专利名称：一种用于研究胚胎干细胞发育分化的人造子宫三维凝胶模型的制作方法
技术领域：
本发明属组织工程与再生医学研究领域，涉及到体外制备组织工程化子宫，胚胎
干细胞培养与胚胎干细胞体外分化发育等一系列关键技术。这种方法能在体外构建含子宫 壁三层结构的组织工程化人造子宫片层或双层的子宫内膜，将胚胎干细胞接种表面或均匀 复合在内部使之作为细胞分化发育的研究模型，并通过调控胚胎干细胞生长的微环境，以 再造的子宫组织为主体进行胚胎干细胞的分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化 发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞 定向分化新方法。
背景技术：
胚胎干细胞是近年来科学界研究的热点，其多向发育的潜能在组织工程研究领域 具有重大的价值和应用前景。但是，目前对胚胎干细胞的研究尚属初步，缺乏诱导形成组织 器官目的细胞的有效手段，体外研究体系与在体发育环境的存在很大差异这些现状都限制 了胚胎干细胞的应用。考虑到上述困难，发明一种有效的胚胎干细胞体外分化发育模型显 得至关重要。 子宫是胚胎发育的母体天然环境，对胚胎的发育期起着至关重要的作用。母体子 宫支持着胚胎着床，浸润，生长，发育，直至形成胎儿。现有的研究表明，体外培养的单层子 宫细胞可用作饲养细胞支持胚胎干细胞体外建系；再造的双层子宫内膜可用于研究胚胎体 外发育。考虑到体外再造子宫对胚胎发育的支持作用，子宫内膜细胞及再造子宫在体外将 会对胚胎干细胞的分化发育产生怎样的影响呢？ 总结现有研究，胚胎干细胞的分化发育模型主要包括二维的悬浮悬滴培养，三维 生物反应器，多孔聚合物支架及凝胶类支架的三维分化发育模型。相交于传统的二维分化 发育培养，三维模型为进一步研究胚胎干细胞分化发育提供了有效发育空间，但是简单的 三位支架仍与体内胚胎内细胞团在子宫内的分化发育环境有很大差别，这些模型都不具备 良好的仿生条件。由此，发明者提出了构建体外再造子宫仿生环境作为胚胎干细胞分化发 育模型的设想。 组织工程研究技术的飞速发展，为体外再造子宫奠定了坚实的基础。国内外研究 者在体外构建子宫内膜并在其上进行胚胎的培养研究，本实验室构建了包含子宫平滑肌的 三层再造子宫，用于研究其对胚胎的支持作用。这些已有的组织工程化子宫的实验基础为 我们构建再造子宫模型提供了可靠的技术平台。 从以上的研究出发，我们将体外再造的子宫作为研究胚胎干细胞分化发育的研究 模型，来调控胚胎干细胞的分化，将有望解决胚胎干细胞分化中的关键技术问题，从而在胚 胎干细胞分化发育上取得重大突破。这一研究成果对基于胚胎干细胞的治疗具有重大的理 论意义和应用价值。
发明内容
为研究胚胎干细胞在体外仿生环境中的分化与发育，本发明提供一种用于研究胚 胎干细胞发育分化的人造子宫三维凝胶模型及其制备方法。 因此，本发明的第一个发明目的是提供一种用于研究胚胎干细胞发育分化的人造 子宫三维凝胶模型的制备方法(参见图1)，步骤包括 将I型液态胶原与Matrigel胶(SIGMA， E1270)按4 : 1混合均匀，然后将其与含 有子宫平滑肌细胞的DMEM-F12浓縮培养液等体积混合，用0. 1M的NaOH适量，将混合物pH 值调为7. 2 7. 4，加入至已制备好的12孔板模具中，每孔各注入0. 4ml。将其置于37°C、 5% C02培养箱中孵育5mim液态复合物凝固后取出。按照相同的方法，将子宫基质细胞加 在已凝固的平滑肌细胞表面，待凝固后再以相同的方法加入子宫内膜上皮细胞。制成三维 立体人造子宫三维凝胶模型。 在一个具体实施方案中，还可分别将子宫平滑肌细胞、基质细胞和子宫内膜上皮 细胞预先与细胞外基质凝胶混合成复合物片层，然后将三种复合物片层依次叠加，得到具 有三明治结构形式的三层的人造子宫三维凝胶模型。 在另一个具体实施方案中，其中所使用的含Matrigel胶的细胞外基质凝胶，在 4t:时为液态，调节pH = 7. 4，室温短时间能凝结为固态，并可用0. lmol/L NaOH来调节pH ; 通过改变胶原凝胶制备过程中的冰醋酸单位体积内含鼠尾胶原纤维的数量，控制所制备的 I型液态胶原浓度，制备不同浓度的I型液态胶原，用于研究不同细胞外基质浓度下子宫细 胞的生长增值情况。 在一个具体实施方案中，如下制备I型液态胶原 i.颈椎脱位法处死SD大鼠，从大鼠尾根部剪断鼠尾，置于75X酒精中浸泡 30min ; ii.无菌条件下剥离尾部的皮肤，并将鼠尾剪成若干小节；用眼科镊从截断面抽
取尾腱，并用PBS漂洗3次；将清洗后的尾腱放入无菌的0. 1 %冰醋酸溶液中，置于4t:冰
箱，间或震荡以促进尾腱溶解； iii. 48小时后4000rpm离心30min，收集上清即得I型液态胶原溶液；
iv.牛皮纸法测量胶原浓度。在另一个实施方案中，如下制备DMEM-F12浓縮培养液DMEM_F12干粉一袋，
2. 2gNaHC03，2. 383g HEPES， 10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于500ml超纯水中，调
节pH值为7. 2 7. 4，0. 45 ii m禾P 0. 22 ii m微孔滤膜过滤除菌，4t:保存。 还在另一个实施方案中，如下制备12孔板模具将2%的琼脂高压灭菌后注入12
孔板中，每孔各lml，待琼脂凝固后，均匀插入4根长度约为lcm的无菌玻璃毛细管(直径
2mm±0. 15mm)。在超净台中将孔板盖子打开，紫外照射模具30min，之后将其放入37°C 、5%
(A培养箱中待用。 在另一个具体实施方案中，其中所述的子宫体外三维凝胶模型结构还可加入添加
性激素，以调节子宫增殖分泌周期和模拟胚胎的体内发育的生理环境，其中性激素包括雌
激素、孕激素和/或雄激素，添加方式可以是按正常生理周期规律进行依次或复合添加。 本发明的第二个目的是提供由上述方法制备的人造子宫三维凝胶模型。 在一个具体实施方案中，所述的人造子宫三维凝胶模型，其中可采用静态拉伸的方式，通过玻璃柱模具固定模型片层，以模拟胚胎的体内发育的力学环境。 本发明的第三个目的是通过所述的人造子宫三维凝胶模型，提供一种来研究子宫
内胚胎肝细胞分化发育的方法，包括 (1)将胚胎干细胞以单细胞形式接种在已制备好的人造子宫三维凝胶表面，通过 观察胚胎干细胞悬浮形成的拟胚体样向子宫三维片层移行浸润或植入，以及在片层中分化 发育的现象，探索胚胎干细胞及胚胎早期发育事件；或 (2)将胚胎干细胞以单细胞形式接种在人造子宫内部，即直接以单细胞的形式与
子宫内膜细胞混合后，与细胞外基质凝胶制成复合物片层中，并如权利要求1所述的方法
制成人造子宫三维凝胶模型，以观察胚胎干细胞在子宫片层中的分化发育现象。 在一个具体实施方案中，其中还可在人造子宫三维凝胶模型中，添加不同的诱导
因子，观察其对胚胎干细胞分化的影响，所述的诱导因子包括Vc、 RA、 activin-A、 TGF和
IGF。 本发明的第四个目的是通过所述的人造子宫三维凝胶模型，提供一种来研究胚胎 干细胞在体外子宫内膜微环境中的分化发育的方法，包括 (1)将胚胎干细胞直接复合在单纯的细胞外基质凝胶中，观察胚胎干细胞自发分 化发育情况； (2)将胚胎干细胞复合在人造子宫三维凝胶的内膜片层中，观察子宫内膜微环境 为胚胎干细胞分化发育的影响。 在一个具体实施方案中，其中还可在人造子宫三维凝胶模型中，添加不同的诱导 因子，观察其对胚胎干细胞分化的影响，所述的诱导因子包括Vc、 RA、 activin-A、 TGF和 IGF。 本发明的第五个目的是提供一种人造子宫三维凝胶模型用于研究胚胎干细胞诱 导分化与发育的方法。其中所述的用途是通过调控胚胎干细胞生长发育的微环境，进行胚 胎干细胞诱导分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化发育的内在规律与机制，并 寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化(如心肌，神经， 血管)的新方法。 应当指出的是，本发明旨在提供一种细胞外基质凝胶模型的制备，并不旨在该 产品中所涉及的各种细胞。对于其中所述的细胞，如、子宫内膜上皮细胞、子宫平滑肌 细胞和间质细胞等材料，子宫内膜上皮细胞、子宫平滑肌细胞和间质细胞可以使用现有 技术进行制备(Establishment of a human endometrial cell culture system and characterization of its polarizedhormone responsive epithelial cells Cell Tissue Res. 1997 Jan ;287(1) :171-85.);或者使用普通实验室根据常规方法分离培养后 进行保藏的细胞系，或者使用商品化的细胞系。例如，本发明使用已建系的胚胎干细胞，由 军事医学科学院生物工程研究所提供的TC-1细胞。
图1 :体外构建含子宫壁三层结构的组织工程化人造子宫片层流程图
图2 :体外构建含子宫壁三层结构的组织工程化人造子宫片层 A :体外构建的组织工程化子宫片层的大体观察；B :含子宫壁三层结构的组织工程化人造子宫片层X5; 图3 :胚胎干细胞接种在子宫片层表面 A:胚胎干细胞形成的拟胚体X10;B:胚胎干细胞形成的拟胚体向子宫内膜移 行X40 图4 :DAPI标记的胚胎干细胞均匀复合在子宫片层内部形成的拟胚体X 10 图5 :胚胎干细胞在子宫片层中形成终末分化细胞 A :VIII因子染色X20 ; :B :cTnT染色X20 ;
具体实施例方式
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解， 下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有 其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、组织工程学等 等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Fabrication of viable tissue-engineeredconstructs with3D cell-assembly technique 〃 (2005); Extracellular matrix—enriched polymericscaffolds as a substrate for h印atocyte cultures :in vitro and in vivo studies" (2005)。实施例1.体夕卜构建含子宫壁的三 层结构的组织工程化人造子宫片层或双层的子宫内膜 体外构建的三层结构组织工程化人造子宫片层流程如图1所示。具体如下将I 型液态胶原与Matrigel胶按4 : 1混合均匀，然后将其与含有子宫平滑肌细胞的DMEM-F12 浓縮培养液等体积混合，用0. 1M的Na0H适量，将混合物pH值调为7. 2 7. 4，加入至已制 备好的12孔板模具中，每孔各注入0. 4ml。将其置于37°C、5% C02培养箱中孵育5mim液 态复合物凝固后取出。按照相同的方法，将子宫基质细胞加在已凝固的平滑肌细胞表面，待 凝固后再以相同的方法加入子宫内膜上皮细胞。制成三维立体人造子宫三维凝胶模型(如 图2所示)。添加雌孕激素，调节子宫增殖分泌周期。 实施例2.将胚胎干细胞以表面接种或内部均匀复合两种方式进入体外仿生模 型 D将胚胎干细胞接种在子宫片层表面将胚胎干细胞以单细胞的形式接种在已 制备好的子宫片中表面(如图3所示)，观察胚胎干细胞悬浮形成的拟胚体样向子宫片层移 形植入，以及在片层中分化发育的现象； 2)将胚胎干细胞以单细胞的形式与子宫内膜细胞混合，加入胶原凝胶中，用 0. lmol/LNaOH调节酸碱度至中性，再按4 : 1的比例加入10%的Matrigel，构建将胚胎干 细胞复合其中的子宫片层，观察胚胎干细胞在子宫片层中的分化发育现象(如图4所示)。
实施例3.胚胎干细胞诱导分化与发育研究 在已构建的胚胎干细胞子宫分化发育模型中，加入不同的诱导剂，观察胚胎干细 胞向不同成体细胞定向分化发育的能力。图5所示为胚胎干细胞在子宫片层中形成终末分 化细胞后的检测情况。
权利要求
一种研究胚胎干细胞发育分化的人造子宫三维凝胶模型的制备方法，步骤包括将I型液态胶原与Matrigel胶按4∶1混合均匀，然后将其与含有子宫平滑肌细胞的DMEM-F12浓缩培养液等体积混合，用0.1M的NaOH适量，将混合物pH值调为7.2～7.4，加入至已制备好的12孔板模具中，每孔各注入0.4ml；和将其置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5mim液态复合物凝固后取出；和按照相同的方法，将子宫基质细胞加在已凝固的平滑肌细胞表面，待凝固后再以相同的方法加入子宫内膜上皮细胞，制成三维立体人造子宫三维凝胶模型。
2. 权利要求1所述的制备方法，其中分别将子宫平滑肌细胞、基质细胞子宫内膜上皮细胞预先与细胞外基质凝胶混合成复合物片层，然后将三种复合物片层依次叠加，得到具有三明治结构形式的三层的人造子宫三维凝胶模型。
3. 权利要求1或2所述的制备方法，其中所使用的含Matrigel胶的细胞外基质凝胶，在4t:时为液态，调节pH = 7. 4，室温短时间能凝结为固态，并可用0. lmol/L NaOH来调节pH ;通过改变胶原凝胶制备过程中的冰醋酸单位体积内含鼠尾胶原纤维的数量，控制所制备的I型液态胶原浓度，制备不同浓度的I型液态胶原，用于研究不同细胞外基质浓度下子宫细胞的生长增值情况。
4. 权利要求1或2所述的制备方法，其中在所制备三维立体细胞外基质凝胶模型中添加不同性激素，以制备用于ESC定向诱导分化研究的凝胶模型，所述的性激素可包括包括雌激素、孕激素和/或雄激素，添加方式可以是按正常生理周期规律进行依次或复合添加。
5. —种通过权利要求1至4任一项所述方法制备的人造子宫三维凝胶模型。
6. —种通过权利要求5所述的人造子宫三维凝胶模型，来研究子宫内胚胎肝细胞分化发育的方法。
7. 权利要求7所述的方法，其中包括1) 将胚胎干细胞以单细胞形式接种在已制备好的人造子宫三维凝胶表面，通过观察胚胎干细胞悬浮形成的拟胚体样向子宫三维片层移行浸润或植入，以及在片层中分化发育的现象，探索胚胎干细胞及胚胎早期发育事件；或2) 将胚胎干细胞以单细胞形式接种在人造子宫内部，即直接以单细胞的形式与子宫内膜细胞混合后，与细胞外基质凝胶制成复合物片层中，并如权利要求1所述的方法制成人造子宫三维凝胶模型，以观察胚胎干细胞在子宫片层中的分化发育现象。
8. —种通过权利要求5所述的人造子宫三维凝胶模型，来研究胚胎干细胞在体外子宫内膜微环境中的分化发育的方法，包括(1) 将胚胎干细胞直接复合在单纯的细胞外基质凝胶中，观察胚胎干细胞自发分化发育情况；(2) 将胚胎干细胞复合在人造子宫三维凝胶的内膜片层中，观察子宫内膜微环境为胚胎干细胞分化发育的影响。
9. 权利要求8所述的方法，其中可在人造子宫三维凝胶模型中，添加不同的诱导因子，观察其对胚胎干细胞分化的影响，所述的诱导因子包括Vc、RA、activin-A、TGF和IGF。
10. —种通过权利要求5所述的人造子宫三维凝胶模型，来用于研究胚胎干细胞诱导分化与发育的用途，其中所述的用途是通过调控胚胎干细胞生长发育的微环境，进行胚胎干细胞诱导分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化(如心肌，神经，血管)的新方法。
全文摘要
本发明涉及一种用于研究胚胎干细胞发育分化的人造子宫三维凝胶模型。本发明属组织工程与再生医学研究领域，主要用来解决体外进行胚胎干细胞分化发育研究没有理想仿生模型问题。我们采用体外再造组织工程化子宫作为胚胎干细胞分化发育的研究模型。将胚胎干细胞接种表面或均匀复合在子宫片层内部，通过模拟正常胚胎在体发育环境，调控胚胎干细胞生长发育的微环境，以再造的子宫组织为主体进行胚胎干细胞的分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化新方法。这一研究成果对揭示胚胎早期发育事件具有重要的意义，并对基于胚胎干细胞的治疗具有重大的理论意义和应用价值。
文档编号A61L27/24GK101711891SQ200910000700
公开日2010年5月26日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者周瑾, 林秋霞, 段翠密, 王常勇, 郝彤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所