专利名称：微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂tnk突变体的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(rhTNK-tPA)的 生产新工艺，尤其是公开一种采用Cytopore多孔微载体培养法生产重组人 组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，以生产rhTNK-tPA，属于细胞 培养生产工艺方法技术领域。
本发明涉及的rhTNK-tPA可在临床上用于心肌梗死、脑血栓等血栓性 疾病的抢救与治疗，是此类疾病抢救与治疗的最新一代特效药物，具有疗 效好、安全性高、使用方便及便于抢救等众多优点。由于rhTNK-tPA在临 床上用量很大， 一般为30-40mg/剂，因此，如工程细胞株的大规模培养技 术不能高效表达生产rhTNK-tPA，贝U rhTNK-tPA产业化将无法进行，使 rhTNK-tPA这种优良的药物应用于临床也就没有可能。
目前，rhTNK-tPA在全球只有美国Genentech公司一家生产，其中的工 程细胞培养的工艺技术是采用发酵罐悬浮性、批次性的培养法，其缺点是 成本很高、工艺操作复杂，且不易扩大生产规模。
发明内容
本发明提供一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突 变体的工艺，克服了现有发酵罐悬浮性、批次性.培养法，成本很高、工
艺操作复杂等缺欠，适合于大规模培养及产业化生产。 本发明的技术方案是
在10L celligen灌注培养系统中采用Cytopore多孔微载体培养 rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞，以生产rhTNK-tPA。
A、 设计和合成基因
将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177位 AAC/Asn变为CAA/Gln(Nl 17Q)， 再将天然型tPA的296位Lys、 297位 His、 298位Arg和299位Arg全部替换为Ala [KHRR(296-299)AAAA]。
根据天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、 N、 K突变位点的tPA 突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入XhoI和Xba I限制性内切酶位点。基因全长1.7kb。采用全基因人工合成的方法获得基 因。
B、 构建TNK-tPA真核表达质粒
将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的 基因的1.7kb的DNA片段，与以XhoI/Xbal双酶切的哺乳动物细胞表达载 体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E,c。li JM109，以载体上的通用引物做PCR 初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA。
C、 转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆，构建工程细胞株，建立工 程细胞库。
D、 rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞的培养发酵
将冻存的TNK-tPA基因工程CHO细胞株，置水浴中快速融解，将细 胞加入培养液，混匀离心，弃上清；细胞沉淀加培养基重新悬浮后，转移
至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌 器培养14一18天，达到2xl0VmL后，直接转移到Celligen反应器中，采 用Cytopore多孔微载体进行培养。培养温度为37。C; pH=7.1±0.1;溶氧 为30 60%范围内；转速起始转速为20rpm， 4小时后逐渐增加转速，接 种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓 度达到一定水平后，即可进行收获。
本发明的有益效果在于釆用Cytopore多孔微载体培养TNK-tPA基因 工程细胞以生产TNK-tPA，具有细胞密度大、成本低、表达水平高、表达 产物比活高的特点，且操作简单，适合于大规模培养及产业化生产。该法 细胞密度达到3xl0々mL以上，rhTNK-tPA表达水平可达55mg/L以上，培 养液的比活可达3.8万IU/mL以上,其纯化物的比活可达50万IU/mg以上。
具体实施例方式
实施例
1、材料
1. l多孔微载体
Cytopore微载体为Pharmacia公司产品，基质是纤维素，直径 200pm，孔径30(im，膨胀体积为40mL/g。
用前用O. 1M、 PH7. 0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡4h后，倾去PBS，再用 PBS洗涤3次。121。C高压灭菌30min后，吸出PBS，用DMEN培养基洗两次。 1. 2细胞
生产rhTNK-tPA的工程细胞为含有TNK-tPA cDNA和dhfr基因的CHO
细胞系。
1.3培养基
培养基为DMEN，其中含5%胎牛血清(FBS)。培养基和FBS均为 GIBCO公司产品， 1. 4试剂
CHO-S-SII， GIBCO公司产品 MTX， SIGAN公司产品
庆大霉素，国产药用级
0. 25%胰酶，国产分析纯产品 其它试剂均为进口或国产分析纯产品。
1. 5培养容器及仪器 首先用Wheaton公司生产的搅拌器(1000mL)培养，搅拌转速20 40r/min，之后转入Celligen 10L旋转生物反应器(NBS公司产品)灌注培 养。
旋转生物反应器(即发酵罐)系统能自动控制温度、pH、转速、溶氧 含量。通过气体混合器改变氮气、氧气、空气和二氧化碳的流量来控制溶 解氧和pH，采用硅胶管无泡气体交换系统，孔径75 um的不锈钢旋转滤器 通过截流微载体而截留生长在微载体内的细胞，脱落细胞可进入旋转滤器 内随培养上清流出反应器，避免堵塞。
1. 6细胞计数
柠檬酸结晶紫法，保温时间延长至4小时，并不时振摇。 1. 7 rhTNK-tPA含量测定
采用tPA-ELISA检测盒(Pharmacia公司产品)，按检测盒的操作步骤
进行，以标准品绘制标准曲线，然后计算出样品含量。
1. 8rhTNK-tPA活性测定
采用发泡法进行，具体操作方法见《中华人民共和国药典》第二部。 1. 9葡萄糖、乳酸和氨的测定
使用血糖检测盒(北京百泰生物技术公司产品)测定样品中的葡萄糖 含量。使用乳酸和氨检测盒(德国Centronic公司产品)分别测定样品中乳 酸和氨的含量。
1. 10其它仪器或器材
二氧化碳培养箱、倒置光学显微镜、生物安全柜、T-25、 T-75、 T-150
细胞培养瓶等。 2方法
2.1工程细胞株的构建 设计和合成基因
将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177 位AAC/Asn变为CAA/Gln(Nl 17Q)， 再将天然型tPA的296位Lys、 297 位His、 298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR(296-299)AAAA]。
根据野天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、 N、 K突变位点的tPA 突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入XhoI和Xba I限制性内切酶位点。基因全长1.7kb。采用全基因人工合成的方法获得基 因。
构建TNK-tPA真核表达质粒
将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的
基因的1.7kb的DNA片段，与以XhoI/Xbal双酶切的哺乳动物细胞表达载 体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.cdi JM109，以载体上的通用引物做PCR 初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA。 转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆
以TNK-tPA表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO(DHFR-)细胞，以含双抗 的选择性培养液培养，每隔二 三天换一次培养液，直到大部分细胞死亡并 从培养板上脱落，少数整合外源基因的细胞克隆在选择性培养液上存活下 来，并不断分裂形成细胞集落(克隆)。当细胞数目增加到一定程度时，收集 各孔培养上清，检测表达产物。选取表达量高的克隆，以胰酶消化，重新 分入细胞培养板中，换用含MTX的选择培养液进行培养，在培养过程中， 大部分细胞死亡，又有少数细胞形成新的克隆。重复上述操作，将MTX浓 度提高一个水平。在克隆的筛选过程中，MTX浓度从4xlO—SM逐步提高到 1.5xl0—6M，同时tPA的表达水平也逐步提高。将获得的阳性细胞克隆进行 鉴定，符合要要求后，建立工程细胞库。 2. 2细胞复苏
从细胞种子库中取出冻存的细胞株，立即置37 。C水浴中快速融解， 将细胞加入10mLIMDM培养液(含10%FBS、 2X10—8M MTX 、 100IU/ 庆大霉素)，混匀，800 1000mrp离心15分钟，弃上清。细胞沉淀重新悬 浮10毫升上述培养基中，转移至T25细胞培养瓶中，37°C， 5%C02培养。 次日换液。 一般2—3天细胞形成致密单层细胞。
2. 3细胞扩增
上述单层细胞转入Wheaton搅拌器培养。由于Cytopore微载体是多孔
性的，非常有利于细胞的贴附，当培养基中微载体膨胀体积/培养体积为l/io
时(2.5mg/mL)，细胞经14~18天培养，即可达到2xl07/mL ，此时细胞 己完全长满微载体。在培养过程中，随着细胞浓度的升高，换液频率由隔 天一次逐渐增加到一天两次。
2. 4旋转生物反应器(发酵罐)培养
2. 4. 1准备
将罐体清洗干净后用加入PBS缓冲液(一般为罐体积的2/3)， 120°C 2 小时灭菌。
次日补加PBS，安装并校正PH电极、溶氧电极、液位电极等，120°C 2 小时灭菌。
2. 4. 2培养
a、 参数设定
冷却后的培养装置工作参数设定 PH 7.1 ±0.1 DO 30-60%
温度37°C
起始转速 20 100rpm
12小时后，排空PBS缓冲液，加入等体积用IMDM培养液(含5%FBS、 2X 1(T8M MTX 、 100IU/ml庆大霉素)悬浮经湿热灭菌的微载体(5g/L)。
b、 接种
将在搅拌器中生长达到2xlO々mL的细胞直接转移到Celligen反应器 中，并补充培养液及新鲜微载体(5mg/mL)，接种细胞量为1: 10。细胞
能够在微载体珠间自动转移，新鲜微载体逐渐长满细胞。7天后，新鲜微载
体上长有细胞。经20天左右的培养，细胞浓度可达到3xlO々mL。
c、 培养过程控制
培养基流加流加IMDM培养液(10%FBS、 2X10—8M MTX)，使 培养体系中葡萄糖的含量维持在10 mmol/L水平以上，每天耗糖在5g/L以 上时，细胞密度达到1 2X1(T个细胞/L。
流加CHO-S-SII培养液(含葡萄糖4克/L、 2X1(T8M MTX) 4个培 养体积后，流加含抑肽酶的CHO-S-SII培养液(含葡萄糖4克/L、 2X 10—8M MTX)，并单独收获该培养物质，用于纯化生产TNK-tPA蛋白质。
d、 注意
细胞培养达到较高密度时，产酸增加，培养体系酸化较快，系统自动 根据PH变化，自动流加7.5XNaHC03， pH值控制在7.1 ±0.1范围内。 乳酸和氨在培养液中的浓度分别不超过2g/L和3.6mmol/L。 温度因TNK-tPA-CHO细胞的最适生长温度为37°C，故培养温度为 37°C。
溶氧设定在30 60%范围内。
转速起始速为20rpm，以利于细胞黏附在微载体上，4小时后逐渐增 加转速，接种6小时达到40rpm。 3结果
细胞密度达到3xlO々mL以上，rhTNK-tPA表达水平可达55mg/L以上， 培养液的比活可达3.8万IU/mL以上,其纯化物的比活可达50万IU/mg以上。
权利要求
1、一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，在10L celligen灌注培养系统中采用Cytopore多孔微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的基因工程CHO细胞。
2、 一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变 体的工艺，包括以下步骤A、 设计和合成基因将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将 177位AAC/Asn变为CAA/Gln(Nl 17Q), 再将天然型tPA的296位 Lys、 297位His、 298位Arg和299位Arg全部替换为Ala [KHRR(296-299)AAAA];根据天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、 N、 K突变位点 的tPA突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引 入XhoI和Xbal限制性内切酶位点，基因全长1.7kb;B、 构建TNK-tPA真核表达质粒将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收 含目的基因的1.7kb的DNA片段，与以XhoI/Xbal双酶切的哺乳动 物细胞表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coUJM109，以载体上 的通用引物做PCR初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA;C、 转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆，构建工程细胞株， D、 rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞的培养发酵 将冻存的TNK-tPA基因工程CHO细胞株，置水浴中快速融解， 将细胞加入培养液，混匀离心，弃上清；细胞沉淀加培养基重新悬浮 后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入 Wheaton搅拌器培养14一18天，达到2xlO々mL后，直接转移到 Celligen反应器中，采用Cytopore多孔微载体进行培养；培养温度为 37°C ;pH=7.1 ±0.1;溶氧为30 60%范围内；转速起始转速为20rpm， 4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜 微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。
全文摘要
本发明公开一种采用Cytopore多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的新生产工艺，将TNK-tPA基因工程CHO细胞株加培养基重新悬浮后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌器培养后，转移到Celligen反应器中，培养温度为37℃；pH＝7.1±0.1；溶氧为30～60％范围内；转速起始转速为20rpm，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。用Cytopore多孔微载体培养TNK-tPA基因工程细胞生产TNK-tPA，具有细胞密度大、成本低、表达水平高、表达产物比活高的特点，且操作简单，适合于大规模培养及产业化生产。
文档编号C12N15/09GK101096655SQ20071005574
公开日2008年1月2日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者冯来坤 申请人:冯来坤