明的血栓溶解融合蛋白包括靶向性蛋白，其结合血管损伤相关的生物学结构，并可操作地连接至纤溶酶原激活物，或其类似物、片段、衍生物或变体。
定义 在本发明的描述中，下列术语如下文所示进行定义。
“血管损伤相关的生物学结构”指通过其量或质来指示血管损伤的所有生物学结构。这种损伤优选相当新鲜的，即不老于数小时。在这个情况下，“结构”指可以形成靶向性蛋白的结合配偶体的任何分子。因此，血管损伤相关的生物学结构是靶向性蛋白的“靶分子”。血管损伤相关的生物学结构的一个例子是P-选择素，其在血栓生成应答的过程中移位到活化的内皮细胞或活化的血小板表面上。因为活化的血小板或活化的内皮细胞在血管损伤附近很丰富，所以P-选择素是血管损伤相关的生物学结构。
“重组蛋白质或多肽”指通过重组DNA技术产生的蛋白质或多肽，即从用编码所需蛋白质或多肽的外源重组DNA表达构建体转化的微生物或哺乳动物细胞产生的蛋白质或多肽。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或多肽将不含聚糖。在酵母中表达的蛋白质或多肽可以具有不同于在哺乳动物细胞中表达的蛋白质或多肽的糖基化模式。取决于使用的表达系统，重组体的糖基化和/或N-末端加工相对于天然蛋白质或多肽而言可能不同。
“天然的”或“天然发生的”蛋白质或多肽指从自然界中存在的来源回收的蛋白质或多肽。术语“天然的DSPA”将包括天然存在的DSPA及其片段，并且将包括DSPA及其片段的翻译后修饰，包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化、酰化和切割。
“融合蛋白”是由至少2个可操作地连接的异源编码序列的表达而产生的蛋白质。本发明的融合蛋白包括结合血管损伤相关的生物学结构的靶向性蛋白，所述靶向性蛋白可操作地连接至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。
“靶向性蛋白”是结合另一种蛋白质(多肽)或蛋白质复合物或者结合任何其他靶分子的蛋白质或肽或者任何其类似物、片段、衍生物或变体。本发明的靶向性蛋白优选是结合活化的血小板表面上的P-选择素的蛋白质。例如抗P-选择素抗体是本发明的靶向性蛋白。
DNA或多核苷酸“编码序列”是当置于合适的调节序列控制下时在宿主细胞中被转录成mRNA并被翻译成多肽的DNA或多核苷酸序列。编码序列的边界由5′N-末端处的起始密码子和3′C-末端处的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包括原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核DNA的基因组DNA序列、和合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3′。
“DNA或多核苷酸序列”是脱氧核糖核苷酸(碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶)的杂聚物。编码本发明的融合蛋白的DNA或多核苷酸序列可以由衍生自合成的cDNA的DNA片段和短寡核苷酸连接体来装配，以提供合成基因，其能够在重组DNA表达载体中表达。在特定双链DNA分子的结构的讨论中，序列在本文中可以根据通常惯例进行描述，即只给出在沿着cDNA非转录链的5′-3′方向上的序列。
“重组表达载体或质粒”是可复制的DNA载体或质粒构建体，其用于扩增或表达编码本发明的融合蛋白的DNA。表达载体或质粒包含DNA控制序列和编码序列。DNA控制序列包括启动子序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域和增强子。如本文定义的，重组表达系统将在调节元件诱导下表达融合蛋白。
“转化的宿主细胞”指已用外源DNA转化和转染的细胞。外源DNA可以整合或不整合(即共价连接)至构成细胞基因组的染色体DNA。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以维持在游离型元件例如质粒上，或稳定整合到染色体DNA中。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是外源DNA已整合到染色体复制中的细胞。这种稳定性通过真核细胞系或克隆产生包含所述外源DNA的子细胞群的能力来证实。
“纤溶酶原激活物”指将无活性的纤溶酶原转化为活性的纤溶酶的所有蛋白质或多肽，或其类似物、片段、衍生物或变体。纤溶酶原激活物的例子是DSPA(去氨普酶)、t-PA或尿激酶(包括其任何部分或修饰)。基于t-PA、DSPA或尿激酶的所有经修饰的纤溶酶原激活物分别概述为“t-PA衍生的纤溶酶原激活物”、“DSPA衍生的纤溶酶原激活物”或“尿激酶衍生的纤溶酶原激活物”。这些“衍生的”纤溶酶原激活物基本上分别对应于天然形式的t-PA、DSPA和尿激酶，尽管它们可以携带涉及蛋白质结构域或其部分的某些删除以及氨基酸删除或置换。
“DSPA”指来源于吸血蝙蝠的纤溶酶原激活物，其可以是分离的(和纯化的)或者重组或合成产生的。DSPA包括成熟的、分泌的(经加工的)形式的DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ，及其类似物、片段、衍生物和变体，以及所述类似物、衍生物和变体的片段。编码天然DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的基因已从吸血蝙蝠中分离并进行了测序(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上；和美国专利号6,008,091和5,830,849，所有这些文献引入本文作为参考)。所有4种形式的DSPA均包含36个氨基酸的信号序列，其被切掉以形成成熟的分泌型DSPA。在重组生产后并取决于所使用的表达系统，DSPA的N末端序列由于前导序列的不精确加工而可能不同。然而，生物学功能保持不变。
“DSPA结构域”指不连续的氨基酸序列，其可以与DSPA的特定功能或特征相关联，例如特征性的三级结构单元。DSPA结构域包括指结构域、EGF结构域、kringle结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAα1是441个氨基酸的多肽，其被组织成4个不同结构域指结构域(氨基酸6-43)、EGF结构域(氨基酸43-92)、kringle结构域(氨基酸92-174)和丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸174-441)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAα2是441个氨基酸的多肽，其被组织成4个不同结构域指结构域(氨基酸6-43)、EGF结构域(氨基酸43-92)、kringle结构域(氨基酸92-174)和丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸174-441)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAβ是395个氨基酸的多肽，其被组织成3个不同结构域EGF结构域(氨基酸5-46)、kringle结构域(氨基酸46-127)和丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸127-395)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
成熟的DSPAγ是358个氨基酸的多肽，其被组织成2个不同结构域kringle结构域(氨基酸9-90)和丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸90-358)(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。
当涉及本发明的融合蛋白或者涉及靶向性蛋白、纤溶酶原激活物或结构域时，术语“类似物”、“片段”、“衍生物”和“变体”指融合蛋白、靶向性蛋白、纤溶酶原激活物或结构域的类似物、片段、衍生物和变体，其保留了基本上相同的生物学功能或活性，如下文进一步描述的。
“类似物”包括在其内包含本发明融合蛋白的氨基酸序列的多肽原。本发明的活性融合蛋白可以通过天然的体内加工或通过本领域众所周知的操作例如通过酶促或化学切割而从完成前融合蛋白(pro-fusion protein)分子的另外氨基酸上切割下来。例如，天然的DSPAα1天然地被表达为477个氨基酸的多肽原，其随后进行体内加工以释放441个氨基酸的活性成熟多肽。
“片段”是融合蛋白、靶向性蛋白或结构域的部分，其保留了与所述融合蛋白、靶向性蛋白或结构域基本上相似的功能活性，如在本文中公开的体外测定法中所显示的，这在下文中进一步描述。
“衍生物”包括对于融合蛋白的所有修饰，其基本上保持了本文公开的功能并包括另外的结构和伴随功能，例如，具有更长半衰期的PEG化的融合蛋白、通过加入硫酸软骨素进行修饰的O-糖基化融合蛋白、和生物素化的融合蛋白，如下文进一步描述的。
“基本上相似的功能活性”和“基本上相同的生物学功能或活性”各自表示，当每种多肽的生物活性通过相同的操作程序或测定法进行测定时，生物活性程度在与之相比较的多肽所显示的生物活性的约30％-100％或更多之内。例如，具有与DSPAα1基本上相似的功能活性的融合蛋白或DSPA结构域是，当在分别于实施例5和6中所描述的催化或纤维蛋白溶解测定法中进行测试时，显示出体外水解生色底物或溶解凝块的能力的那些。具有与抗P-选择素抗体SZ51基本上相似的功能活性的靶向性蛋白是，当在如实施例2、3和4中描述的结合测定法中进行测试时，显示出结合P-选择素或活化的血小板或者与SZ51体外竞争结合P-选择素的能力的那些。
两个多肽之间的“相似性”通过将一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸置换与第二种多肽的序列进行比较来测定。此类保守置换包括中在下列文献中描述的那些Dayhoff，M.O.，ed.，The Atlas ofProtein Sequence and Structure 5，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.(1978)，和Argos，P.，EMBO J.(1989)，第8卷，第779-785页。例如，属于下列组之一的氨基酸代表了保守改变 -Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr； -Cys、Ser、Tyr、Thr； -Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe； -Lys、Arg、His； -Phe、Tyr、Trp、His；和 -Asp、Glu。
“哺乳动物”包括人和家养动物，例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔等。
本文所使用的“治疗比率”或“治疗指数”指，将对于在哺乳动物的疾病治疗中产生一定功效所需的本发明融合蛋白的量(包括，例如，到达再灌注的时间、再灌注的持续时间或血栓形成的预防)除以对于在同一哺乳动物中引起特定的不想要的不利效应所需的融合蛋白的量(包括，例如，出血时间或疾病的替代标记的表达)。本发明融合蛋白的治疗比率或指数为至少2，但优选至少5，并更优选10-20。本发明融合蛋白的治疗比率或指数可以依靠其更佳的溶解效能、其更少的出血危险或两者而增加。
“治疗有效量”指，当施用给有此需要的人时，足以完成下列疾病的治疗(如下文定义的)的本发明融合蛋白的量动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风。构成“治疗有效量”的本发明融合蛋白的量将依融合蛋白，待治疗的人的病状及其严重度以及年龄而变，但可以由本领域普通技术人员根据其自身知识和本公开内容常规地确定。
本文所使用的“治疗”或“疗法”涵盖哺乳动物优选人中的疾病状态的治疗，所述疾病状态的特征在于受损伤的血管内不受控制的血液凝固和血小板聚集，其中过量的纤维蛋白和血小板凝块在血管中形成并阻断血流，引起重要的组织或器官的局部缺血性损伤，并且该术语包括 (i)预防所述病状在人中发生，特别是当此类人易患该病状但仍未诊断为患有该病状时； (ii)抑制所述病状，即阻止其发展；或 (iii)减轻所述病状，即引起所述病状消退。
本文使用的所有其他技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常使用的相同的含义。
靶向性蛋白 本发明的靶向性蛋白是具有特异性地结合特定靶分子的能力的蛋白质或多肽(或其部分)，其被定义为对于相当新鲜的血管损伤来说特有或特异的(参见上文)。根据本发明的靶向性蛋白的例子是P-选择素。然后，靶向性蛋白用于将融合蛋白导向血管损伤部位，特别是靶结构，例如带有靶分子的细胞或组织。
在本发明的一个实施方案中，靶向性蛋白是可以结合P-选择素的抗体。本文所使用的“抗体”包括完整的免疫球蛋白(“Ig”)分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv，其能够结合P-选择素的表位。通常，需要至少6、9、10或12个连续氨基酸以形成表位。然而，涉及非连续氨基酸的表位可能需要更多，例如至少15、25或50个氨基酸。
通常，特异性地结合P-选择素的抗体当在免疫化学测定法中使用时所提供的检测信号比与其他蛋白质所提供的检测信号高至少5、10或20倍。优选地，特异性地结合P-选择素的抗体在免疫化学测定法中不检测其他蛋白质，并且可以从溶液中免疫沉淀P-选择素。
P-选择素可以用于免疫接种哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人以产生多克隆抗体。需要时，P-选择素可以缀合至载体蛋白，例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔血蓝蛋白。取决于宿主种类，可以使用各种佐剂以增加免疫应答。此类佐剂包括但不限于，弗氏佐剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。在用于人中的佐剂之中，BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Cornybacterium parvum)特别有用。
特异性地结合P-选择素的单克隆抗体可以使用任何技术来进行制备，所述技术为通过培养中的连续细胞系来生产抗体分子作好了准备。这些技术包括但不限于，杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1985)，第256卷，第495-497页)，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，D.等人，Immunology Today(1983)，第4卷，第72-79页)和EBV-杂交瘤技术(Cole，S.P.C.等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96页(eds.，Reisfeld，R.A和Sell，S.，Alan R.Liss，Inc.，New York，N.Y.，1985)。
此外，可以使用开发用于产生“嵌合型抗体”即剪接小鼠抗体基因与人抗体基因以获得具有合适的抗原特异性和生物活性的分子的技术(参见Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)，第81卷，第6851-6855页；Neuberger，M.S.等人，Nature(1984)，第312卷，第604-608页；和Takeda，S.等人，Nature(1985)，第314卷，第452-454页)。单克隆和其他抗体还可以是“人源化的”以预防当所述抗体在治疗上使用时患者发动针对所述抗体的免疫应答。此类抗体在序列上可能足够类似于在融合蛋白中直接使用的人抗体，或者可能需要改变少数关键残基。啮齿类动物和人抗体之间的氨基酸序列差异可以通过如此来最小化经过个别残基的定点诱变用其人对应物替代啮齿类动物序列，或者接枝整个互补性决定区。备选地，人源化抗体可以使用如GB2188638B中描述的重组方法来产生。如美国专利5,565,332中公开的，特异性地结合P-选择素的抗体可以包含部分或完全人源化的抗原结合部位。为了公开P-选择素特异性抗体的目的，这个专利完全引入作为参考。
备选地，可以使用本领域已知的方法来调整被描述用于产生单链抗体的技术以产生特异性地结合P-选择素的单链抗体。具有相关特异性但不同独特型组成的抗体可以通过从随机组合Ig文库进行链改组来产生(Kang，A.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)，第88卷，第11120-11123页)。
单链抗体还可使用DNA扩增方法例如使用杂交瘤cDNA作为模板的PCR来构建(Thirion，S.等人，Eur.J.Cancer Prev.(1996)，第5卷，第507-511页)。单链抗体还可以是单或双特异性的，并且可以是二价或四价的。四价、双特异性单链抗体的构建在例如Coloma，M.J.和Morrison，S.L.，Natl.Biotechnol.(1991)，第15卷，第159-163页中教导。双价、双特异性单链抗体的构建在Mallender，W.D.和Voss，E.W.Jr.，J.Biol.Chem.(1994)，第269卷，第199-206页中教导。
编码单链抗体的核苷酸序列可以通过使用手工或自动化核苷酸合成来构建，使用标准重组DNA方法克隆到表达构建体中，并导入细胞中以表达编码序列。备选地，单链抗体可以直接使用例如丝状噬菌体展示技术来产生(Verhaar，M.J.等人，Int.J.Cancer(1995)，第61卷，第497-501页；和Nicholls，P.J.等人，J.Immunol.Meth.(1993)，第165卷，第81-91页)。
特异性地结合P-选择素的抗体还可通过诱导在淋巴细胞群中体内产生或者通过筛选Ig文库或高度特异性的结合试剂的组(panels)来产生，如文献中公开的(Orlandi，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)，第86卷，第3833-3837页；和Winter，G.和Milstein，C.，Nature(1991)，第349卷，第293-299页)。
包含对于P-选择素的特异性结合部位的抗体片段可以通过重组DNA技术产生，例如Fab片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥来产生。备选地，可以构建Fab表达文库以允许快速且容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse，W.D.等人，Science(1989)，第246卷，第1275-1281页)。
本发明的靶向性蛋白(即抗体)可以通过本领域众所周知的方法来表达和纯化。例如，抗体可以通过经过在其上结合了P-选择素的柱来进行亲和力纯化。结合的抗体随后可以使用具有高盐浓度的缓冲液从柱上洗脱。
在本发明的一个优选实施方案中，靶向性蛋白是嵌合型小鼠-人抗P-选择素单克隆抗体HuSZ51，其来源于鼠类抗P-选择素单克隆抗体SZ51，SZ51是在江苏血液学研究所开发的。在血小板结合和蛋白质印迹中，SZ51特异性地识别在经凝血酶激活但非静止的血小板表面上存在的人P-选择素。每个经凝血酶激活的人血小板有～11,000个结合部位，并且抗体的亲和力是～4nM(Wu，G.等人，Nouv.Rev.Fr.Hematol.(1990)，第32卷，第231-235页)。SZ51在实验动物模型和人患者中的放射标记成像研究之中检测动脉和静脉血栓，这证实了其体内特异性(Wu，J.等人，Nucl.Med.Commun.(1993)，第14卷，第1088-1092页)。
HuSZ51通过如下方式来产生构建分别包含编码SZ515′的VL和VH区的cDNA至编码人Igκ轻链和IgGγ1重链恒定区的两个表达质粒(Gu，J.等人，Thromb.Haemost.(1997)，第77卷，第755-759页)。在血小板结合和免疫印迹实验中，HuSZ51特异性地识别在经凝血酶激活的血小板表面上的人P-选择素(Gu，J.等人(1997)，同上)。
“抗P-选择素”指结合P-选择素的单克隆抗体。所述抗体可以干扰或不干扰P-选择素的生物活性，所述生物活性包括但不限于，结合P-选择素-糖蛋白-配体-1(PSGL-1)的能力、结合糖蛋白Ib-IX-V复合物的能力、或介导白细胞粘附的能力。
本文使用的术语“特异性地结合”指抗体和靶多肽的相互作用，其中所述相互作用取决于多肽上的特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换言之，所述抗体识别并结合特殊多肽结构而不是一般的蛋白质。
纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物将无活性的纤溶酶原转化为活性的纤溶酶。尽管本发明的所有纤溶酶原激活物激活纤溶酶原，但纤溶酶原激活物的例子可以在其结构组成和特定的生物学(和因此药理学)特性方面不同。对于具有与天然t-PA基本上相同的结构特性(特别是结构域/氨基酸序列)的所有纤溶酶原激活物，使用术语“t-PA衍生的”纤溶酶原激活物。
在本发明的一个优选实施方案中，纤溶酶原激活物用作融合蛋白的一部分，其特征在于增加的纤维蛋白特异性。优选地，在纤维蛋白存在下这些纤溶酶原激活物激活纤溶酶的能力相比天然t-PA而言增强超过650倍。使得纤溶酶原激活物，特别是t-PA衍生的纤溶酶原激活物，具有更高的纤维蛋白特异性的氨基酸序列的修饰在EP 1 308 166A1中公开，所述文献的公开内容完全引入作为参考。
增强t-PA的纤维蛋白特异性的优选突变包括下列t-PA突变体t-PA/R275E；t-PA/R275E，F305H；t-PA/R275E，F305H，A292S。此外还可以使用这样的t-PA变体，其携带Asp194或同源位置中的天冬氨酸的点突变，导致在纤维蛋白不存在下纤溶酶原激活因子的催化活性构象的稳定性降低。因此，Asp194可以用谷氨酸或天冬酰胺置换。在另一例子中，纤溶酶原激活物在其自溶环中包括至少一个突变，其减少了在纤维蛋白不存在下纤溶酶原和纤溶酶原激活因子之间的功能性相互作用。自溶环的有关突变例如在野生型t-PA的第420-423位氨基酸或同源位置中，其可以如下置换L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。
在另外一个实施方案中，这些t-PA变体可以进行修饰以便防止被纤溶酶切割/催化。这些突变(例如谷氨酸置换)可以定位在天然t-PA的第15或275位氨基酸处或者定位在与那些同源的位置处。
此外，来源于t-PA的纤溶酶原激活物可以应用于本发明中，与天然t-PA相比所述纤溶酶原激活物在其kringle 2结构域中被修饰。这些修饰包括氨基酸置换或甚至kringle 2或其部分的完全删除。这些经修饰的t-PA变体的赖氨酸结合部位优选经修饰，以便减少所述纤溶酶原激活物的赖氨酸结合能力。优选的经修饰的t-PA变体在WO2005/026341中公开，其特此完全引入。优选的氨基酸置换是D236N。
本发明的纤溶酶原激活物可以在纤溶酶活化部位具有LHST氨基酸序列。此外，在其余的kringle(在kringle 2完全删除的情况下)和随后的半胱氨酸桥之间的连接序列优选是氨基酸序列SKAT。
特别优选的本发明纤溶酶原激活物的氨基酸序列在图10-15中给出(SEQ ID NO.3-SEQ ID No.8)。在本发明中还可以使用具有至少70％，优选80-90％，特别优选95％同一性的氨基酸序列的纤溶酶原激活物。
DSPA 如上文概述的，本发明的一种特别优选的纤溶酶原激活物是DSPA。全长DSPA包括指结构域、EGF结构域、kringle结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上)。在本发明的优选实施方案中，融合蛋白的DSPA部分包括至少丝氨酸蛋白酶结构域，优选与一个或多个其他DSPA结构域相组合。
编码来自吸血蝙蝠的DSPA蛋白质的全长DNA序列促进基因制备，并用作构建编码DSPA肽的DNA序列、包含DSPA的融合蛋白、和DSPA的片段或肽的起始点。
DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的全长基因已从吸血蝙蝠中分离并进行了测序(Kratzschmar，J.等人(1991)，同上；和美国专利号6,008,091和5,830,849，所有这些文献引入本文作为参考)。全长DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ cDNAs可以通过几种方法制备。对这些基因特异的寡核苷酸探针可以使用所公布的cDNA序列来合成。例如，从吸血蝙蝠的唾液腺制备的信使RNA为cDNA的制备提供了合适的起始材料。用于制备cDNA文库和用寡核苷酸探针来筛选cDNA文库的方法是众所周知的(参见，例如Sambrook，J.E.等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，N.Y.，1989)。备选地，DSPA的全长cDNA可以使用特异性引物和聚合酶链式反应(PCR)从cDNA文库进行制备。通过PCR分离cDNA序列的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。
融合蛋白 本发明的血栓溶解融合蛋白包括优选结合活化的血小板表面的靶向性蛋白，所述靶向性蛋白可操作地连接至纤溶酶原激活物，或其类似物、片段、衍生物或变体。在一个具体实施方案中，纤溶酶原激活物来源于吸血蝙蝠，并包括丝氨酸蛋白酶结构域和选自指结构域、EGF结构域和kringle结构域的至少一个其他结构域或其类似物、片段、衍生物或变体。
在一个特别优选的实施方案中，融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其片段，所述抗体或其片段可操作地连接至DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ或DSPAγ，或其类似物、片段、衍生物或变体。
本发明的融合蛋白包括但不限于这样的多肽，其中单链抗体的C-末端部分融合至纤溶酶原激活物(例如DSPA)或其类似物、片段、衍生物或变体的N-末端部分，IgG抗体的C-末端部分融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的N-末端部分，Fab抗体的C-末端部分融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的N-末端部分，单链抗体的N-末端部分融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的C-末端部分，IgG抗体的N-末端部分融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的C-末端部分，Fab抗体的N-末端部分融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的C-末端部分，超过一种单链抗体融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的N-末端和C-末端部分，超过一种IgG抗体融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的N-末端和C-末端部分，超过一种Fab抗体融合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体的N-末端和C-末端部分，超过一种纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体融合至单链抗体的N-末端和C-末端部分，超过一种纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体融合至IgG抗体的N-末端和C-末端部分，超过一种纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体融合至Fab抗体的N-末端和C-末端部分，一种或超过一种纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体融合至二聚单链抗体的N-末端和C-末端部分。
本发明的血栓溶解融合蛋白包括实施例1的融合蛋白(SEQ ID NO1和2)，以及在序列中与之相比具有非实质性变化的那些融合蛋白。“非实质性变化”将包括任何序列、置换或删除变体，其基本上保持了本发明多肽的至少一种生物学功能，优选纤维蛋白选择性纤溶酶原激活活性。这些功能等价物可以优选包括与SEQ ID NO1和2的融合蛋白具有至少约90％同一性，更优选与SEQ ID NO1和2的融合蛋白具有至少95％同一性，更加优选与SEQ ID NO1和2的融合蛋白具有至少97％同一性的融合蛋白，并且还包括具有基本上相同的生物活性的此类融合蛋白的部分。然而，在本发明的描述中包括了在来自SEQ ID NO1和2的融合蛋白的氨基酸序列中具有非实质性变化的任何融合蛋白，其显示出功能等价性，如本文进一步描述的。
类似物、片段、衍生物和变体 本发明的融合蛋白以及靶向性蛋白或纤溶酶原激活物的类似物、片段、衍生物或变体可以是下列的那些(i)其中一个或多个氨基酸残基用保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换，并且此类被置换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基；或(iii)其中成熟的融合蛋白与另一种化合物融合，例如增加融合蛋白的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)；或(iv)其中将另外的氨基酸融合至成熟的融合蛋白，例如前导或分泌序列或用于纯化成熟的融合蛋白的序列；或(v)其中多肽序列与较大的多肽即人白蛋白、抗体或Fc融合，以用于增加效应的持续时间。由于本文的教导，此类类似物、片段、衍生物或变体被认为在本领域技术人员的范围内。
优选地，本发明的衍生物将包含在一个或多个预测的，优选非必需的氨基酸残基处进行的保守氨基酸置换(下文进一步定义)。“非必需的”氨基酸残基是可以从蛋白质野生型序列中进行改变而不改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸残基是生物活性所需要的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。对于保守氨基酸残基或对于位于保守蛋白质结构域内的氨基酸残基将不进行非保守置换。片段或生物活性部分包括适合于用作药物，用作研究反应物等的多肽片段。片段包括包含十分类似或来源于本发明融合蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列并显示出那种多肽的至少一种活性的肽，但其包括比本文公开的全长多肽更少的氨基酸。通常，生物活性部分包括具有所述多肽的至少一种活性的结构域或基序。多肽的生物活性部分可以是长度例如为5个或更多个氨基酸的肽。此类生物活性部分可以合成地或通过重组技术来制备，并且可以通过本文公开的和/或本领域众所周知的方法就本发明多肽的一种或多种功能活性来进行评估。
此外，优选的本发明衍生物包括成熟的融合蛋白，其已与另一种化合物融合，例如增加多肽的半衰期和/或减少多肽的潜在免疫原性的化合物(例如聚乙二醇，“PEG”)。PEG可以用于赋予水溶性、大小、慢的肾清除率、和减少的对于融合蛋白的免疫原性。参见例如美国专利6,214,966。在PEG化的情况下，融合蛋白与PEG的融合可以通过本领域技术人员已知的任何方法来实现。例如，PEG化可以通过下列方式来实现首先将半胱氨酸突变引入融合蛋白内，随后进行使用PEG-马来酰亚胺的位点特异性衍生化。可以将半胱氨酸加入至肽的C-末端。参见，例如Tsutsumi，Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，第97卷，第8548-8553页。可以对融合蛋白进行的另一种修饰涉及生物素化。在某些情况下，使融合蛋白生物素化可能是有用的，从而使得它可容易地与链霉抗生物素蛋白反应。用于蛋白质的生物素化的方法是本领域众所周知的。另外，可以将硫酸软骨素与融合蛋白连接。
本发明的融合蛋白、靶向性蛋白和纤溶酶原激活物的变体包括具有与原始融合蛋白、靶向性蛋白和纤溶酶原激活物的氨基酸序列十分类似的氨基酸序列的多肽。术语“十分类似的”指相对于第二种氨基酸序列来说包含充分或最小数目的相同或等价氨基酸残基的第一种氨基酸序列，从而使得第一种和第二种氨基酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％，优选约75％-98％相同的共同结构性结构域的氨基酸序列在本文中定义为十分类似的。优选地，变体将与本发明的优选融合蛋白的氨基酸序列十分类似。变体包括由多核苷酸编码的融合蛋白的变体，所述多核苷酸在严紧条件下与本发明的多核苷酸或其互补物杂交。此类变体一般保留了本发明融合蛋白的功能活性。多核苷酸片段文库可以用于产生多样化的片段群用于筛选和后续选择。例如，片段文库可以通过下列方法产生在每个分子只出现大约一次切口的条件下用核酸酶处理多核苷酸的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成可以包括来自不同带切口的产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理从再形成的双链体中去除单链部分，并将所得到的片段文库连接到表达载体中。通过这种方法，可以得到表达文库，其编码本发明融合蛋白的各种大小的N-末端和内部片段。
变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的融合蛋白，以及靶向性蛋白和纤溶酶原激活物。具有纤溶酶原激活活性(其优选是纤维蛋白选择性的)的变体可以通过使用分别在实施例5和6中描述的催化和纤维蛋白溶解测定法筛选本发明融合蛋白或纤溶酶原激活物的突变体例如截短或点突变体的组合文库来鉴定。具有P-选择素结合活性的变体可以通过使用在实施例2、3和4中描述的P-选择素结合测定法筛选本发明融合蛋白或靶向性蛋白的突变体例如截短或点突变体的组合文库来鉴定。
变体的多样化文库可以通过核酸水平上的组合诱变来产生，并由多样化基因文库编码。变体的多样化文库例如可以通过下列方式来产生将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，从而使得潜在变体氨基酸序列的简并组可表达为单独的多肽，或备选地表达为在其中包含序列组的更大融合蛋白的组(例如对于噬菌体展示)。存在可以用于由简并的寡核苷酸序列生产潜在变体文库的各种方法。简并的基因序列的化学合成可以在DNA自动合成仪中进行，并且然后将合成的基因连接到合适的表达载体中。基因的简并组的使用允许在一种混合物中供应编码所需的潜在变体序列组的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如Narang，S.A.，Tetrahedron(1983)，第39卷，第3页；Itakura，K.等人，Annu.Rev.Biochem.(1984a)，第53卷，第323-356页；Itakura，K.等人，Science(1984b)，第98卷，第1056-1063页，和Ike，Y.等人，Nucleic Acid Res.(1983)，第11卷，第477-488页)。
用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，以及用于在cDNA文库中筛选具有所选择的特性的基因产物的几种技术是本领域已知的。此类技术可进行调整以适合于在通过融合蛋白以及靶向性蛋白和纤溶酶原激活物的组合诱变而产生的基因文库中快速筛选纤维蛋白选择性纤溶酶原激活活性或P-选择素结合活性。顺应于用于筛选大基因文库的高流通量分析的最广泛使用的技术通常包括，将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得到的载体文库转化合适的细胞，并在所需活性的检测有助于分离载体(所述载体编码其产物被检测的基因)的条件下表达所述组合基因。循环整体诱变(recursiveensemble mutagenesis，REM)是一种增加文库中功能性突变体的频率的技术，其可以与筛选测定法组合使用以鉴定所需变体。
融合蛋白的产生 本发明的融合蛋白通过下列方式来产生根据本领域技术人员已知的任何方法将靶向性蛋白融合至，或者将其结合至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。这两种组分可以通过各种众所周知的化学操作中的任何一种而化学键合在一起。例如，这种连接可以经由异双功能交联剂，例如SPDP、碳化二亚胺、戊二醛等。
在一个更优选的实施方案中，本发明的靶向性蛋白可以通过重组方法例如经由使用重组DNA技术融合至DSPA结构域以产生编码所述靶向性蛋白和所述编码纤溶酶原激活物的多肽两者的核酸，并在宿主细胞例如大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达DNA序列。编码融合蛋白的DNA可以以cDNA形式通过本领域技术人员已知的任何克隆程序进行克隆。参见，例如Sambrook，J.E.等人(1989)，同上。
在靶向性蛋白是单链抗体的情况下，一旦已鉴定出编码在表达时显示特异性结合活性的Fv区的DNA序列，包括那个Fv区的融合蛋白就可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备。因此，例如，Chaudhary，V.K.等人，Nature(1989)，第339卷，第394-397页；Batra，J.K.等人，J.Biol.Chem.(1990)，第265卷，第15198-15202页；Batra，J.K.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA(1989)，第86卷，第8545-8549页；和Chaudhary，V.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)，第87卷，第1066-1070页(全部引入作为参考)，描述了各种单链抗体融合蛋白的制备。Fv区可以直接融合至纤溶酶原激活物或者可以经由连接体序列进行连接。连接体序列的存在可以只提供靶向性部分和纤溶酶原激活物之间的间隔，或者促进这些区域之间的可移动性以使得它们各自能够达到其最佳构象。包括连接子的DNA序列还可提供序列(例如引物或限制性位点)以有助于克隆，或者可以在编码靶向性部分的序列和编码纤溶酶原激活物的序列之间保留阅读框。此类连接子肽的设计是本领域技术人员众所周知的。
在本发明中，连接体序列可以用于将抗P-选择素抗体或其类似物、片段、衍生物或变体连接至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。连接体序列还可用于连接单链抗体的重链和轻链结构域。很明显，可以使用0-15个氨基酸的连接体序列。对于本领域技术人员显而易见的是，以使用许多不同的连接体序列而仍产生保留了纤维蛋白溶解活性、纤维蛋白选择性、P-选择素结合活性和活化的血小板结合活性的融合蛋白。连接体序列的修饰可以旨在使纤维蛋白溶解活性、纤维蛋白选择性、P-选择素结合活性和/或活化的血小板结合活性的增强最大化。
在本发明的一个优选实施方案中，抗P-选择素DSPAα1融合蛋白通过构建表达载体来产生，在所述表达载体中将编码成熟的DSPAα1的cDNA插入SZ51-VH-人IgG1 CH3区的3′(Gu，J.等人，(1997)，同上)。所得到的表达质粒与编码SZ51-VL-人Igκ嵌合蛋白的表达质粒一起共转染以产生HuSZ51-DSPAα1。所得到的融合蛋白以及轻链和重链表达质粒的示意图描绘在图1中。HuSZ51-DSPAα1分子包含2条Ig轻链和2条Ig重链。轻链由SZ51的VL区和人IgGκ的恒定区组成。重链由SZ51的VH区、人IgG1的恒定区1-3和全长DSPAα1组成。HuSZ51-DSPAα1的2个多肽链的氨基酸序列描绘在图2中(SEQ ID NO1和2)。
使用全长人uPA cDNA来制备相似的构建体，以产生融合蛋白HuSZ51-uPA(Wan，H.等人，Thromb.Res.(2000)，第97卷，第133-141页)。在这种情况下，亲和力纯化的HuSZ51-uPA抑制亲本鼠类单克隆抗体SZ51与经凝血酶激活的人血小板的结合，这证实抗P-选择素-纤溶酶原激活物融合蛋白可以保留体外血小板结合活性(Wan，H.等人(2000)，同上)。
HuSZ51-DSPAα1通过首先将编码SZ51的VL和VH区的cDNA分别插入包含人Igκ轻链恒定区和IgG1重链恒定区的表达载体中来产生。轻链构建体pLNOSZ51VK/Hygro是由病毒CMV启动子驱动的表达质粒，其包括选择标记潮霉素。为了构建这种质粒，通过标准PCR技术产生在侧翼具有BsmI和BsiWI限制性内切酶识别位点的、编码SZ51的VL区的DNA片段，用BsmI和BsiWI消化，并插入质粒pLNO/Kappa/潮霉素的BsmI和BsiWI位点之间(Norderhaug，L.等人，J.Immunol.Meth.(1997)，第204卷，第77-87页)。所得到的由SZ51-VL区和人Igκ恒定区组成的轻链构建体描绘在图1B中。重链构建体pLNOSZ51VH/Neo是病毒CMV启动子驱动的表达载体，其包括选择标记新霉素。为了构建这种质粒，通过标准PCR技术产生在侧翼具有BsmI和BsiWI限制性内切酶识别位点的、包含SZ51的VH区的DNA片段，用BsmI和BsiWI消化，并插入质粒pLNOH/IgG1/Neo的BsmI和BsiWI位点之间(Norderhaug，L.等人(1997)，同上)。接下来，通过重叠PCR产生包含IgG1 CH3结构域的DNA片段，所述IgG1 CH3结构域直接融合至成熟的分泌形式的DSPAα1(在侧翼具有BamHI限制性内切酶酶切位点)。所得到的PCR片段用NsiI和BamHI消化，随后插入至质粒pLNOSZ51VH/Neo的NsiI和BamHI位点之间。所得到的嵌合型重链-DSPA融合构建体pLNOSZ51VHDSPA/Neo由SZ51-VH区、人IgG1恒定区和成熟的分泌形式的DSPAα1组成，其描绘在图1B中。
使用这些方法产生了其他抗P-选择素-DSPAα1融合蛋白表达质粒，包括HuSZ51Fab′-DSPAα1，其缺乏HuSZ51-DSPAα1中的CH2和CH3结构域；和scFvSZ51-DSPAα1，其为(从N-至C-末端)包含SZ51-VL区、随后为SZ51-VH区和成熟的分泌形式的DSPAα1的单链抗体。类似方法用于产生本发明的其他融合蛋白表达质粒。
融合蛋白的表达和纯化 存在几种体外表达重组融合蛋白的方法，包括大肠杆菌、杆状病毒、酵母、哺乳动物细胞或其他表达系统。用于在细菌中表达克隆的基因的方法是众所周知的。为了在原核系统中获得克隆的基因的高水平表达，必需构建表达载体，其最少包含强启动子以指导mRNA转录终止。适合于这个目的的调节区的例子是大肠杆菌β-葡糖苷酶基因、大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵子区，或来自噬菌体λ的左侧(leftward)启动子。在转化入大肠杆菌中的DNA质粒中包含选择标记是有用的。此类标记的例子包括给予对于氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
从可用于表达本发明的融合蛋白的高等真核细胞系统中可以选择出众多细胞系统。哺乳动物细胞系的说明性例子包括但不限于RPMI7932、VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞系、WI38、BHK、COS-7、C127或MDCK细胞系。适合在本发明中使用的细胞从ATCC商购可得。举例说明性的非哺乳动物真核细胞系包括但不限于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)。
翻译后修饰例如糖基化在原核细胞表达系统大肠杆菌中不发生。此外，具有复杂的二硫化物模式的蛋白质在大肠杆菌中表达时常常是错折叠的。使用原核系统，表达的蛋白质以不溶形式即所谓的内含体(可在裂解细胞后在可溶部分中发现)存在于细胞质中，或者通过添加合适的分泌信号序列而导向周质中。如果所表达的蛋白质是不溶性内含体，那么通常需要进行内含体的溶解和后续的重折叠。
许多原核表达载体是本领域技术人员已知的并且是商购可得的，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pKK233-2(Clontech，Palo Alto，CA，USA)和pGEM1(PromegaBiotech，Madison，WI，USA)。
在重组微生物表达系统中常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang，A.C.等人，Nature(1978)，第275卷，第617-624页；和Goeddel，D.V.等人，Nature(1979)，第281卷，第544-548页)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，D.V.等人，Nucl.Acids Res.(1980)，第8卷，第4057-4074页)和tac启动子(Sambrook，J.E.等人，(1989)，同上)。另一种有用的细菌表达系统采用λ噬菌体pL启动子和cIts857温度诱导型阻抑物(Bernard，H.U.等人，Gene(1979)，第5卷，第59-76页；和Love，C.A.等人，Gene(1996)，第176卷，第49-53页)。重组融合蛋白还可在酵母宿主例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达。它通常提供进行各种翻译后修饰的能力。表达出的融合蛋白可以分泌到培养物上清液中，在那里没有许多其他蛋白质，有利于纯化。用于在本发明中表达融合蛋白的酵母载体包含某些必要特征。载体的元件一般来源于酵母和细菌以允许质粒在两者中增殖。细菌元件包括复制起点和选择标记。酵母元件包括复制起点序列、选择标记、启动子和转录终止子。
在酵母载体中用于表达的合适启动子包括TRP1基因、ADH1或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH03或PH05)基因、异细胞色素(isocytochrome)基因的启动子，或参与糖酵解途径的启动子，例如烯醇化酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙糖磷酸异构酶和磷酸葡萄糖异构酶启动子(Hitzeman，R.A.等人，J.Biol.Chem.(1980)，第255卷，第12073-12080页；Hess，B.等人，J.Adv.Enzyme Reg.(1968)，第7卷，第149-167页；和Holland，M.J.和Holland，J.P.，Biochemistry(1978)，第17卷，第4900-4907页)。
商购可得的酵母载体包括pYES2、pPIC9(Invitrogen，San Diego，CA)、Yepc-pADH2a、pYcDE-1(Washington Research，Seattle，WA)、pBC102-K22(ATCC#67255)和YpGX265GAL4(ATCC#67233)。包括但不限于COS-7、L细胞、C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、CHL-1、NSO和HEK293的哺乳动物细胞系可以用于在本发明中表达重组融合蛋白。在哺乳动物细胞中生产的重组蛋白质通常是可溶的和糖基化的，并且具有真正的N-末端。哺乳动物表达载体可以包含不转录的元件，例如复制起点、启动子和增强子，以及5′或3′非翻译序列例如核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、接纳体位点和剪接供体、和转录终止序列。在哺乳动物表达载体中使用的启动子通常是，例如病毒启动子例如多瘤病毒、腺病毒、HTLV、猿猴病毒40(“SV 40”)和人巨细胞病毒(“CMV”)。
取决于所选择的表达系统和宿主，均质的重组融合蛋白可以通过使用用于蛋白质纯化的常规色谱法的各种组合来获得。这些包括免疫亲和色谱法、反相色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法和HPLC。如果表达系统将融合蛋白分泌到生长培养基中，那么蛋白质可以直接从培养基中纯化。如果融合蛋白不分泌，那么将它从细胞裂解物中分离。细胞破碎可以通过任何常规方法来进行，包括冷冻-融化循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。
使用标准的哺乳动物基因表达和纯化技术来表达和纯化本发明的抗P-选择素-DSPA融合蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，将哺乳动物表达构建体转染到CHO细胞中。当使用CHO细胞时，可以包括新霉素或潮霉素作为真核选择标记。
使用脂质体介导(Lipofectin 2000)的方法将嵌合型轻链构建体pLNOSZ51VK/Hygro和嵌合型重链-DSPA融合构建体pLNOSZ51VHDSPA/Neo共转染到CHO细胞中。转染的CHO细胞使用500μg/ml新霉素和600μg/ml潮霉素在HAMS/F-12培养基中进行选择。挑选出112个抗生素抗性CHO克隆，并使用ELISA就HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的表达进行筛选。这112个克隆中有6个在3mg/L-6mg/L的水平上表达蛋白质，并且表达水平维持超过10次细胞传代。3个克隆即#62、#70和#87用于按比例扩大的细胞培养(细胞工厂)以产生用于蛋白质纯化的条件培养基。
来自分泌HuSZ51-DSPAα1的CHO克隆的条件培养基首先通过0.22μm过滤器进行过滤，随后使用10kDa分子量截止膜(在Ultrafiltration Prep System上的2个Millipore PelliconMembranes)浓缩10-20倍。然后将浓缩的材料上载到用50mM柠檬酸钠(6.5)、300mM NaCl平衡的A蛋白柱上。当完全上载时，柱用10个柱体积的相同缓冲液洗涤，并且用50mM柠檬酸钠(pH2.7)、300mM NaCl洗脱蛋白质。洗脱液用1M Tris-HCl(pH8.0)中和，并且将洗脱液的pH维持在pH5.0-7.0。为了消除少量的污染性牛IgG，将A蛋白柱洗脱液上载到用20mM乙酸钠(pH5.0)，100mM NaCl平衡的阳离子交换SP-Fractogel柱上，随后采用至0.9M NaCl的线性梯度以3mL/分钟的流速洗脱20分钟。收集包含HuSZ51-DSPAα1融合蛋白的第二个洗脱峰。对SP-Fractogel柱洗脱液实施通过Sephacryl-300HR凝胶过滤柱的进一步蛋白质纯化以消除任何蛋白质聚集体。
使用这些方法，表达并纯化了其他抗P-选择素-DSPAα1融合蛋白，包括HuSZ51Fab′-DSPAα1，其缺乏HuSZ51-DSPAα1中的CH2和CH3结构域；和scFvSZ51-DSPAα1，其为(从N-至C-末端)包含SZ51-VL区、随后为SZ51-VH区和成熟的分泌形式的DSPAα1的单链抗体。类似方法用于表达和纯化本发明的其他融合蛋白。
药物组合物 本发明还提供了药物组合物，其可以施用给患者以达到治疗效果。可以通过将具有所需纯度和药学有效量的融合蛋白与生理学上可接受的载体相组合来制备本发明的药物组合物以用于施用。
本发明的融合蛋白可以在用于静脉内、皮下、肌内或鞘内施用的药物组合物中使用。因此，上述多肽优选将与可接受的无菌药学载体组合，例如5％的葡萄糖、乳酸林格氏液、生理盐水、无菌水或设计用于静脉内输注的任何其他商业制备的生理学缓冲溶液。应当理解，载体溶液的选择，以及组合物的剂量和施用，将依受试者和特定临床情况而变，并且将通过标准医学程序来控制。
依照本发明的方法，这些药物组合物可以以对于抑制与受试者血管中过量的纤维蛋白和血小板凝块相关联的病理学结果来说有效的量进行施用。
融合蛋白的施用可以通过静脉内快速浓注、通过持续的静脉内输注、或通过两种途径的组合来进行。备选地，或者另外地，与合适的赋形剂相混合的融合蛋白可以经由肌内位点而带入循环中。
本发明的重组融合蛋白和药物组合物可用于肠胃外、局部、静脉内、口服或局域施用。取决于施用方法，药物组合物可以以各种单位剂型进行施用。例如，单位剂型可以以包括但不限于片剂、胶囊、粉剂、溶液和乳状液的形式进行施用。
本发明的重组融合蛋白和药物组合物特别可用于静脉内施用。用于施用的组合物将通常包括溶解在药学上可接受的载体中，优选溶解在水性载体中的融合蛋白溶液。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且一般不含不希望的物质。组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。
用于静脉内施用的典型药物组合物可以由本领域普通技术人员容易地决定。施用的量很明显是蛋白质特异的，并且取决于其效力和药物代谢动力学特性。用于制备肠胃外可施用的组合物的现行方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且在诸如Remington’sPharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)的出版物中更详细地描述。
包含本融合蛋白或其混合物(即与其他蛋白质一起)的组合物可以在治疗性处理中进行施用。在治疗应用中，组合物可以以足以治愈或至少部分地阻止所述病症的量施用给患有动脉血栓形成的患者。足够实现这点的量被定义为“治疗有效剂量”。对于这个用途来说有效的量将取决于疾病的严重度和患者健康的一般状态。
组合物的单一或多重施用可以取决于患者所需要和耐受的剂量和频率进行施用。无论如何，组合物应当提供足够量的本发明蛋白质以有效地治疗患者。一般地，取决于所期望的施用模式，药学上可接受的组合物将包含约1％-约99重量％的本发明融合蛋白，和99％-1重量％的合适的药学赋形剂或载体。优选地，组合物将具有约5％-75重量％的本发明融合蛋白，其余的是合适的药学赋形剂或载体。
本发明的融合蛋白，或其药学上可接受的组合物以治疗有效量进行施用，所述治疗有效量将依各种因素而变，包括所采用的特定融合蛋白的活性；所述融合蛋白的代谢稳定性和作用时间长短；患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食；施用方式和时间；排泄速度；药物组合；特定疾病状态的严重度；和宿主正在经历的疗法。一般地，治疗有效日剂量是约0.14mg-约14.3mg本发明融合蛋白/kg体重/天，优选地，约0.7mg-约10mg/kg体重/天，并且最优选地，约1.4mg-约7.2mg/kg体重/天。例如，对于给70kg的人施用，剂量范围将是约10mg-约1.0g本发明融合蛋白/天，优选约50mg-约700mg/天，并且最优选约100mg-约500mg/天。
细胞和基因疗法 本发明的融合蛋白可以依照本发明，通过根据称为“细胞疗法”的方法体内表达此类融合蛋白来使用。因此，例如，细胞可以用编码所述融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)进行离体改造，然后将经改造的细胞提供给待用该融合蛋白进行治疗的患者。此类方法是本领域众所周知的。例如，细胞可以通过本领域已知的程序通过使用包含编码本发明融合蛋白的RNA的逆转录病毒颗粒进行改造。
本发明的融合蛋白还可依照本发明，通过根据称为“基因疗法”的方法体内表达此类融合蛋白来使用。因此，例如，病毒可以用编码所述融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)进行改造，然后将经改造的病毒提供给待用该融合蛋白进行治疗的患者。此类方法是本领域众所周知的。例如，重组腺病毒可以通过本领域已知的程序进行改造以包含编码本发明融合蛋白的DNA。
使用细胞或基因疗法来局部递送本发明的融合蛋白可以向靶区域即内衬在血管中的内皮细胞提供治疗剂。
体外和体内的细胞和基因疗法方法均是被考虑的。用于将潜在治疗基因转移至指定细胞群的几种方法是已知的。参见，例如Mulligan，R.C.，Science(1993)，第260卷，第926-932页。这些方法包括直接基因转移(参见，例如Wolff，J.A.等人，Science(1990)，第247卷，第1465-1468页)；脂质体介导的DNA转移(参见，例如Caplen，N.J.等人，Nature Med.(1995)，第3卷，第39-46页；Crystal，R.G.，Nature Med.(1995)，第1卷，第15-17页；Gao，X.和Huang，L.，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1991)，第79卷，第280-285页)；逆转录病毒介导的DNA转移(参见，例如Kay，M.A.等人，Science(1993)，第262卷，第117-119页；Anderson，W.F.，Science(1992)，第256卷，第808-813页)；和DNA病毒介导的DNA转移。此类DNA病毒包括腺病毒(优选基于Ad2或Ad5的载体)、疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)和细小病毒(优选基于“有缺陷的”或非自主性细小病毒的载体，更优选基于腺伴随病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。参见，例如Ali，M.等人，Gene Therapy(1994)，第1卷，第367-384页；美国专利4,797,368，引入本文作为参考；和美国专利5,139,941，引入本文作为参考。
用于转移目的基因的特定载体系统的选择将取决于各种因素。一个重要因素是靶细胞群的性质。尽管逆转录病毒载体已被广泛研究并用于众多基因疗法应用中，但这些载体一般不适合于感染非分裂性细胞。此外，逆转录病毒具有致癌可能。然而，慢病毒载体领域中的近期进展可以避开这些局限性中的一些。参见Naldini，L.等人，Science(1996)，第272卷，第263-267页。
上文提及的逆转录病毒质粒载体所来源于的逆转录病毒可以包括，但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。
腺病毒具有下列优点具有广的宿主范围，可以感染静止的或终末分化的细胞例如神经元或肝细胞，并且似乎基本上不致癌。参见，例如Ali，M.等人(1994)，同上。腺病毒似乎不整合到宿主基因组中。因为它们存在于染色体外，所以插入性诱变的危险将极大地减少。Ali，M.等人(1994)，同上。
腺伴随病毒呈现出与基于腺病毒的载体类似的优点。然而，AAVs显示出在人染色体19上的位点特异性整合(Ali，M.等人(1994)，同上)。
在一个优选实施方案中，编码本发明融合蛋白的DNA在细胞或基因疗法中用于心血管疾病，包括但不限于，动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓，深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风。
根据这个实施方案，使用编码本发明融合蛋白的DNA的细胞或基因疗法与诊断同时或紧在其后提供给有此需要的患者。
技术人员将会意识到，包含编码本发明融合蛋白的DNA或编码本发明融合蛋白的类似物、片段、衍生物或变体的DNA的任何合适的基因疗法载体可以依照这个实施方案进行使用。用于构建此类载体的技术是已知的。参见，例如Anderson，W.F.，Nature(1998)，第392卷，第25-30页；和Verma，I.M.和Somia，N.，Nature(1998)，第389卷，第239-242页。包含融合蛋白DNA的载体向靶位点的引入可以使用已知技术来完成。
细胞或基因疗法载体包括一个或多个启动子。可以采用的合适的启动子包括但不限于，逆转录病毒LTR；SV40启动子；和在Miller，A.D和Rosman，G.J.，Biotechniques(1989)，第7卷，第980-990页中描述的人CMV启动子，或者任何其他启动子(例如，细胞启动子例如真核细胞启动子，包括但不限于，组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。可以采用的其他病毒启动子包括但不限于，腺病毒启动子、胸苷激酶(“TK”)启动子和B19细小病毒启动子。由于本文包含的教导，合适启动子的选择对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
编码本发明融合蛋白的核酸序列置于合适启动子的控制下。可以采用的合适启动子包括但不限于，腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，例如CMV启动子；呼吸道合胞病毒启动子；诱导型启动子，例如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAl启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，例如单纯疱疹病毒TK启动子；逆转录病毒LTRs(包括上文描述的经修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。
逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于，PE501，PA317，psi-2，psi-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，psiCRE，psiCRIP，GP+#-86，GP+envAm12和DAN细胞系，其在整体引入本文作为参考的Miller，A.D.，Hum.Gene Ther.(1990)，第1卷，第5-14页中描述。载体可以通过本领域已知的任何方法转导包装细胞。此类方法包括但不限于，电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。在一种备选方法中，逆转录病毒质粒载体可以包囊到脂质体中或偶联至脂质，并随后施用给宿主。生产细胞株产生具有感染性的逆转录病毒载体颗粒，其包括编码所述多肽的核酸序列。此类逆转录病毒载体颗粒随后可以用于体外或体内转导真核细胞。经转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于，胚胎干细胞、胚胎癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
与基因疗法不同的一种方法是“转核疗法(transkaryotictherapy)”，其中对患者细胞进行离体处理以诱导休眠的染色体基因在被重新引入患者后产生目的蛋白质。转核疗法假定个体具有对于激活来说所需的基因的正常补足物(complement)。转核疗法涉及将启动子或能够激活新生基因的其他外源调节序列离体导入患者细胞的染色体DNA中，培养并选择产生活性蛋白质的细胞，然后将活化的细胞重新导入患者中，目的是它们随后变得完全建立。然后，“基因活化的”细胞制造目的蛋白质，经过一定的显著量的时间，可能长达患者一生。美国专利号5,641,670和5,733,761详细公开了这个构思，并被特此整体引入作为参考。
试剂盒 本发明进一步涉及用于研究或诊断目的的试剂盒。试剂盒通常包括包含本发明融合蛋白的一个或多个容器。在一个优选实施方案中，试剂盒包括包含以适合于用第二种分子进行衍生化的形式存在的融合蛋白的容器。在一个更优选的实施方案中，试剂盒包括包含SEQ ID NO.1和2的融合蛋白的容器。进一步提供了包括游离形式或药学上可接受的形式的本发明组合物的试剂盒。试剂盒可以包括关于其施用的说明书。本发明的试剂盒可以在本发明的任何方法中使用。
在另一个实施方案中，试剂盒可以包含编码本发明融合蛋白的DNA序列。优选地，编码这些融合蛋白的DNA序列在适合于转染入宿主细胞中并由所述宿主细胞进行表达的质粒中提供。所述质粒可以包含启动子(通常是诱导型启动子)以调节所述DNA在宿主细胞中的表达。所述质粒还可包含合适的限制性位点以有助于将其他DNA序列导入质粒中，以产生各种融合蛋白。所述质粒还可包含众多的其他元件以有助于所编码的蛋白质的克隆和表达。此类元件是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等。
治疗适应症 其中血栓形成起着重要的病因学作用的疾病、病症或病状包括动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓，深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风。本发明的融合蛋白可用于在其中血栓形成是病理状态的所有这些疾病、病症或病状。“可用于”是指融合蛋白对于进行治疗以预防疾病或防止其进展至更严重状态来说有用。
进一步优选的实施方案 如上文在本发明概述中所述的本发明融合蛋白之中，几组融合蛋白是特别优选的。
在一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至以其任何组合的DSPAα1指、EGF和丝氨酸蛋白酶结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至以其任何组合的DSPAα1指、kringle和丝氨酸蛋白酶结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至以其任何组合的DSPAα1指和丝氨酸蛋白酶结构域，或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的单克隆抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述单克隆抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在一个更优选的实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的嵌合型单克隆抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述嵌合型单克隆抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的Fab二聚体抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述Fab二聚体抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的单链抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述单链抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在一个更优选的实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体，所述HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体，所述HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体经由重链而可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于治疗动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风的方法，所述方法包括给有此需要的人施用治疗有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体，所述HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体经由重链而可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于预防动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部静脉血栓形成，肺栓塞和急性缺血性中风的方法，所述方法包括给有此需要的人施用治疗有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体，所述HuSZ51或其类似物、片段、衍生物或变体经由重链而可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。在一个优选实施方案中，融合蛋白在中风发作后超过3小时施用给患有急性缺血性中风的患者。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合活化的血小板的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至选自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至选自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAα2或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAβ或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至DSPAγ或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的选自单克隆抗体、嵌合型单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人单克隆抗体、Fab二聚体抗体、Fab单体抗体、IgG抗体、IgG抗体类似物和单链抗体的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至选自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。
在另一个实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至选自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体，其中所述融合蛋白通过添加其他分子进行修饰，所述其他分子包括但不限于聚乙二醇、生物素和硫酸软骨素。
在另一个实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括结合P-选择素的抗体或其类似物、片段、衍生物或变体，所述抗体或其类似物、片段、衍生物或变体可操作地连接至选自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体，其中所述抗体不与P-选择素-糖蛋白-配体-1(PSGL-1)竞争结合P-选择素，不与糖蛋白Ib-IX-V复合物竞争结合P-选择素，或不抑制白细胞与活化的血小板的粘附。
本发明的融合蛋白的制备 使用标准的重组DNA、哺乳动物基因表达和蛋白质纯化技术产生了根据本发明的优选实施方案的融合蛋白。图1A描述了一种此类融合蛋白的例子，HuSZ51-DSPAα1，其包括由融合至人Igκ恒定区的抗P-选择素抗体VL区组成的两条轻链，和由融合至人IgGγ1恒定区和成熟的分泌形式的吸血蝙蝠纤溶酶原激活物DSPAα1的抗P-选择素抗体VH区组成的两条重链。抗P-选择素-DSPAα1融合蛋白表达质粒的构建，以及抗P-选择素-DSPAα1融合蛋白的表达和产生在上文描述。
特异性地结合P-选择素的小鼠单克隆抗体SZ51从江苏血液学研究所获得。SZ51的IgGγ1重链和Igκ轻链基因的可变区DNA序列存放于GenBank中(登录号分别为gi4099282和gi4099284)。如上文详细描述和图1B中描绘的，将编码SZ51的VH区的cDNA以位于编码人Igκ恒定区的cDNA的5′端的方式克隆到表达质粒中，并且将编码SZ51的VH区的cDNA以位于编码人IgGγ1恒定区的基因组DNA的5′端的方式克隆到表达质粒中。将编码成熟的分泌形式的DSPAα1的cDNA插入IgGγ1的CH3结构域的3′端。
对这些表达质粒实施DNA测序以确认所述融合蛋白的上述构建体和氨基酸序列。嵌合型SZ51-VL-人Igκ轻链(SEQ ID NO1)和嵌合型SZ51-VH-人IgGγ1-DSPAα1重链(SEQ ID NO2)的氨基酸序列分别显示于图2A和图2B中。
如上所述，将轻链和重链表达质粒共转染到CHO细胞中，并鉴定出表达抗P-选择素-DSPA融合蛋白的稳定转化体，并随后从所选择的阳性CHO克隆的条件培养基中纯化出HuSZ51-DSPAα1。如实施例1中所述，HuSZ51-DSPAα1通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法进行分析，其结果显示于图3中。如预期的，纯化的HuSZ51-DSPAα1融合蛋白具有～250kDa的表观Mr.，并且由～108kDa和～23kDa的两个亚基组成，所述两个亚基分别对应于HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1和HuSZ51-VLCκ。如通过分别在图3A和3B中所示的考马斯蓝染色和蛋白质印迹法所判断的，在纯化的HuSZ51-DSPAα1材料中没有明显的降解产物或杂质。
使用本文中对于HuSZ51-DSPAα1所例示的上述方法，对本发明融合蛋白进行克隆、表达、纯化并分析其纯度和完整性。使用这些方法，本领域普通技术人员将能够将不同抗体片段与纤溶酶原激活物片段相组合以产生本发明的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的测试 使用如本文在上文中描述的标准的重组DNA、哺乳动物基因表达和蛋白质纯化技术来产生通过HuSZ51-DSPAα1所例示的本发明的融合蛋白，并随后如实施例1中所描述的分析其纯度和完整性，其结果显示于图3中。本发明的融合蛋白在各种体外测定法中进行测试以证实其功用，即本发明的融合蛋白保留了结合活化的血小板、降解纤维蛋白、和诱导血栓溶解的能力。这些测定法在下文的实施例2-7中详细描述，其结果显示于图4-9中。
纯化的HuSZ51-DSPAα1在体外结合P-选择素的能力以3种方式来证实(1)通过硝化纤维素滤纸结合测定法，其测量HuSZ51-DSPAα1结合固定在滤膜上的重组P-选择素的能力；(2)通过ELISA，其测量HuSZ51-DSPAα1结合固定在塑料上的P-选择素的能力；和(3)通过竞争性ELISA，其测量HuSZ51-DSPAα1与亲本单克隆抗体SZ51竞争结合固定在塑料上的重组P-选择素的能力。这些测定法在实施例2和3中描述。图4A显示，HuSZ51-DSPAα1和HuSZ51在其结合固定在硝化纤维素上的P-选择素的能力方面是相当的，和图4B显示，HuSZ51-DSPAα1以剂量依赖性方式结合固定在塑料上的P-选择素。图5显示，HuSZ51-DSPAα1以剂量依赖性方式与SZ51竞争结合P-选择素。这些结果证实，DSPAα1连接至HuSZ51重链的C-末端不会不利地影响抗P-选择素抗体在体外结合P-选择素的能力。
纯化的HuSZ51-DSPAα1在体外结合活化的血小板的能力通过ELISA来证实，所述ELISA测量HuSZ51-DSPAα1结合包被在塑料上的经凝血酶激活的血小板的能力。这个测定法在下文描述于实施例4中。图6A显示，HuSZ51-DSPAα1和SZ51以无差别的方式结合人的经凝血酶激活的血小板，和图6B显示，HuSZ51-DSPAα1以剂量依赖性方式结合犬的经凝血酶激活的血小板。这些结果证实，DSPAα1连接至HuSZ51重链的C-末端不会不利地影响抗P-选择素抗体在体外结合活化的血小板的能力。
纯化的HuSZ51-DSPAα1的体外催化活性以2种方式来证实(1)生色测定法，其测量HuSZ51-DSPAα1催化丝氨酸蛋白酶底物水解的能力；和(2)凝块溶解测定法，其测量HuSZ51-DSPAα1降解纤维蛋白的能力。这些测定法在实施例5、6和7中描述。图7显示，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1展示出相当的对于两种丝氨酸蛋白酶底物的催化活性。图8(上图)显示，在体积摩尔浓度的基础上，在纤维蛋白凝块溶解测定法中，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1在其降解纤维蛋白能力方面是无差别的，和图8(下图)显示，在血浆凝块溶解测定法中，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1在其降解纤维蛋白能力方面是相当的。图9显示，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1在使用缺少血小板(上图)或富含血小板(下图)的血浆的血浆凝块溶解测定法中优于uPA。这些结果证实，DSPAα1连接至HuSZ51重链的C-末端不会不利地影响DSPAα1催化靶底物水解的能力，以及HuSZ51-DSPAα1在体外作为血栓溶解剂优于uPA。
本发明的融合蛋白在体内测定法中进行测试以证实其功用，即本发明的融合蛋白是有效的血栓溶解剂，其具有比单独的相应的纤溶酶原激活物更低的出血危险。这个测定法在实施例8中描述。
提供下列具体实施例作为帮助实践本发明的指导，而不希望作为对于本发明范围的限制。应当理解，在下列制备和实施例中，抗体片段和纤溶酶原激活物片段的组合只有当此类组成导致稳定的融合蛋白时是允许的。
实施例1 抗P-选择素-DSPA融合蛋白的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析 纯化的HuSZ51-DSPAα1融合蛋白通过SDS-PAGE和通过蛋白质印迹法进行分析。数据表明，纯化的HuSZ51-DSPAα1是完整的并且不含可检测的污染性材料。
1.通过SDS-PAGE来分析HuSZ51-DSPAα1。纯化的HuSZ51-DSPAα1、重组DSPAα1和人IgG1在4-10％梯度SDS-PAGE凝胶上在非还原和还原条件下分离，并用考马斯蓝染色。结果显示于图3A中。在非还原条件下，HuSZ51-DSPAα1具有～250kDa的表观Mr.，和在还原条件下，HuSZ51-DSPAα1由～108kDa和～23kDa的两个亚基组成，所述两个亚基分别对应于HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1和HuSZ51-VLCκ。在纯化的HuSZ51-DSPAα1材料中没有明显的降解产物或杂质。
2.通过蛋白质印迹法来分析HuSZ51-DSPAα1。纯化的HuSZ51-DSPAα1、重组DSPAα1和人IgG1在4-10％梯度SDS-PAGE凝胶上在非还原和还原条件下分离。电泳后，将凝胶上的蛋白质转移到Hybond ECL硝化纤维素膜(Amersham)上。将膜与ECL封闭剂(Amersham)一起在室温下孵育1小时，随后用PBST洗涤3次。然后将膜与生物素化的抗-DSPA单克隆9B3(抗-DSPA，1∶4000)一起孵育并随后与HRP-抗生物素蛋白(1∶5000)进一步孵育，或者与缀合有HRP的山羊抗人IgG Fc(GAH-IgG，1∶7500)一起孵育。ECL蛋白质印迹法检测试剂(Amersham)的添加导致在标准X射线胶片上捕获到化学发光信号。这些结果显示于图3B中。抗DSPA在非还原条件下检测到HuSZ51-DSPAα1为单一种类。GAH-IgG在非还原条件下检测到HuSZ51-DSPAα1为单一种类，和在还原条件下检测到HuSZ51-DSPAα1为两个种类(HuSZ51-VHCγ1-3-DSPAα1和HuSZ51-VLCκ)。在纯化的HuSZ51-DSPAα1材料中没有明显的降解产物或杂质。
使用这些方法，分析了其他抗P-选择素-DSPAα1融合蛋白的纯度和完整性，包括HuSZ51Fab′-DSPAα1，其缺乏HuSZ51-DSPAα1中的CH2和CH3结构域；和scFvSZ51-DSPAα1，其为(从N-至C-末端)包含SZ51-VL区、随后为SZ51-VH区和成熟的分泌形式的DSPAα1的单链抗体。类似方法用于分析本发明的其他融合蛋白的纯度和完整性。
实施例2 抗P-选择素-DSPAα1融合蛋白的特异性P-选择素结合活性 纯化的HuSZ51-DSPAα1在体外特异性地结合P-选择素的能力使用硝化纤维素结合测定法和通过ELISA来进行研究。数据表明，HuSZ51-DSPAα1保留了原始的抗P-选择素单克隆抗体SZ51的P-选择素结合活性。
1.HuSZ51-DSPAα1与硝化纤维素膜上的P-选择素的结合。将指定量(0、5、10、20或40ng)的重组可溶性P-选择素(R&D systems)连同10ng人IgG1一起在SDS-PAGE凝胶上分离，并随后转移到硝化纤维素膜上。一张膜与HuSZ51一起孵育，和第二张膜与HuSZ51-DSPAα1一起孵育。洗涤后，结合的HuSZ51或HuSZ51-DSPAα1通过缀合有HRP的山羊抗人Fc进行检测。将还通过缀合有HRP的山羊抗人Fc进行检测的人IgG1泳道的强度用作标准化对照。图4A显示，HuSZ51和HuSZ51-DSPAα1在其结合固定在硝化纤维素膜上的P-选择素的能力方面是无差别的。
2.HuSZ51-DSPAα1在ELISA中与P-选择素的结合。96孔板用每孔100μl的重组人P-选择素(R&D Systems)以2μg/ml的终浓度(在PBS中重构)进行包被，并于4℃孵育过夜。经包被的平板在洗涤溶液(PBS，pH7.4加上0.05％Tween-20)中洗涤一次，随后用每孔200μl封闭溶液(在PBS中制备的5％牛奶)于37℃孵育2小时。在封闭后，平板用洗涤溶液洗涤3次，随后用包含各种量的HuSZ51-DSPAα1、人IgG1或BSA的100μl洗涤溶液于37℃孵育1小时。平板用洗涤溶液洗涤3次，随后与缀合有过氧化物酶的蛋白L(Pierce)一起于37℃孵育1小时。平板用洗涤溶液洗涤4次，随后与100μl TMB/E底物(ZYMED)一起在室温下孵育5分钟。过氧化物酶反应通过加100μl 1N HCl来中止，并且将平板在5分钟内于450nm处读取吸光度。图4B显示，HuSZ51-DSPAα1而不是人IgG1能够结合固定在塑料上的P-选择素。
实施例3 抗P-选择素-DSPA融合蛋白对于P-选择素的竞争性结合 设计基于ELISA的竞争结合测定法以比较亲本P-选择素抗体SZ51与抗P-选择素-DSPA融合蛋白HuSZ51-DSPAα1的P-选择素结合亲和力。96孔板用每孔100μl重组人P-选择素(R&D Systems)以2μg/ml的终浓度进行包被，并于4℃孵育过夜。经包被的平板用洗涤溶液(PBS，pH7.4加上0.05％Tween-20)洗涤1次，随后用每孔200μl封闭溶液(在PBS中制备的5％牛奶)于37℃孵育2小时。
以0-200nM的终浓度将50μl系列稀释的竞争者(HuSZ51-DSPAα1，或作为负对照的人IgG1)加入至单个孔中，随后除了空白对照外向每个孔中加入50μl SZ51(1.6nM的终浓度)，然后将平板于37℃孵育1小时。将平板用洗涤溶液洗涤3次，随后与二抗即缀合有过氧化物酶的抗小鼠IgG(SANTA CRUZ，#S-2031)一起于37℃孵育1小时。将平板用洗涤溶液洗涤4次，随后与100μl TMB/E底物(ZYMED)一起在室温下孵育5分钟。过氧化物酶反应通过加入100μl 1N HCl来中止，并且将平板在5分钟内于450nm处读取吸光度。图5中显示的结果表明，HuSZ51-DSPAα1能够以剂量依赖性方式抑制SZ51与P-选择素的结合，这证实抗P-选择素-DSPA融合蛋白保留了与抗P-选择素小鼠单克隆抗体相同或相似的P-选择素结合活性。
实施例4 抗P-选择素-DSPA融合蛋白的结合活化的血小板的活性 通过ELISA来研究纯化的HuSZ51-DSPAα1在体外特异性地结合经人或犬凝血酶激活的血小板的能力。96孔板用每孔100μl包含1×106个经凝血酶激活的人或犬血小板的溶液包被，并于4℃孵育过夜。经包被的平板用洗涤溶液(PBS，pH7.4加上0.05％Tween-20)洗涤1次，随后用每孔200μl封闭溶液(在PBS中制备的5％牛奶)于37℃孵育2小时。经封闭的平板用洗涤溶液洗涤3次，随后用包含各种量的HuSZ51-DSPAα1、SZ51或人IgG1的100μl洗涤溶液于37℃孵育1小时。平板用洗涤溶液洗涤3次，随后与缀合有过氧化物酶的蛋白L(Pierce)一起于37℃孵育1小时。平板用洗涤溶液洗涤4次，随后与100μl TMB/E底物(ZYMED)一起在室温下孵育5分钟。过氧化物酶反应通过加入100μl 1N HCl来中止，并且将平板在5分钟内于450nm处读取吸光度。图6A显示，HuSZ51-DSPAα1和SZ51在其于体外特异性地结合人的经凝血酶激活的血小板的能力方面是无差别的。图6B显示，HuSZ51-DSPAα1在体外能够特异性地结合犬的经凝血酶激活的血小板。
实施例5 抗P-选择素-DSPA融合蛋白的催化活性 使用生色测定法(Bringmann，P.等人(1995)，同上)来比较抗P-选择素-DSPA融合蛋白HuSZ51-DSPAα1与重组DSPAα1的的催化活性。S-2288(D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺二盐酸盐)是大范围丝氨酸蛋白酶的生色底物。S-2765(α-苄氧羰基-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺二盐酸盐)是因子Xa的生色底物。纤溶酶原激活物如DSPAα1从这些生色底物上切割下对硝基苯胺(“pNA”)基团。反应混合物在96孔板中以每孔150μl的体积制备，包含10nM HuSZ51-DSPAα1或20nM DSPAα1(等摩尔量，因为每个HuSZ51-DSPAα1包含2个DSPAα1分子)，以及0.1-0.8mM S-2288或S-2765，在碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3和0.1％Tween 80)，pH9.5中。允许水解反应在室温下进行，并使用微量滴定板阅读器通过405nm处吸光度值的改变来测量反应速度。所得到的值使用标准曲线转化为[pNA]，并将数据对S-2288或S-2765浓度进行作图。动力学参数Km、Kcat和Km/Kcat根据米-曼二氏方程用计算机化程序(KaleidaGraph 3.0)来计算。图7中显示的结果证实，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1具有类似的体外催化活性。
实施例6 抗P-选择素-DSPA融合蛋白的纤维蛋白溶解活性 纤溶酶原激活物例如DSPAα1将纤溶酶原转化为纤溶酶，所述纤溶酶反过来降解纤维蛋白。纤维蛋白降解速率可以通过405nm处的吸光度值来监控(降解伴随吸光度值的减少而进行)。体外纤维蛋白溶解活性以两种凝块溶解测定法形式进行测量(A)分别使用纤溶酶原和纤维蛋白原作为酶和底物；和(B)使用血浆作为酶和底物的来源。(A)在纤维蛋白凝块溶解测定法中，反应混合物如下在96孔板中进行制备将20μl HuSZ51-DSPAα1(12.5、25和50nM)或等摩尔量的DSPAα1、10μl纤维蛋白原(20mg/ml)、1μl纤溶酶原(1U/ml)、2μl 1M CaCl2、60μl 0.04M HEPES(pH7.0)、0.15M NaCl和0.01％Tween 80(v/v)混合。立即将混合物加入至包含4μl凝血酶的另一孔中(75U/ml)。混合物的总体积用水补足至120μl。混合后，405nm处的吸光度于37℃每分钟进行监控，共60分钟。数据通过KaleidaGraph 3.0进行分析。(B)血浆凝块溶解测定法如(A)中一样进行准备，除了使用30μl重构的人血浆(51mg/ml，Sigma)代替纤维蛋白原和纤溶酶原。如图8所示，HuSZ51-DSPAα1和DSPAα1的体外纤维蛋白溶解活性在纤维蛋白凝块溶解测定法中是无差别的(上图)，和在血浆凝块溶解测定法中是相当的(下图)。
实施例7 抗P-选择素-DSPA融合蛋白的体外血栓溶解活性 HuSZ51-DSPAα1的血栓溶解活性在凝块溶解测定法中使用缺少血小板(上图)或富含血小板(下图)的血浆进行评估。测定法基本上如实施例6中所述进行。缺少血小板的血浆包含大约2×104个血小板/μl，和富含血小板的血浆包含大约2×105个血小板/μl。HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1和uPA(Sigma)的纤维蛋白溶解活性在血浆凝块溶解测定法中使用缺少血小板(上图)或富含血小板(下图)的血浆进行比较。HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1或uPA在1ml重构的人血浆中与I125-标记的凝块一起孵育3小时，并取出100μl上清液以测量可溶放射性。溶解百分比是可溶放射性/总放射性×100％。使用缺少血小板或富含血小板的血浆，HuSZ51-DSPAα1的体外血栓溶解活性与DSPAα1相当并且优于uPA。
实施例8 抗P-选择素-DSPA融合蛋白的体内血栓溶解活性 犬股动脉血栓溶解模型 将雄性毕尔格猎犬(beagle dog)(8-12kg)用异氟烷(2-3％)麻醉并插入气管套管。分离右和左股动脉并围绕动脉放置超声流量探针(2.5SB)。将充满盐水的导管插入左和右颈静脉用于血液取样并用于施用HuSZ51-DSPAα1、DSPAα1或媒介物(vehicle)。为了测量血液动力学参数，将Miller压力传感器导管(2Fr.)插入右肱动脉。切口用创缘夹闭合。
在实验整个过程中监控血压、心率和股动脉流量，并通过NOTOCORD数据获得系统进行加工。通过视觉来监控呼吸模式。从股血流量测量中获得功效参数，例如FeCl2应用后到达闭塞的时间、药物施用后到达再灌注的时间和再灌注的持续时间。对于其血管在药物施用后没有复通的动物，再灌注时间记录为240分钟(整个观察期)，和再灌注持续时间为0分钟。药物施用后灌注到股血管床中的总血流量通过计算曲线下面积(AUC)来测定，并且表达为基线值的百分比。对于预防血管，计算到达闭塞的时间、再灌注的总持续时间和曲线下面积作为功效的量度。
将左前爪的4个趾甲中的每一个分派用于出血时间测定。出血通过使用趾甲修剪器修剪指甲表皮(从末端～3mm)来诱导。将伤口停止出血的时间记录为初期出血时间。对于先前已凝结的那些指甲，监控并记录再出血时间。
离体α2-抗纤溶酶和DSPA活性通过比色测定法来测定。内源α2-抗纤溶酶活性通过使用D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺作为底物进行测定，并且于405nm处测量活性动力学。
在血液动力学参数稳定后，获取血液(4ml)样品并测量基础出血时间。将在10％FeCl2中浸透的滤纸(5×6mm)应用于分离的股动脉上10分钟以局部地化学损伤内皮。这导致血管内血栓形成性闭塞的逐步形成，并且完全闭塞了股动脉(血流量＝0)。保持40分钟的时间段以允许血栓在开始DSPA施用前成熟。第二个血液样品在闭塞后25分钟收集。从闭塞后40分钟开始，将DSPAα1(0.1、0.3和1.0mg/kg)、HuSZ51-DSPAα1(0.3和0.75mg/kg)或媒介物(1-2ml/kg)以快速浓注形式注射到颈静脉中。伴随着药物输注，将FeCl2应用于第二条股动脉以评估HuSZ51-DSPAα1或DSPAα1防止血栓形成的效应。进行出血时间测定，并在下列时间点上收集血液样品以用于离体α2-抗纤溶酶和DSPA活性的测量基线，药物施用后5、30、60、120、180和240分钟。
使用这种测定法，与DSPAα1相比较，本发明的融合蛋白显示出更好的血栓溶解活性，并具有较低的出血危险。
实施例9 这个实施例举例说明了包含本发明化合物的、用于口服施用的代表性药物组合物的制备 A.成分％重量/重量 本发明的融合蛋白 20.0％ 乳糖 79.5％ 硬脂酸镁 0.5％ 将上述成分混合并分配到各自包含100mg的硬壳明胶胶囊中，一个胶囊约等于每日总剂量。
B.成分 ％重量/重量 本发明的融合蛋白 20.0％ 硬脂酸镁 0.9％ 淀粉 8.6％ 乳糖 69.6％ PVP(聚乙烯吡咯烷)0.9％ 将除了硬脂酸镁以外的上述成分组合，并使用水作为造粒液进行粒化。随后将制剂干燥，与硬脂酸镁混合，并使用合适的压片机形成片剂。
C.成分 本发明的融合蛋白 0.1g 丙二醇 20.0g 聚乙二醇400 20.0g 聚山梨醇酯80 1.0g 水 足量至100mL 将本发明的融合蛋白溶解在丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨醇酯80中。然后，在搅拌情况下加入足够量的水以提供100mL的溶液，将该溶液过滤并装瓶。
D.成分％重量/重量 本发明的融合蛋白 20.0％ 花生油78.0％ 司盘602.0％ 将上述成分熔化，混合，并填充到软弹性胶囊中。
E.成分 ％重量/重量 本发明的融合蛋白 1.0％ 甲基或羧甲基纤维素 2.0％ 0.9％盐水 足量至100mL 将本发明的融合蛋白溶解在纤维素/盐水溶液中，过滤，并装瓶以用于使用。
实施例10 这个实施例举例说明了包含本发明融合蛋白的、用于肠胃外施用的代表性药学制剂的制备 成分 本发明的融合蛋白0.02g 丙二醇 20.0g 聚乙二醇400 20.0g 聚山梨醇酯801.0g 0.9％盐水溶液 足量至100mL 将本发明的融合蛋白溶解在丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨醇酯80中。然后，在搅拌情况下加入足够量的0.9％盐水溶液以提供100mL的静脉内注射溶液，将该溶液经过0.2m膜过滤器进行过滤并在无菌条件下进行包装。
实施例11 这个实施例举例说明了包含本发明融合蛋白的、以栓剂形式的代表性药物组合物的制备 成分 ％重量/重量 本发明的融合蛋白 1.0％ 聚乙二醇1000 74.5％ 聚乙二醇4000 24.5％ 将所述成分熔化在一起，并在蒸气浴中混合，并且倾入包含2.5g总重量的模子中。
实施例12 这个实施例举例说明了包含本发明融合蛋白的、用于吹入的代表性药学制剂的制备 成分 ％重量/重量 微粒化的本发明的融合蛋白 1.0％ 微粒化的乳糖 99.0％ 将所述成分碾磨，混合，并包装在装备有定量给药泵的吹入器中。
实施例13 这个实施例举例说明了包含本发明融合蛋白的、以喷雾形式的代表性药学制剂的制备 成分 ％重量/重量 本发明的融合蛋白 0.005％ 水 89.995％ 乙醇 10.000％ 将本发明的融合蛋白溶解在乙醇中，并掺和入水。然后，将制剂包装在装备有定量给药泵的喷雾器中。
实施例14 这个实施例举例说明了包含本发明融合蛋白的、以气雾剂形式的代表性药学制剂的制备 成分 ％重量/重量 本发明的融合蛋白 0.10％ 推进剂11/1298.90％ 油酸 1.00％ 将本发明的融合蛋白分散在油酸和推进剂中。然后，将所得到的混合物倾入配备有计量阀的气雾剂容器中。
上文说明书中提及的所有出版物和专利引入本文作为参考。尽管本发明已参照其具体的实施方案进行了描述，但本领域技术人员应当理解，可以进行各种改变并且可以替代以等价物而不背离本发明的真正精神和范围。此外，可以进行许多修改以使具体情况、材料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目标、精神和范围。希望所有此类修饰位于在此所附的权利要求书的范围内。
权利要求
1.血栓溶解融合蛋白，其包括结合血管损伤相关的生物学结构的靶向性蛋白，所述靶向性蛋白可操作地连接至纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物选自t-PA衍生的纤溶酶原激活物、DSPA衍生的纤溶酶原激活物、尿激酶衍生的纤溶酶原激活物或其类似物、片段、衍生物或变体。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物选自DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ。
4.上述权利要求之一的融合蛋白，其中所述靶向性蛋白结合在活化的血小板或活化的内皮细胞表面上的P-选择素、CD40L、CD63、糖蛋白1ba或蛋白质二硫键异构酶。
5.上述权利要求之一的融合蛋白，其中所述靶向性蛋白是抗体。
6.权利要求5的融合蛋白，其中所述抗体不与P-选择素-糖蛋白-配体-1竞争结合P-选择素。
7.权利要求5的融合蛋白，其中所述抗体不与糖蛋白1b-IX-V竞争结合P-选择素。
8.权利要求5的融合蛋白，其中所述抗体不抑制白细胞与活化的血小板的粘附。
9.权利要求5的融合蛋白，其中所述抗体是单克隆抗体。
10.权利要求9的融合蛋白，其中所述单克隆抗体是单链抗体、Fab二聚体抗体或IgG抗体。
11.权利要求3-10之一的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物是DSPAα1，或其类似物、片段、衍生物或变体。
12.权利要求3-10之一的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物是DSPAα2，或其类似物、片段、衍生物或变体。
13.权利要求3-10中之一的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物是DSPAβ，或其类似物、片段、衍生物或变体。
14.权利要求3-10之一的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物是DSPAγ，或其类似物、片段、衍生物或变体。
15.权利要求1的融合蛋白，其包括包含选自SEQ ID NO.3-SEQID NO.8的氨基酸序列的蛋白质或者具有与其有着至少70％同一性的氨基酸序列并具有基本上相同的生物活性的任何蛋白质。
16.药物组合物，其包括上述权利要求之一的融合蛋白，所述组合物包括药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的所述融合蛋白。
17.用于诱导血栓溶解的方法，其包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述权利要求之一的融合蛋白。
18.权利要求17的方法，其中所述方法用于治疗动脉血栓形成，急性冠状动脉综合征，包括ST段升高型心肌梗死、非ST段升高型心肌梗死和不稳定型心绞痛，导管诱导的血栓形成，心室壁血栓的溶解，左心房血栓或人工瓣膜血栓和深部静脉血栓形成，肺栓塞或急性缺血性中风。
19.权利要求18的方法，其中所述融合蛋白在中风发作后超过3小时施用给患有急性缺血性中风的患者。
20.试剂盒，其包括上述权利要求1-15之一的融合蛋白。
21.试剂盒，其包括编码上述权利要求1-15之一的融合蛋白组分的DNA序列。
22.基因疗法组合物，其包括与治疗有效量的基因疗法载体相组合的、编码由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列组成的融合蛋白的DNA。
23.血栓溶解融合蛋白，其包括结合P-选择素的靶向性蛋白，其中所述靶向性蛋白是嵌合型小鼠-人单克隆抗体，所述抗体可操作地连接至DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体。
24.权利要求23的融合蛋白，其中所述嵌合型小鼠-人单克隆抗体是HuSZ51。
25.权利要求24的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及新型融合蛋白，其包括靶向性蛋白和纤溶酶原激活物，优选结合P-选择素并可操作地连接至纤溶酶原激活物DSPAα1或其类似物、片段、衍生物或变体的抗体，其用作血栓溶解剂。本文还描述了包含这些融合蛋白的药物组合物，使用这些融合蛋白作为血栓溶解剂的方法，以及用于合成这些融合蛋白的方法。
文档编号C12N9/72GK101155916SQ200580049371
公开日2008年4月2日 申请日期2005年9月6日 优先权日2005年3月4日
发明者J·潘, Q·吴, A·许特勒 申请人:帕昂德国有限公司