专利名称：从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法
技术领域：
本发明涉及用于提供灵长类动物的造血细胞、分化细胞等的技术。更具体地，本发明涉及从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法、根据该分化方法得到的造血细胞、以及生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊的制备方法。
背景技术：
对再生不良性白血病等疾病患者，进行以骨髓移植、末梢血干细胞移植、脐带血干细胞移植等为代表的造血干细胞移植，使患者体内产生血细胞，这项工作正被进行。
可是，在上述造血干细胞移植上，存在下述缺点难以稳定提供适合移植对象患者的造血干细胞；在采集造血干细胞时，有时给捐献者造成体力或肉体的损害；等等。
因而，为了谋求稳定提供造血干细胞，尝试着这样的工作经子宫移植人的造血干细胞到猪胎仔里，在猪体内使造血前体细胞扩增[中内启光等2人，“3.人血液嵌合猪的确立及其应用”，第117次日本医学会研讨会论文集，干细胞和细胞疗法-[III]组织·器官干细胞针对临床应用的基础开发(2)，2000年8月4日-6日召开，p99-106[online]，国际互连网<URLhttp://www.med.or.jp/jams/symosium/kiroku/117/pdf/117099.pdf>]。
另一方面，为了应用于以具有机能障碍的组织或脏器的机能恢复、修复、再生等为目的的再生医疗，也进行了关于胚胎干细胞(以下也叫做ES细胞)的分化体外研究。
作为从胚胎干细胞向血细胞的体外分化的尝试例，举出下述例子从导入了与造血干细胞的自再生相关的同源异型选择者基因HoxB4的小小鼠ES细胞，分化成显示最终造血干细胞的表型的细胞[Michael Kyba等，Cell，第109卷，2002年4月5日发行，p29-37]；利用OP9基质细胞，从小鼠ES细胞向推定为造血前体细胞的细胞分化[仲野彻著，“5.从胚胎干细胞向血细胞的分化”；横田崇等编，实验医学增刊“干细胞研究的最前沿和在再生医疗上的应用 发育·分化机理的解释、及面向临床”，2001年9月25日发行，第19卷、第15号、p1966-1971；仲野彻(Toru Nakano)等，Science，第265卷，1994年8月19日，p1098-1101]；在小鼠S17基质细胞上培养恒河猴ES细胞，使之分化成造血前体细胞[Fei Li等，Blood，第98卷，2001年7月15日发行，p335-342]；从小鼠ES细胞向造血前体细胞分化[BrittM.Johansson等，Molecular and Cellular Biology，第15卷、第1号，1995年1月发行，p141-151]。
另外，上述Fei Li等人的文献中公开了下述内容通过在骨形成蛋白-4(BMP-4)存在下培养恒河猴ES细胞，与BMP-4非存在下的场合比，造血前体细胞的分化增加至15倍。再有，上述BrittM.Johansson等人的文献中公开了下述内容通过在BMP-4存在下培养小鼠ES细胞，与BMP-4非存在下的场合比，造血前体细胞的分化增加。
可是，一般地，关于在发育初期出现的细胞(神经细胞、心肌细胞、胎仔造血细胞等)，与在体外的分化相比，存在的缺陷是很难从上述ES细胞分化出造血干细胞、肝细胞、胰腺β细胞等表现出发育后期“场”诱导地出现的细胞。
另外，在上述Michael Kyba等人的文献中记载的分化方法中，存在这样的缺点由于使用导入了HoxB4基因的ES细胞，因此有时所得到的造血干细胞的适用范围被限定。
进一步地，在上述仲野彻著的文献“5.从胚胎干细胞向血细胞的分化”及上述仲野彻等人的文献[Science]中记载的分化方法，其特征是使用OP9基质细胞，但实际上认为只是再现了卵黄囊血细胞生成(初级血细胞生成)，存在的缺点是难以诱导可再构建造血系统的造血干细胞的分化。
发明内容
本发明的一个方面涉及从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法，其中使下述至少1项为可能稳定地提供灵长类的造血细胞；不进行向灵长类动物的胚胎干细胞导入外来基因等的基因工程操作，而使该灵长类动物的胚胎干细胞分化成造血细胞等等。另外，本发明的另一方面涉及灵长类动物的造血细胞的制备方法，其中，使下述至少1项为可能稳定地提供灵长类的造血细胞；大量地提供灵长类的造血细胞；稳定地提供灵长类动物的输血用血小板；稳定地提供灵长类动物的移植用的CD34+细胞；等等。进而，本发明的另一方面涉及根据上述制备方法得到的造血细胞。另外，本发明的又一方面涉及能够稳定地提供灵长类的造血细胞的、嵌合羊的制备方法。
即，本发明的要旨涉及以下几方面。
一种从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊得到灵长类动物的造血细胞。
根据上述[1]所述的分化方法，其中，包括(I)将缺乏巨噬细胞集落刺激因子的基质细胞株作为饲养细胞，在该饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞的步骤；以及，(II)将在上述步骤(I)中得到的来源于灵长类动物的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止的步骤。
根据上述[2]所述的分化方法，其中，在步骤(I)中，在骨形成蛋白-4的存在下在饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞。
一种灵长类动物的造血细胞的制备方法，包括(I)将缺乏巨噬细胞集落刺激因子的基质细胞株作为饲养细胞，在该饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞的步骤；(II)将在上述步骤(I)中得到的来源于灵长类动物的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止的步骤；以及，(III)给在上述步骤(II)中出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊上分离从该灵长类动物的胚胎干细胞分化的灵长类动物的造血细胞的步骤。
一种采用上述[4]所述的制备方法得到的造血细胞。
一种生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊的制备方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，进而饲育该羔羊。
附图的简单说明
图1表示在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞而得到的细胞。(A)表示未分化胚胎干细胞，定标线条表示100μm。(B)表示在BMP-4存在下，在OP9细胞上培养时的细胞的模式。(C)表示在诱导分化成造血系统的条件下维持胚胎干细胞而得到的细胞，定标线条表示100μm。
图2是表示在移植后得到的羊胎仔内检测猴β2-小球蛋白的结果的图。图中，(A)表示胎仔肝脏，(B)表示骨髓的结果。
图3是表示给羊施用人SCF前后检测末梢血或骨髓中的猴β2-小球蛋白的结果的图。上图表示PCR的结果，下图表示Southern blothybridization的结果。图中，M表示分子量标记，泳道1-3表示阴性对照(水)，泳道4表示单一的羊DNA，泳道5-10分别表示0.0001％(细胞数)、0.001％(细胞数)、0.01％(细胞数)、0.1％(细胞数)、1％(细胞数)及10％(细胞数)、猴DNA，泳道11表示单一的猴DNA，泳道12表示没有试样，泳道13-泳道17分别表示施用人SCF前、施用第6天、施用后1天、施用后3天及施用后40天的来源于末梢血的试样、泳道18-22分别表示施用人SCF前、施用第6天、施用后1天、施用后3天及施用后40天的来源于骨髓的试样。显示出这样的事实通过施用对猴起作用但对羊不起作用的人SCF，在该羊的末梢血及骨髓血中出现了猴的细胞。
实施发明的最佳方案本发明基于下述的本发明人惊喜的发现在诱导分化成为造血细胞的条件下处理胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的羊胎仔内，据此，出生后的羊产生实质上来源于猴的造血细胞。
本发明的一个方面涉及一种从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法。
以下，在本说明书中，就使用羊的情况进行说明，但在本发明中，即使其他的非人哺乳动物(例如猪、马、猴等)也能够同样地实施。通过使用其他的非人哺乳动物，也能够以至少1％的嵌合率制备嵌合非人哺乳动物，能够制备造血细胞。
本发明的从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，再从出生的羊获得灵长类动物造血细胞的方法。
本发明的从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法，更优选地，是在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊得到灵长类动物的造血细胞。
本发明的分化方法，具有的一大特征是，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件(以下也叫做诱导造血系统分化的条件)下维持灵长类动物的胚胎干细胞。
在本发明的分化方法中，由于将灵长类动物的胚胎干细胞维持在上述诱导造血系统分化的条件下，因此尽管在原样地移植未分化胚胎干细胞时实质上未发生从该未分化胚胎干细胞向造血细胞的分化，但令人惊喜的是，根据本发明的分化方法发挥出能够使该灵长类动物的胚胎干细胞分化成为造血细胞的优异效果。
另外，在本发明的分化方法中，由于灵长类动物的胚胎干细胞维持在上述诱导造血系统分化的条件下，因此该灵长类动物的胚胎干细胞向羊胎仔移植时，发挥出能够更有效地利用该羊胎仔[严格地讲，在出生后，出生了的羔羊(以下在本说明书中也表述为“出生羔羊”)]的体内环境，来分化这一优异的效果。
进一步地，本发明的分化方法，由于将灵长类动物的胚胎干细胞分化成造血细胞，因此实质上不要求对该灵长类动物的胚胎干细胞实施导入引起分化的外来基因(例如同源异型选择者基因)的等等的基因工程操作，在此点上是有利的。因此，本发明的分化方法不需要高度的技术和高价的机械、试剂等，在移植用的细胞、组织的提供等上是有用的。
另外，本发明的分化方法，其一大特征在于使用妊娠羊子宫内的羊胎仔。
本发明的分化方法，由于使用上述羊胎仔，因此令人惊喜的是，发挥出能够使将灵长类动物的胚胎干细胞维持在上述诱导造血系统分化的条件下而得到的细胞分化成实质上来源于灵长类动物的造血细胞这一优异效果。
另外，根据本发明的分化方法，由于使用上述羊胎仔，因此能够得到与灵长类动物的嵌合率变高这一优异的效果。因此，根据本发明的分化方法，发挥出能够效率更高地在羊体内得到实质上来源于灵长类动物的造血细胞这一优异效果。
进一步地，根据本发明的分化方法，由于使用妊娠羊子宫内的羊胎仔，因此具有下述优异特征得到对于移植的细胞的免疫耐受，在出生后，能够进一步追加移植该灵长类动物的胚胎干细胞。因此，根据本发明的分化方法，能够效率更高地、稳定地的提供实质上来源于灵长类动物的造血细胞。
本发明的分化方法，也具有下述一大特征将灵长类动物的胚胎干细胞维持在上述诱导造血系统分化的条件下，将这样得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的羊胎仔。
本发明的分化方法，由于将灵长类动物的胚胎干细胞维持在上述诱导造血系统分化的条件下，将这样得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的羊胎仔，因此能够效率更高地、稳定地的提供来源于灵长类动物的造血细胞。进一步地，本发明的分化方法，由于将灵长类动物的胚胎干细胞维持在上述诱导造血系统分化的条件下，将这样得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的羊胎仔，因此发挥出下述优异效果采用对羊不起作用的灵长类的细胞因子，能够选择性地刺激所移植的灵长类动物的胚胎干细胞或实质上来源于灵长类动物的造血细胞。因此，根据本发明，能够效率更高地、稳定地的提供来源于灵长类动物的造血细胞。进一步地，在本发明的分化方法中，发挥出下述优异效果通过使用在诱导造血系统分化的条件下维持了6天-8天、优选维持了6天的细胞，令人惊喜的是，能够以高效率得到嵌合动物，还令人惊喜的是，能够实现高的嵌合率。
在本说明书中，所谓“灵长类动物”是指人、猴等。作为上述猴，例如举出恒河猴、猕猴、日本短尾猴、绒等。
在本说明书中，所谓“胚胎干细胞(以下也叫做ES细胞)”是指具有多分化能力和自复制能力的未分化细胞。
作为在本发明的分化方法中使用的灵长类动物的胚胎干细胞，具体例如举出CMK6细胞等。
这样的胚胎干细胞，例如作为饲养细胞，是小鼠胚胎成纤维细胞等的细胞，通过使用使分裂增殖停止的细胞，并在ES细胞用培养基中培养，可维持和提供。
作为上述ES细胞用培养基，是根据胚胎干细胞的种类适合于该胚胎干细胞的培养基就好。具体讲，例如，来源于猕猴的胚胎干细胞株CMK6的场合，举出作为每200ml的组成，包含DMEM/F12163ml、胎牛血清30ml(最终浓度15％)、L-谷氨酰胺2ml(最终浓度2mM)、青霉素(100U/ml)-链霉素(100μg/ml)2ml、非必需氨基酸溶液2ml、和2-巯基乙醇1ml(最终浓度0.1mM)的培养基。
上述胚胎干细胞的未分化状态的维持及增殖，根据胚胎干细胞的种类而不同，但例如可通过在白血病抑制因子(LIF)存在等的条件下培养而进行。
另外，作为用于上述胚胎干细胞的未分化状态的维持及增殖的培养条件，根据胚胎干细胞的种类而不同，但例如举出在5体积％CO2条件下在36-38℃、优选37℃下维持；等等。
为了上述胚胎干细胞的未分化状态的维持及增殖而使用的上述饲养细胞，根据细胞的种类而不同，但例如能够在D10培养基(包含10体积％胎牛血清的DMEM培养基)等中进行维持、增殖等。
上述饲养细胞的培养条件，根据细胞的种类而不同，但例如举出在5体积％CO2条件下在36-38℃、优选37℃下维持；等等。
在本说明书中，作为造血细胞，例如举出造血干细胞及从该造血干细胞分化生出的细胞群、即具有成红血细胞、髓细胞、巨核细胞、淋巴细胞等的性质的细胞，具体举出成红血细胞、髓细胞等。
在本发明中，适合于诱导分化成造血细胞的条件、即诱导造血系统分化的条件，例如举出在IV型胶原的存在下培养的条件、在α-极限必需培养基(α-MEM)等的存在下培养的条件、在适合于造血系统分化的饲养细胞上培养的条件、胚状体形成后，使之与培养皿粘着的条件等的种种条件以及它们的任一的组合的条件等。
在本发明中，“在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞而得到的细胞”，评价造血集落形成能力及造血系统的表面标记的表达的场合，是均成为阴性或弱阳性的分化阶段的细胞。这样的细胞，可以是所谓的中胚层细胞或与该中胚层细胞的状态、性质等接近的细胞。具体举出在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下将来源于猕猴的胚胎干细胞株CMK6维持约6天而得到的细胞等。
上述造血集落形成能力例如可通过后述的集落实验等来评价。
作为上述表面标记，举出CD45、TER119、α4-整联蛋白、VE-钙黏着蛋白、Sca-1、CD34、CD13、CD14、GPIIb/IIIa、CD3、CD4、CD8、sIgM、CD19、c-Kit(CD117)、Thy-1(CD90)、CD31、HLA-ABC、β2-小球蛋白等。
作为在诱导造血系统分化的条件下维持时使用的饲养细胞，举出缺乏巨噬细胞刺激因子的基质细胞株，例如举出用丝裂霉素C或X射线处理缺乏巨噬细胞刺激因子的小鼠髓细胞株、缺乏巨噬细胞刺激因子的小鼠卵黄囊细胞株等而得到的细胞等。作为上述缺乏巨噬细胞刺激因子的基质细胞株，举出OP9细胞株，作为上述小鼠髓细胞株，举出S17细胞株等[Collins等，J.Immunol.，1987年发行，第138卷，p1082-1087]，作为上述小鼠卵黄囊细胞株，举出C166细胞株[Wang等，In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.，1996年发行，第32卷，p292-299]等。
在诱导造血系统分化的条件下维持时使用的上述饲养细胞，可通过将缺乏巨噬细胞刺激因子的基质细胞株接种到例如装有α-MEM培养基(Minimum Essential medium Eagle)等的、涂了明胶的培养容器中等等来制备。饲养细胞接种到无间隙地覆盖培养容器的程度就好。
上述饲养细胞的培养条件，根据使用的细胞的种类而不同，基质细胞株OP9细胞的场合，例如举出在5％CO2条件下优选在36-38℃、特别优选在37℃下维持；等等。
在诱导造血系统分化的条件下维持时使用的饲养细胞，具体讲，将OP9细胞作为饲养细胞使用的场合，可通过下述过程得到-在OP9细胞用培养基{例如每1250ml的组成α-MEM[Gibco公司制，目录编号12000-022]980ml、胎牛血清250ml(最终浓度20％)、青霉素(100U/ml)-链霉素(100μg/ml)10ml、200mM L-谷氨酰胺溶液10ml}中、在37℃、5％CO2条件下培养；-用磷酸缓冲生理盐水将在培养液内粘着、汇合或在即将汇合之前的细胞洗涤2次；-用胰蛋白酶处理洗涤后的培养皿上的细胞；
-添加上述OP9细胞用培养基，回收含有细胞的培养基；-将所得到的细胞以1∶4～1∶5在上述OP9细胞用培养基传代培养；-在37℃、5％CO2条件下培养到达到汇合为止；-将所得到的细胞用丝裂霉素C钝化；-将所得到的细胞(例如1×105细胞/ml)接种在涂敷了明胶的培养皿上在上述OP9细胞用培养基中并培养。
本发明所使用的妊娠羊，从安全性、例如预防流产的观点出发，希望是妊娠后40天以上，优选是50天以上，更优选是60天以上，从减少免疫排斥、充分得到移植细胞的植入率的观点出发，希望是妊娠后85天以下，优选是75天以下，更优选是60天以下。因此，子宫内的胎仔希望是妊娠50-70天。
作为本发明的分化方法，更具体举出这样的方法，该方法包括(I)将缺乏巨噬细胞集落刺激因子的基质细胞株作为饲养细胞，在该饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞的步骤；以及，(II)将在上述步骤(I)中得到的来源于灵长类动物的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止的步骤。
在上述步骤(I)中，灵长类动物的胚胎干细胞，从更利于分化的观点出发，希望高密度接种。
在上述步骤(I)中，希望在饲养细胞上，在与灵长类动物的胚胎干细胞相应的培养基中培养。
培养中，培养基适宜更换即可。
另外，在上述步骤(I)中，在饲养细胞上，灵长类动物的胚胎干细胞希望在5％CO2条件下、优选在36-38℃、特别优选在37℃下维持。
具体讲，例如猕猴胚胎干细胞株CMK6的场合，举出下述条件悬浮于分化用培养基[每100ml的组成IMDM(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium)84ml、8％马血清8ml、8％胎牛血清8ml、5×10-6M氢化可的松0.18μg、BMP-42μg(最终浓度20ng/ml)、SCF 2μg(最终浓度20ng/ml)、IL-3 2μg(最终浓度20ng/ml)、IL-6 1μg(最终浓度10ng/ml)、VEGF 2μg(最终浓度20ng/ml)、G-CSF 2μg(最终浓度20ng/ml)、Flt-3配体2μg(最终浓度10ng/ml)、EPO 200U(2U/ml)]5ml中，将所得到的细胞悬浮液在饲养细胞上相对于5×105细胞，接种适当量细胞，然后，在37℃、5％CO2条件下培养6天。
通过进行上述步骤(I)而得到的细胞，相当于上述“在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞而得到的细胞”。
从以更高效率得到嵌合羊的观点、得到更高的嵌合率的观点等出发，在上述步骤(I)中，胚胎干细胞、例如猕猴胚胎干细胞株CMK6等，希望在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持6天-8天、优选6天。另外，据此能够令人惊喜地以高效率更迅速地进行从胚胎干细胞向造血细胞的分化。
在步骤(I)中，从效率更高地得到造血细胞的观点出发，优选除了上述诱导造血系统分化的条件以外，还希望在骨形成蛋白-4的存在下、在饲养细胞上、在白血病抑制因子非存在下维持灵长类动物的胚胎干细胞。
将通过进行上述步骤(I)而得到的细胞，接着移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止[步骤(II)]。
用于移植的细胞，通过用胰蛋白酶处理，并悬浮在例如0.1％BSA(牛血清白蛋白)/HBSS(hanks平衡盐水溶液)中，并且，从提高植入率、嵌合率等的观点出发，使得例如1×106细胞上优选达到1×106细胞-1×109细胞，更优选达到1×107细胞-1×109细胞，由此而能制备。
在步骤(II)中，细胞向胎仔内的移植，例如可通过向肝脏内(或者更严格地讲，肝实质内)、腹腔内、心脏内、脐带内等中穿刺注入移植用细胞等等来进行。
移植手术，例如可通过下述步骤等进行-使妊娠约第60天的妊娠羊预先在移植的1星期-10天前习惯移植时的饲育环境；-麻醉羊母体；-将羊固定成适合于施行手术的体位；-采用清洁操作，为了使移植用细胞向移植部位的移植容易进行，施用各种手术、例如向腹腔内或肝实质内移植细胞时，在下腹部正中切开、开腹后使子宫母体翻转到腹腔外。
在将细胞向子宫内胎仔移植的方法中，例如切开羊的子宫肌层，在保温的状态下向露出的卵膜内推进羊胎仔，通过透明的卵膜在正视下将移植用细胞穿刺注入到胎仔移植部位中，层层缝合腹部的子宫肌层、腹膜肌层、皮肤即可。或者，不切开子宫，就从子宫壁上在超声波引导下将移植用细胞穿刺注入到羊胎仔的移植部位中，层层缝合腹部的腹膜肌层、皮肤即可。
在步骤(II)中，施行了移植手术之后，妊娠羊在直到出生为止的期间，例如在与通常的饲育同样的条件下饲育。
在步骤(II)中得到的羊胎仔，即，严格地讲，出生羔羊，产生实质上来源于灵长类的造血细胞的情况可通过以下过程来评价从羊胎仔(即，严格地讲，出生后的出生羔羊)采集适当的组织、例如肝脏、骨髓等组织，得到原代培养用的细胞，对于得到的细胞，(1)进行造血集落实验，(2)对于在上述(1)中形成的造血集落，调查对灵长类动物特异的标记基因的表达。
上述(1)的造血集落，例如通过下述过程得到i)从羊胎仔(即，严格地讲，出生后的出生羔羊)得到肝脏的组织活体检查、骨髓等组织；ii)对于所得到的组织，进行胰蛋白酶处理、DNaseI处理、溶解处理等的与组织相应的适当的处理，得到细胞；iii)将所得到的细胞悬浮于2重量％FBS(胎牛血清)-IMDM中，得到细胞悬浮液；iv)将所得到的细胞悬浮液和甲基纤维素培养基{例如商品名MethoCult GF+[StemCell Technologies公司制，目录编号ST-04435]等}混合并搅拌；v)接着，将含有所得到的细胞的培养基注入到培养皿中，在37℃、5体积％CO2的条件下培养14天。
另外，上述(2)的对灵长类动物特异的标记基因的表达，从在造血集落实验中形成的集落，采用惯用的方法提取DNA，对于所得到的DNA，例如通过使用对对灵长类动物特异的标记基因特异的探针的杂交、使用特异的引物对的PCR等，检测该基因，由此可评价。或者，也可以通过将造血集落用针对对灵长类动物特异的抗原的抗体免疫染色来评价。
在本发明的分化方法中，可以向在上述步骤(II)中得到的羊胎仔、即更严格地讲，出生羔羊内，进一步移植在步骤(I)中得到的细胞。通过向出生羔羊进一步移植在步骤(I)中得到的细胞，能够高效率、稳定地提供灵长类的造血细胞。
另外，在本发明的分化方法中，可以给在上述步骤(II)中得到的出生羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子。通过给羔羊施用上述细胞因子，在该出生羔羊的体内，能够选择地刺激实质上来源于灵长类动物的造血细胞的增殖。
作为上述细胞因子，举出干细胞因子(SCF)、碱性成纤细胞生长因子(bFGF)、制瘤素M(OSM)、f1k2/f1k3配体、白细胞介素-1、白细胞介素-3、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、趋化因子、促红细胞生成素、血栓形成素等及它们的任一的组合。
在本发明的分化方法中，通过在适合于诱导分化成造血细胞的条件下维持6天-8天、优选6天，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，使之生育，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，由此令人惊喜地发挥出达到高的嵌合率的优异效果。
采用本发明的分化方法得到的灵长类动物的造血细胞的评价，例如可通过将CD45、TER119、α4-整联蛋白、VE-钙黏着蛋白、c-Kit、Sca-1、CD34(干细胞标记)、CD13(髓细胞标记)、CD14(髓细胞标记)、GpIIb/IIIa(巨核细胞标记)、CD3(T细胞标记)、CD4(T细胞标记)、CD8(T细胞标记)、sIgM(B细胞标记)、CD19(B细胞标记)等的表达的有无作为指标来进行。
本发明的分化方法可用于灵长类动物的造血细胞的制备。
本发明的另一方面涉及灵长类动物的造血细胞的制备方法。
本发明的灵长类动物的造血细胞的制备方法，包括(I)将缺乏巨噬细胞集落刺激因子的基质细胞株作为饲养细胞，在该饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞的步骤；(II)将在上述步骤(I)中得到的来源于灵长类动物的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止的步骤；以及，(III)给在上述步骤(II)中出生的胎仔、即更严格地讲，羔羊，施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊上分离从该灵长类动物的胚胎干细胞分化的灵长类动物的造血细胞的步骤。
本发明的制备方法，具有的一大特征是，在诱导造血系统分化的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞。因此，根据本发明的制备方法，由于在上述诱导造血系统分化的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，因此尽管在原样地移植未分化胚胎干细胞时，实质上未产生从该未分化胚胎干细胞向造血细胞的分化，但是令人惊喜的是，发挥出能够由该灵长类动物的胚胎干细胞制备造血细胞这一优异的效果。
另外，在本发明的分化方法中，灵长类动物的胚胎干细胞向羊胎仔内移植时，能够使该胚胎干细胞更有效地利用该羊胎仔(严密地讲，出生后的出生羔羊)的体内环境，因此，发挥出能够稳定地提供灵长类动物的造血细胞这一优异的效果。
另外，本发明的制备方法，还有一大特征，是使用妊娠羊子宫内的羊胎仔。
本发明的制备方法，由于使用上述羊胎仔，因此与灵长类的嵌合率变高，据此，发挥出能够从灵长类动物的胚胎干细胞大量提供灵长类动物的造血细胞这一优异效果。
另外，根据本发明的制备方法，在上述步骤(I)中，在适合于诱导分化成造血细胞的条件下维持胚胎干细胞、例如猕猴胚胎干细胞株CMK6等6天-8天、优选6天，据此令人惊喜地能够以高效率、更迅速地进行从胚胎干细胞向造血细胞的分化。
进一步地，根据本发明的制备方法，能够将灵长类动物的胚胎干细胞追加地移植到出生羔羊内，另外，利用对羊不起作用的灵长类的细胞因子，能够选择性地刺激所移植的灵长类动物的胚胎干细胞或实质上来源于灵长类动物的造血细胞，因此，能够效率更高地、稳定地的提供实质上来源于灵长类动物的造血细胞。
另外，根据本发明的制备方法，能够稳定地提供输血用血小板、移植用CD34+细胞。
本发明的制备方法中的上述步骤(I)及步骤(II)，与本发明的分化方法中的步骤(I)及步骤(II)相同。
在上述步骤(III)中，从在上述步骤(II)中出生的胎仔、即羔羊分离由该灵长类动物的胚胎干细胞分化的灵长类动物的造血细胞。
在步骤(III)中，从嵌合率的观点出发，羊胎仔、即羔羊希望是出生后1年以内的个体。
另外，在上述步骤(III)中，优选给出生的羔羊施用对灵长类动物特异的上述细胞因子等，进一步饲育该羔羊。
进一步地，与上述分化方法的场合同样，从高效率、稳定地提供灵长类动物的造血细胞的观点出发，可以进一步向在上述步骤(II)中出生的羊胎仔、即出生羔羊移植在步骤(I)中得到的细胞。
在步骤(III)中，灵长类动物的造血细胞的分离，例如可通过下述步骤等得到。
1)由如上所述得到的羊采集肝脏、骨髓、血液(末梢血、脐带血)、胸腺、脾脏等；2)采用适当的手法从所得到的器官得到细胞群；3)从所得到的细胞群分离来源于灵长类动物的造血细胞。
在上述步骤3)中，例如进行使用对灵长类动物特异的标记或针对该标记的抗体等的流式细胞计、使用免疫珠的方法等。
作为上述“对灵长类动物特异的标记”，例如如果是与灵长类交叉，与羊不交叉的标记即可，举出HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD45等。
采用本发明的制备方法得到的灵长类动物的造血细胞的评价，与上述方法同样，例如可通过将CD45、TER119、α4-整联蛋白、VE-钙黏着蛋白、c-kit、Sca-1、CD34、CD13、CD14、GpIIb/IIIa、CD3、CD4、CD8、sIgM、CD19等的表达的有无作为指标而进行。
另外，本发明的另一方面涉及采用本发明的制备方法得到的灵长类动物的造血细胞。
这样的造血细胞无特别限定，但可期待用于，例如血管新生疗法用的移植材料，在心肌梗塞等的缺血性疾病中的应用。
本发明的造血细胞，具体讲，如上述，是造血干细胞及从该造血干细胞分化生出的细胞群、即具有成红血细胞、髓细胞、巨核细胞、淋巴细胞等的性质的细胞等，具体为成红血细胞、髓细胞等。
本发明的造血细胞，是实质上来源于灵长类动物的细胞，是在制备时未导入外来基因的细胞，因此很适合于对灵长类动物的移植等。
通过将本发明的造血细胞，移植到需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态的部位，能够发挥治疗效果。因此，本发明的另一方面涉及需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病的治疗方法，其特征在于，向需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态的部位提供治疗上有效量的本发明的造血细胞。在又一方面，本发明涉及在需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病治疗上的本发明的造血细胞的用途。
作为上述需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病，无特别限定，例如再生不良性贫血、白血病、免疫缺陷症、心肌梗塞等缺血性心脏病、闭塞性动脉硬化症、骨质病等。
上述“治疗上有效量”，如果是足够进行构建造血系统、或看到造血细胞的效果的量即可，可根据需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态的程度、个体的体重、年龄、体力、构建造血系统的进行度等适宜设定。
本发明的造血细胞，例如可通过穿刺注入等向需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态的部位提供，可以根据需要实施外科手术等。
上述治疗效果，能够采用适当的方法(例如纤维内窥镜、超声波、CT、MRI的观察、血管造影法、测定血清中的对疾病特异的标记等)，以上述疾病的症状改善或上述状态的改善为指标来评价。
另外，本发明的另一方面涉及本发明的造血细胞在用于制备需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病治疗用药物中的用途。
采用与本发明的分化方法同样的操作，能够制备生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊。因此，本发明的又一方面涉及生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊的制备方法。
本发明的生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊的制备方法，其一大特征是，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，进而饲育该羔羊。通过在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持6天-8天、优选6天，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，使之生育，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，由此令人惊喜地发挥出能够以高效率得到嵌合羊的优异效果。
根据本发明的嵌合羊的制备方法，能够得到能更稳定地提供灵长类的造血细胞的嵌合羊。
由于采用本发明的嵌合羊的制备方法得到的嵌合羊，在免疫学上以耐受的状态具有实质上来源于灵长类动物的细胞，因此能够将在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持而得到的细胞进一步移植到该嵌合羊。另外，采用本发明的嵌合羊的制备方法得到的嵌合羊，通过施用灵长类动物特异的细胞因子，能够在体内选择性地刺激面向实质上来源于灵长类的造血细胞的分化。
以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不受下述实施例的限制。在以下的实施例中，“％”在没有特别阐明的情况下表示重量％。另外，CO2、O2及N2中的“％”表述表示体积％。
实施例1猴胚胎干细胞的培养(1)饲养细胞的制备将直到传代5代内的小鼠胚胎成纤维细胞BALB/cAJc1(日本CLEA公司提供)在含有最终浓度10μg/ml的丝裂霉素C的D10培养基中[组成10％FCS、DMEM]培养2-4小时，由此终止细胞的分裂增殖，使之钝化。接着，去除了含有丝裂霉素C的D10培养基。用磷酸缓冲生理盐水洗涤处理后的细胞。将洗涤后的细胞进行胰蛋白酶·EDTA处理(0.05％胰蛋白酶、1mM EDTA)，得到细胞悬浮液，接着离心分离细胞悬浮液，得到细胞。
接着，将所得到的细胞悬浮在D10培养基中，在涂敷了明胶的6cm培养皿[FALCON公司制，商品名Tissue culture dish]上接种并使得达到1×106个。培养直到与培养皿粘着为止，将所得到的细胞作为饲养细胞使用。
(2)来源于猕猴的ES细胞株CMK6的培养从上述实施例1(1)的饲养细胞的培养物去除D10培养基，用磷酸缓冲生理盐水洗涤该饲养细胞。
接着，将冷冻保存的来源于猕猴的ES细胞CMK6悬浮在ES细胞用培养基[每200ml的组成DMEM-F12(GIBCO公司制)163ml、胎牛血清30ml(最终浓度15％)、L-谷氨酰胺2ml(最终浓度2mM)、青霉素(100U/ml)-链霉素(100μg/ml)2ml、非必需氨基酸溶液(GIBCO公司制)2ml、和2-巯基乙醇1ml(最终浓度0.1mM)]5ml中。将所得到的细胞悬浮液接种到上述饲养细胞上。培养在37℃、5％CO2条件的培育箱内进行。另外，ES细胞用培养基每2天更换1次。
培养7天后，抽吸、去除旧的培养基，用磷酸缓冲生理盐水洗涤细胞。接着，向培养皿上的细胞中添加0.25％胰蛋白酶/HBSS(Hanks平衡盐水溶液)1ml，将该细胞在37℃培养3-4分钟。然后在常温下轻轻敲打培养皿底，剥离细胞的集落。
接着，使用上述ES细胞用培养基，采用5ml锥形管移液，从上述细胞的集落回收了未分化的细胞的集落。将所回收的细胞悬浮在上述ES细胞用培养基中，将所得到的细胞悬浮液5ml接种到6cm培养皿上的饲养细胞上。然后，根据集落的大小每隔2-4天传代培养1次。
将所得到的未分化ES细胞用于向羊胎仔的移植。另外，将该未分化ES细胞用于以下的造血系统分化的诱导。
实施例2猴胚胎干细胞的造血系统分化的诱导(1)饲养细胞的制备该OP9细胞是由巨噬细胞集落刺激因子的机能障碍的小鼠(C57BL/6×C3H)F2-op/op小鼠的新生小鼠颅顶制备的基质细胞株，是前成脂肪细胞株，将该OP9细胞在OP9细胞用培养基{每1250ml的组成α-MEM(Gibco公司制，目录编号12000-022)980ml、胎牛血清250ml(最终浓度20％)、青霉素(100U/ml)-链霉素(100μg/ml)10ml、200mM L-谷氨酰胺溶液10ml}中，在37℃、5％CO2条件下培养。然后，将在培养液内粘着、发育至汇合或即将汇合的细胞用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次。接着，向洗涤后的培养皿上的细胞中添加0.1％胰蛋白酶-EDTA(2ml/10cm培养皿)，在培育箱中保温5分钟。
向上述培养皿添加上述OP9细胞用培养基，将含有细胞的培养基回收到50ml锥形管中。在1500rpm下将所回收的含有细胞的培养基离心分离5分钟。在上述OP9细胞用培养基上以1∶4～1∶5(约2.5×105细胞-4×105细胞)接种所得到的细胞，在37℃、5％CO2条件下培养直到达到汇合为止。
将所得到的细胞在10cm培养皿(FALCON公司制)上在含有最终浓度10μg/ml的丝裂霉素C的上述OP9细胞用培养基10ml中培养2-4小时，由此终止细胞的分裂增殖，使之钝化。接着，去除了含有丝裂霉素C的培养基。用磷酸缓冲生理盐水洗涤处理后的细胞。将洗涤后的细胞进行胰蛋白酶·EDTA处理(0.05％胰蛋白酶、1mMEDTA)，得到细胞悬浮液，接着离心分离细胞悬浮液，得到细胞。
将所得到的细胞，在涂敷了明胶的6cm培养皿(FALCON公司制，商品名Tissue culture dish)上以1∶2(约1×105细胞/ml培养基)接种到上述OP9细胞用培养基中。将以上那样准备的细胞作为在以下的诱导造血系统分化的培养中的饲养细胞使用。
(2)诱导造血系统分化的培养在上述实施例1中，将被0.25％胰蛋白酶/HBSS 1ml回收的来源于猕猴的ES细胞株CMK6株悬浮在分化用培养基[每100ml的组成IMDM 84ml、8％马血清8ml、8％胎牛血清8ml、5×10-6M氢化可的松0.18μg、BMP-42μg(最终浓度20ng/ml)、SCF 2μg(最终浓度20ng/ml)、IL-32μg(最终浓度20ng/ml)、IL-6 1μg(最终浓度10ng/ml)、VEGF 2μg(最终浓度20ng/ml)、G-CSF 2μg(最终浓度20ng/ml)、Flt-3配体2μg(最终浓度10ng/ml)、EPO 200U(最终浓度2U/ml)]5ml中，将所得到的细胞悬浮液以1∶3接种到在上述实施例2(1)中得到的诱导造血系统分化的培养中的饲养细胞上。
然后，在37℃、5％CO2条件下培6天。培养中，适宜更换了培养基。将所得到的细胞(图1)作为诱导造血系统分化的处理细胞用于以下的移植等。
(3)移植细胞的准备从在上述实施例2(2)中得到的造血系统分化的诱导处理细胞的培养皿吸除培养基，向培养皿上添加0.25％胰蛋白酶/HBSS 1ml，在37℃、5％CO2的条件下培养了4分钟。
接着，用刮刀(商品名细胞刮棒-M、SUMILON公司制)将饲养细胞上的细胞连同饲养细胞回收到装有上述分化用培养基20ml的50ml容积的锥形管中，在800rpm下离心分离4分钟。
吸除上层清液，将细胞悬浮在装有20ml上述分化用培养基的50ml容积的锥形管中，得到细胞悬浮液。
在即将移植前将上述细胞悬浮液在800rpm下离心分离4分钟。吸除上层清液，接着，向所得到的细胞中添加20ml 0.1％BSA/HBSS，悬浮，在800rpm下离心分离4分钟，由此洗净。
然后，吸除上层清液，将细胞(1×107～1×108个)悬浮在0.1％BSA/HBSS 0.4ml中。将所得到的悬浮液装入1.5ml辅助管(assisttube)中，在冰上保存直到移植为止。
实施例3羊子宫内细胞移植使用从经营实验用羊的Japan Lamb处购买的妊娠羊。预定在妊娠约第60天移植，在移植的1星期-10天前，使羊习惯于移植时的饲育环境。另外，通过腹部超声波检查进行了胎仔的确认。
肌肉注射氯胺酮(15mg/kg体重)麻醉羊母体。使羊在手术台上仰面睡眠，固定四肢后，经由口进行气管内插管，在自然呼吸下在O2/空气/氟烷中在全身麻醉下进行了手术。
手术在清洁操作下进行。在下腹部正中切开、开腹后，使子宫翻转到腹腔内。
移植用细胞的注入部位，有二处胎仔的I)腹腔内及II)肝实质内。
细胞移植法有二种I)子宫切开法、II)超声波引导法。子宫切开法的场合，切开羊的子宫肌层，在保温的状态下向露出的卵膜内推进羊胎仔，通过透明的卵膜在正视下用23G针将移植用细胞(1×106～1×108细胞)穿刺注入到胎仔腹腔内，层层缝合了腹部的子宫肌层、腹膜肌层、皮肤。另外，超声波引导法的场合，不切开子宫，从子宫壁上在超声波引导下用25G catelan针将移植用细胞(1×107～1×108细胞)穿刺注入到羊胎仔肝实质内，层层缝合了腹部的腹膜肌层、皮肤。
手术完成之后，肌肉内注射抗生素物质(青链霉素溶胶)。接着拔管，确认了羊从麻醉中苏醒。
子宫切开法和超声波引导法的妊娠继续率分别是40％(4/10)和80％(8/10)，超声波引导法得到高的妊娠继续率。
实施例4从羊胎仔采集试样对于移植后第1个月的胎仔，在母体全身麻醉下，经剖腹切开，取出，解剖，采集含有造血组织的全身组织作为试样。
具体讲，从在左右的子宫中妊娠各2头[移植胎仔(切尾)、对照胎仔]、计4头的胎仔的母体，按以下的顺序同时进行组织的采集和处理。
在羊母体上，通过经口插管，在自然呼吸下、在O2/空气/氟烷中开始引入麻醉。15分钟后，对母体实施切开术，取出单侧子宫的胎仔2头，采集组织，并处理。移植了细胞的胎仔(移植胎仔)的体重是950g，对照胎仔的体重是1040g。
接着，在脐带与母体连接的状态下采集了脐带静脉血(脐带血试样)和脐带动脉血(末梢血试样)。在此，采血量，移植胎仔的脐带血试样为10ml，移植胎仔的末梢血试样为20ml，对照胎仔的脐带血试样为20ml，对照胎仔的末梢血试样为20ml。
切离脐带，接着用6G Atom管插管到脐带静脉中。关于脐带动脉，由于不能插管，因此将切离末端开放。
将回流液(冷Lactec 500ml)连接在脐带静脉侧的套管上，通过点滴开始回流。将脐带动脉侧作为去血流路，进行回流知道血液的流出消失为止(全部1000ml左右)。
分别对移植胎仔和对照胎仔进行剖腹，将部分肝、大腿骨作为原代培养用试样，通过清洁操作采集。另外，摘出了脏器。将摘出的脏器分放到冰上的有盖培养皿中。
以下表示出采集的组织。
内胚层组织1.肝(包括胆管、肝实质、肝动脉、门脉区)2.胰脏头部(胰管、胰实质)3.胸腺4.甲状腺5.肺(支气管、肺泡)6.小肠7.大网膜(内脏腹膜)外胚层组织8.大脑9.脊髓10.皮肤(附件；毛、汗腺、脂腺)11.尾部切断伤口(皮肤)中胚层组织
12.脂肪(结合组织)13.软骨(骨端软骨)14.骨髓15.淋巴节16.骨骼肌17.心肌18.大动脉19.脾脏20.肾脏21.生殖腺采集下述试样作为原代培养用。
22.末梢血(脐带动脉血)23.脐带血(脐带静脉血)24.骨髓(回流后)25.肝(回流后)从采集的组织切取5mm×5mm×3mm的组织标本各3个检体。其中，2个检体放入到装有4％缓冲低聚甲醛(PFA)/8％蔗糖的15ml样品瓶中，进行了固定一夜。将这样的试样作为4％PFA固定试样。
关于骨髓试样，进行了脱灰。
另外，将上述4％PFA固定试样的1个检体顺序地在50％乙醇、60％醇、70％醇、80％醇、90％乙醇中维持1-2小时，在100％乙醇中维持1-2小时，再在100％乙醇中维持1-2小时，再在100％乙醇中维持1夜，据此脱水，使之浸渍在苯中(30分钟×2次)，接着，使之浸渍在石蜡中(45分钟×2次)，从而得到4％PFA固定后石蜡包埋的切片试样。
上述4％PFA固定试样的另1个检体，设置在Cryomold 1号(Tissuetek，Miles，Elkhart，IN，USA)中包埋冻结。上述包埋冻结，通过用OCT化合物(Tissuetek)包埋、用液氮冻结来进行。将这样的试样作为固定后冻结切片用的标本。
剩余的1个检体，同样设置在Cryomold 1号中包埋冻结。上述包埋冻结，通过用OCT化合物包埋、用液氮冻结来进行。将这样的试样作为新鲜冻结切片用的标本。
从剩余的采集组织切取几个小片，在3根Cryotube中各放入1片，对每个管用液氮冻结。将这些脏器的小片作为DNA提取用或RNA提取用的标本。
另外，流产、死产或出生后死亡的场合，去除胎仔，采集末梢血(肝素采血)约20ml、骨髓[采集到肝素生理盐水(10单位/ml)中]适量、脐带血(肝素采血)约20ml、肝脏(采集到肝素生理盐水中)约10g。剖检体表、腹腔内、胸腔内及脑，确认是否形成畸胎瘤等肿瘤，但未发现肿瘤形成。在出生例中也未发现肿瘤形成。
另外，关于在出生后进行了分析的病例，从出生后开始大致以每月1次的间隔采集了末梢血和骨髓。具体讲，在出生后，在最初的几个月间每隔2星期就采集末梢血(肝素采血)约20ml，每个1个月采集适量的骨髓(采集到肝素生理盐水中)。将采集的试样放入到无菌锥形管中，在室温振荡保管，在一天以内分离有核细胞，冷冻保存。
肝脏、脐带血、骨髓、末梢血等的造血系统组织或细胞，采用溶血法分离白血球片段，作为DNA提取用或RNA提取用试样、原代培养用试样、FACS分析用试样，在-80℃或液氮中冷冻保存。
作为原代培养用试样，关于肝脏，如以下那样进行了细胞的分离。在无菌操作下采集试样，将该试样适当地细切，回收到50ml锥形管中，添加1％胰蛋白酶/EDTA/磷酸缓冲生理盐水20ml，好好地悬浮，一边在37℃振荡10分钟，一边培养。向所得到的产物中添加Dnase I溶液[将10mg Dnase I溶解于1ml 0.15M NaCl中所得到的溶液]200μl，再添加100μl的1M MgCl2，在37℃培养10分钟。然后，用70mm径尼龙网筛[FALCON公司制，商品名细胞刮棒]过滤产物，添加了与产物相同量的D10培养基。然后，在1500rpm下离心分离5分钟，吸除上层清液。通过混入红细胞沉淀为红色的场合，向该沉淀添加约10倍量以上的ACK溶血培养基，在冰上维持15-0分钟，接着，在1500rpm下在4℃离心分离5分钟。用约40ml的磷酸缓冲生理盐水洗涤沉淀2次。吸除上层清液，将所得到的沉淀以106～107细胞/小瓶悬浮在细胞库(Cell banker)中，在-80℃或液氮中冷冻保存。
另外，作为原代培养用试样，关于脐带血、末梢血及骨髓，如以下那样进行了细胞的分离。在无菌操作下采用与肝素采血同样的方法采集试样，将血液35ml放入到50ml锥形管中，在1500rpm下离心分离10分钟。吸除血浆，将沉淀分配注入5根的50ml锥形管中。接着，向各锥形管添加40ml(沉淀的约10倍量)的ACK溶血培养基，混合，在冰上培养15分钟。在1500rpm下在4℃离心分离5分钟后，吸除上层清液。再者，沉淀为红色的场合，在1500rpm下反复离心分离10分钟。接着，向沉淀添加磷酸缓冲生理盐水40ml，悬浮，将5根管汇集成1根管，在1500rpm下在4℃离心分离5分钟，由此进行了洗涤。将这样的洗涤进行2次。吸除上层清液，用细胞库悬浮沉淀，并使得达到5×106细胞/小瓶/ml，在-80℃或液氮中冷冻保存。
实施例5各组织的猴/羊嵌合体的分析由在上述实施例4中得到的试样，使用商品名QIAamp DNA MiniKit或者商品名QIAamp DNA Blood Mini Kit，按照试剂盒中附带的制造商提供的说明提取DNA。
为了分析移植了来源于猴的细胞的羊胎仔，利用针对猴β2-微球蛋白的引物对，使用外部引物对和内部引物对，以上述DNA作为模板，进行了嵌套PCR(在使用外部引物对的PCR之后，进行使用内部引物对的PCR的两阶段的PCR法)。PCR条件为使用反应液[组成H2O 30.75μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTP(各2.5mM)4μl、Ex Taq(5U/μl)0.25μl、引物(各10pM)各2.5μl、来源于试样的DNA(250ng相当量)5μl]，在95℃反应5分钟后，将在95℃反应1分钟、在58℃反应1分钟、和在72℃反应1分钟作为1循环，在使用外部引物对的扩增时，进行25个循环，在使用内部引物对的扩增时，进行30个循环，在72℃反应5分钟后，在4℃下维持。
外部引物对由CB2MG-2F5’-GTCTGGATTTCATCCATCTG-3’(序列号1)和hB2MG-5R5’-GGCTGTGACAAAGTCACATGG-3’(序列号2)组成的引物对。
内部引物对由CB2MG-2F和
hB2MG-3R5’-GGTGAATTCAGTGTAGTACAAG-3’(序列号3)组成的引物对。
另外，使用针对β-肌动蛋白的引物对由Cβ15’-CATTGTCATGGACTCTGGCGACGG-3’(序列号4)和Cβ25’-CATCTCCTGCTCGAAGTCTAGGGC-3’(序列号5)组成的引物对，用同样的反应液进行了PCR(将在95℃反应1分钟、在54℃反应1分钟、和在72℃反应2分钟作为1循环，进行30循环)。
为了定量，制备表1所示的稀释系列的试样使用。
表1
将通过PCR生成的产物供采用了2％琼脂糖凝胶(含有0.01％溴化乙锭)的电泳用。
在移植1个月后的羊胎仔的各组织中，不能检测出来源于猴的细胞，按照下述实施例6中叙述只在移植了对猴胚胎干细胞进行了诱导造血系统分化的细胞的羊的造血前体细胞中，检测出了来源于猴的细胞。因此，本方法，特别适合于从灵长类胚胎干细胞向造血细胞的分化，认为其他系统的细胞未发生分化，是在造血分化上的特异性优异的方法。
实施例6猴/羊造血嵌合体的分析用分离成原代培养用的细胞进行了造血集落实验。
将冷冻保存细胞的Crytube管在37℃的恒温槽中溶解，悬浮在装有9ml的2％FBS-IMDM的15ml锥形管中，使用得到的悬浮液的一部分计数细胞数。接着，在1300rpm下将悬浮液离心分离4分钟，用2％FBS-IMDM悬浮所得到的沉淀，并使得达到1×106细胞/ml，得到细胞悬浮液。进而，用2％FBS-IMDM稀释10倍，制备了1×105细胞/ml的细胞悬浮液。
在14ml的聚苯乙烯圆底管中装入4ml甲基纤维素培养基(商品名Methocult GF+(StemCell Technologies公司制，目录编号ST-04435))，添400μl的细胞悬浮液，关闭盖，充分振荡搅拌。然后，静置约5分钟直到泡消失为止。
接着，用带18G针的2.5ml注射器向3.5mm培养皿的中央注入含有所得到的细胞的培养基1.1ml，在培养皿底均匀地扩展。
培养在37℃、5％CO2的条件下进行。集落的计数从培养开始在第14天进行。
在这样的方法中，由于来源于猴的造血前体细胞和来源于羊的造血前体细胞具有同等的集落形成能力，因此来源于猴的集落数对于集落总数的比表示造血嵌合率。
为了鉴定来源于猴的集落，从形成集落的培养基取得集落，从各集落提取DNA，以所得到的DNA为模板，使用针对猴β2-微球蛋白的引物对，进行PCR，确认了来源于猴的集落。
作为针对猴β2-微球蛋白的引物对，以上述DNA作为模板，进行了嵌套PCR，其中外部引物对包含上述CB2MG-2F和hB2MG-5R组成的引物对、内部引物对包含上述CB2MG-2F和hB2MG-3R组成的引物对。PCR条件为使用反应液[组成H2O 30.75μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTP(各2.5mM)4μl、Ex Taq(5U/μl)0.25μl、引物(各10pM)各2.5μl、来源于试样的DNA(250ng相当量)5μl]，在95℃反应5分钟后，将在94℃反应30秒钟、在57℃反应1分钟、和在72℃反应1分钟作为1循环，使用外部引物对的扩增时及使用内部引物对的扩增时都进行25循环，在72℃反应5分钟后，在4℃下维持。关于所得到的产物，采用2％的琼脂糖凝胶通过电泳来分析。
结果，使用诱导造血系统分化猴ES细胞的场合，如图2所示，在将进行了造血系统分化诱导处理的ES细胞移植到腹腔内后1个月的个体的胎仔肝脏中，为约30％(n＝1)，在将进行了造血系统分化诱导处理的ES细胞移植到肝实质内的出生后(移植后3-6个月)的个体的骨髓中，以约1％(n＝3)的频度检测出了来源于猴的造血集落。即，通过将ES细胞进行造血系统分化诱导处理，并导入到羊胎仔内，生出的羊产生来源于猴的造血细胞。另一方面，移植了未分化的原样状态的猴胚胎干细胞的羊，在移植1个月后的肝脏中不能检测出来源于猴的造血集落形成细胞(n＝2)。因此知道，在实施例2中叙述的胚胎干细胞的造血系统分化诱导培养是制备猴/羊造血嵌合体所必需的。
实施例7细胞因子对造血嵌合率的效果的研讨用稀释溶剂[组成HBSS中，10％羊自身血清及0.1U肝素钠]5ml稀释重组型人干细胞因子[recombinant human stemcell factor(rhSCF)、1.5mg/ml、Amgen公司制批号15701F4]1000μg，将得到的稀释物用0.22μm过滤器过滤，对于在出生后的骨髓集落PCR中发现了猴/羊嵌合体的个体(n＝2)，使用带23G针的注射器1天1次向腹腔内注射18天，并使得达到60μg/kg/天。
施用对象羊No141，为生后81天(移植后156天)，在开始施用的时刻体重为约14kg。另外，施用对象羊No182，为生后12天(移植后94天)，在开始施用的时刻体重为约10kg。
在施用第6天、最终施用1天后及最终施用3天后，分别采集了末梢血及骨髓。
向各细胞中添加FACS缓冲液[组成包含5％胎牛血清、和0.05％NaN3的磷酸缓冲生理盐水]3ml，悬浮，使得到的悬浮物通过70μm网筛。在1500rpm(490×g)下将得到的产物离心分离4分钟，吸除了上层清液。然后，向得到的沉淀添加上述FACS缓冲液450μl。
向96孔板分配注入所得到的溶液各150μl。上述溶液之中，将在150μl中添加上述FACS缓冲液350μl而得到的试样作为抗体阴性对照使用。
接着，96孔板的孔中的溶液在1800rpm(710×g)下离心分离2分钟，去除了上层清液。
然后，向孔中添加了商品名PE-Anti-human CD45(BectonDickinson公司制，BD目录号557059)20μl和上述FACS缓冲液80μl。再有，代替上述PE-Anti-human CD45，作为同型对照，使用商品名PE-Anti-mouse IgG1κ(Becton Dickinson公司制，目录号33815X)。将所得到的混合物在冰上孵育30分钟后，在1800rpm(710×g)下离心分离2分钟，去除了上层清液。然后，将得到的沉淀用上述FACS缓冲液150μl洗涤2次。
将得到的沉淀在上述FACS缓冲液350μl中悬浮，将得到的试样供流式细胞计用。
其结果未发现CD45+细胞。
接着，与实施例4的记载同样，采用溶血法从末梢血和骨髓分离白血球组分。使用商品名QIAamp DNA Mini Kit或者商品名QIAamp DNA Blood Mini Kit，按照试剂盒中附带的制造商的说明，从得到的试样提取DNA。接着，以上述DNA作为模板，用针对猴β2-微球蛋白的引物对，将上述CB2MG-2F和hB2MG-5R作为外部引物对使用，将上述CB2MG-2F和hB2MG-3R作为内部引物对使用，进行了嵌套PCR。PCR条件为使用反应液[组成H2O 30.75μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTP(各2.5mM)4μl、Ex Taq(5U/μl)0.25μl、引物(各10pM)各2.5μl、来源于试样的DNA(250ng相当量)5μl]，在95℃反应5分钟后，将在95℃反应1分钟、在58℃反应1分钟、和在72℃反应1分钟作为1循环，在使用外部引物对的扩增时，进行25循环，在使用内部引物对的扩增时，进行25循环，在72℃反应5分钟后，在4℃下维持。将通过PCR生成的产物用2％琼脂糖凝胶(含有0.01％溴化乙锭)的电泳，并进行了观察。图3的上图表示出结果。接着，将凝胶上的DNA复制到PVDF膜(AmershamPharmacia公司制)上。对得到的膜，使用通过采用具有序列号3所示的碱性序列或序列号4所示的碱性序列的引物的PCR制备的猴β2-微球蛋白的探针，进行了Southern印迹杂交。图3的下图表示出结果。
作为对照，250ng相当量的各个下述DNA，在与检体试样同样的条件下同时进行PCR，对其产物进行电泳。
只有羊DNA(图3中，泳道4)0.0001％猴DNA和99.9909％羊DNA的混合物(图3中，泳道5)0.001％猴DNA和99.999％羊DNA的混合物(图3中，泳道6)0.01％猴DNA和99.99％羊DNA的混合物(图3中，泳道7)0.1％猴DNA和99.9％羊DNA的混合物(图3中，泳道8)1％猴DNA和99.9％羊DNA的混合物(图3中，泳道9)10％猴DNA和90％羊DNA的混合物(图3中，泳道10)，以及单一的猴DNA(图3中，泳道11)其结果，如图3所示在施用SCF第6天的末梢血、施用它之后1天、3天、40天的骨髓中，猴细胞以约0.01％的比例出现。
再有，分别由末梢血和骨髓，采用与上述实施例4同样的手法制备了原代培养用试样。将所得到的原代培养用试样在甲基纤维素培养基[MethoCult GF+(Stem Cell Technologies公司制)]中培养了14天。
取出所得到的集落，从各集落提取了DNA。以所得到的DNA为模板，使用与上述同样的针对猴β2-微球蛋白的引物对，进行了PCR。表2表示出结果。
表2
表2(续)
其结果，如表2所示知道，与施用人的干细胞因子前相比，嵌合率至少上升至3-4倍。
序列表序列号1是引物CB2MG-2F的序列。
序列号2是引物hB2MG-5R的序列。
序列号3是引物hB2MG-3R的序列。
序列号4是引物Cβ1的序列。
序列号5是引物Cβ2的序列。
产业实用性根据本发明，能够大量提供为治疗需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态而可使用的细胞，可期待开发用作治疗需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态的手段。
序列表<110>TANABE SEIYAKU CO.，LTD.
<120>从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法<130>04-054-PCTJP<150>JP 2003-208724<151>2003-08-25<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物CB2MG-2F的序列<400>1gtctggattt catccatctg20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物hB2MG-5R的序列<400>2ggctgtgaca aagtcacatg g 21<210>3<211>22<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>a sequence of a primer hB2MG-3R<400>3ggtgaattca gtgtagtaca ag 22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物C beta1的序列<400>4cattgtcatg gactctggcg acgg 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物C beta2的序列<400>5catctcctgc tcgaagtcta gggc 2权利要求
1.一种从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞分化的方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊得到灵长类动物的造血细胞。
2.根据权利要求1所述的分化方法，其中，包括(I)将缺乏巨噬细胞集落刺激因子的基质细胞株作为饲养细胞，在该饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞的步骤；以及，(II)将在上述步骤(I)中得到的来源于灵长类动物的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止的步骤。
3.根据权利要求2所述的分化方法，其中，在步骤(I)中，在骨形成蛋白-4的存在下，在饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞。
4.一种灵长类动物的造血细胞的制备方法，包括(I)将缺乏巨噬细胞集落刺激因子的基质细胞株作为饲养细胞，在该饲养细胞上维持灵长类动物的胚胎干细胞的步骤；(II)将在上述步骤(I)中得到的来源于灵长类动物的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔直到出生为止的步骤；以及，(III)给在上述步骤(II)中出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊上分离从该灵长类动物的胚胎干细胞分化的灵长类动物的造血细胞的步骤。
5.一种采用权利要求4所述的制备方法得到的造血细胞。
6.一种生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊的制备方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，进而饲育该羔羊。
全文摘要
本发明提供一种从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞的分化方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内，饲育该胎仔，给出生的羔羊施用灵长类动物特异的细胞因子，从进一步饲育该羔羊所得到的羊得到灵长类动物的造血细胞；一种灵长类动物的造血细胞的制法；一种采用该制法得到的造血细胞；以及，一种生产灵长类动物的造血细胞的嵌合羊的制备方法，其特征在于，在适合于诱导分化成为造血细胞的条件下维持灵长类动物的胚胎干细胞，将所得到的细胞移植到妊娠羊子宫内的胎仔内。根据本发明，能够开发用于治疗需要构建造血系统或造血细胞的作用的疾病或状态的手段。
文档编号A61K35/14GK1842590SQ200480024700
公开日2006年10月4日 申请日期2004年8月24日 优先权日2003年8月25日
发明者花园丰, 佐佐木京子 申请人:田边制药株式会社