一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体设及一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分 化的方法。
【背景技术】
[0002] 当今胚胎干细胞化SC)向肝脏方向分化研究中，分化研究水平仍多限于单细胞状 态，即仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞(BEC)等肝系细胞，缺点包括单一的细胞类型和不 能进一步形成肝脏组织结构。现有技术也曾成功诱导胚胎干细胞向肝细胞和胆管上皮细胞 分化，但分化细胞仍呈单细胞状态而很难形成肝组织。有学者研究改善胚胎干细胞分化的 肝细胞状态，如通过聚氨醋支架等Ξ维培养使分化肝细胞形成聚合体，但仅能改善其物理 性态，不能形成包含肝细胞、胆管上皮细胞、血管结构等间质成分的真正意义上的肝脏组 织。
[0003] 作为功能复杂的器官组织，肝脏不仅需要肝细胞的合成代谢及解毒等功能，还需 要胆管上皮的运输功能，W及其他间质细胞的细胞因子分泌和免疫调节等功能。如要在治 疗中达到较全面的肝功能替代效果，仅靠获得数量和功能满意的单一的肝细胞是远远不够 的，需要分化为由肝细胞、胆管上皮细胞、间质细胞、血管成分等组成的肝脏组织结构。
[0004] 研究人员发现胚胎干细胞在体外向肝系细胞分化过程中，由单个胚胎干细胞首先 分化发育为包含Ξ胚层结构的拟胚体(emb巧onic body,邸），再进而由拟胚体分化为包含 肝系细胞的细胞群落。期间，拟胚体向细胞群落分化过程中，细胞间黏附力较体内胚胎发育 时明显下降，从而很容易失去拟胚体的Ξ维组织结构状态而逐渐变为单层的细胞分化群 落，即只能分化为单层的肝细胞或胆管上皮细胞，而不能形成肝脏组织。同时，拟胚体在体 外分化过程中，的细胞上皮间质转化(邱ithelial mesenchymal transition,EMT)速度（水 平)过快(过高），使得肝系细胞分化时程与肝脏间质成分如血管结构等分化时程脱节，因此 在分化得到的肝细胞中间也缺乏血管间质成分，也就不能形成真正意义上的肝脏组织结 构。
[0005] 上皮型巧粘蛋白化口;[1:11611日1-。日化61'；[]1,6-。日化61'；[]1)是介导肝脏组织中细胞间 黏附的主要黏附分子，通过介导肝细胞黏附而调控肝脏组织发育信号传导。分泌型卷曲相 关蛋白-1( secreted frizzled-related proteins ,sFRP-l)可通过下调Wnt/0-catenin信 号而降低细胞培养中的EMT水平，减缓肝实质细胞和血管等肝脏间质细胞的分化时程，是二 者分化达到同步，有利于分化出各种肝脏组织成分。
[0006] 目前没有相关研究通过增强细胞黏附力和减缓细胞分化中EMT速度实现胚胎干细 胞分化为真正意义上的肝脏组织结构。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种胚胎干细胞向 肝脏组织结构诱导分化的方法。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] -种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法，包含如下步骤；
[0010] (1)将E-ca化erin基因作为外源基因转染胚胎干细胞，得到高效表达E-ca化erin 基因的胚胎干细胞化-ca化erin-ESC);
[0011] (2)将步骤（1)得到的高效表达E-ca化erin基因的胚胎干细胞进行培养分化，得到 包含Ξ胚层结构的拟胚体化B);
[0012 ] (3)将步骤(2)得到的包含Ξ胚层结构的拟胚体移植至含有EM巧审制剂的细胞培养 系统中进行诱导培养，得到Ξ维生长的肝脏组织结构；
[0013] 步骤(1)中所述的胚胎干细胞优选为BALB/c系小鼠胚胎干细胞；
[0014] 步骤(1)中所述的转染的方法，优选包含如下操作：
[0015] 将E-ca化erin-cDNA全序列和真核细胞表达载体连接，得到含有E-ca化erin-cDNA 全序列和CAG启动子的重组载体，然后将重组载体转染胚胎干细胞并筛选阳性克隆胚胎干 细胞，得到高效表达E-ca化er in基因的胚胎干细胞；
[0016] 所述的真核细胞表达载体优选为pCAG-MCS载体；
[0017] 所述的转染的方式优选为脂质体介导法；
[0018] 步骤(2)中所述的培养分化的培养基优选由基础培养基和添加物组成；
[0019] 所述的基础培养基优选为DMM培养基;所述的添加物包含如下组分:体积分数为 20 %的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-琉基乙醇、终浓度为25mM的肥阳S、终浓度为lOOU/mL的 青霉素和终浓度为10化g/mL的链霉素；
[0020] 步骤(2)中所述的培养分化的时间优选为6天；
[0021 ]步骤(3)中所述的细胞培养系统优选为半开放胶原支架颗粒Ξ维培养系统；
[0022] 所述的半开放胶原支架颗粒Ξ维培养系统通过如下方法制备得到：
[0023] 对胶原支架颗粒进行切割，使其形成裂隙；得到半开放胶原支架颗粒Ξ维培养系 统；
[0024] 所述的裂隙的宽度优选为1mm;
[0025] 所述的胶原支架颗粒优选为来源于母牛皮肤胶原的胶原支架颗粒，每个支架颗粒 大小为3 X 3 X 2mm，颗粒内部孔径为400μπι;
[0026] 所述的半开放胶原支架颗粒Ξ维培养系统使用前，优选先在培养基中将胶原支架 颗粒离屯、使其沉淀，然后37°C静置12~2地；
[0027] 步骤(3)中所述的拟胚体优选位于上述胶原支架颗粒切割后形成的裂隙中；
[0028] 步骤(3)中所述的诱导培养的培养基优选由基础培养基和添加物组成；
[0029] 所述的基础培养基优选为DMM培养基;所述的添加物包含如下组分:体积分数为 20 %的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-琉基乙醇、终浓度为25mM的肥阳S、终浓度为lOOU/mL的 青霉素和终浓度为10化g/mL的链霉素；
[0030] 步骤(3)中所述的诱导培养过程中添加肝性生长因子；
[0031] 所述的肝性生长因子为EGF、TGF、HGF、0SM、地塞米松、膜岛素和转铁蛋白中的至少 一种；
[0032] 所述的肝性生长因子加入时间和用量优选为：
[0033] 胚胎干细胞分化第7天~19天(本发明中的分化天数是从胚胎干细胞首次分化开 始计），加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF;
[0034] 胚胎干细胞分化第7天~10天，加入终浓度为20ng/mL的服F;
[0035] 胚胎干细胞分化第11~19天，加入终浓度为40ng/mL的服F;
[0036] 胚胎干细胞分化第15~19天，加入终浓度为lOng/mL的0SM，终浓度为10-7Μ的地塞 米松、终浓度为化g/mL的膜岛素、终浓度为化g/mL的转铁蛋白；
[0037] 步骤(3)中所述的EM巧Φ制剂优选为EM巧Φ制剂sFRP-1;
[0038] 步骤(3)中所述的EM巧审制剂在细胞培养系统中的终浓度优选为0.化g/mL
[0039] 进一步优选的，胚胎干细胞分化第7~19天（即拟胚体转入胶原颗粒Ξ维培养系统 中开始），加入0.5yg/mL的sFRP-1;
[0040] 步骤(2)和(3)中所述的培养条件优选为:在5%C02培养箱中37°C条件下培养；
[0041 ] -种肝脏组织结构，通过上述方法制备得到；
[0042] 所述的肝脏组织结构在探索和验证肝脏组织发育相关机制中的应用；
[0043] 本发明的原理：
[0044] 胚胎干细胞向肝细胞分化中，早期首先悬浮发育为包含Ξ胚层结构的拟胚体，然 后贴壁生长并在细胞因子诱导下向肝细胞分化。随着分化进行，细胞逐渐从拟胚体结构分 离并呈分散生长，最后变为单层细胞群落并失去拟胚体的=维组织结构，运是胚胎干细胞 体外无法分化为肝脏组织的主要原因。研究发现，拟胚体分化后期，上皮间质转化化MT)水 平较体内明显升高，表现为E-ca化erin表达和细胞黏附力(AF)较体内肝脏组织明显下降， 间质细胞骨架蛋白Vimentin明显上调等。形态学上也体现了 EMT加快的特点，细胞由圆形变 为多角形、狭长形，细胞黏附连接消失，由克隆生长变为分散生长。同时，拟胚体在体外分化 过程中，细胞上皮间质转化(EMT)速度(水平)过快(过高），使得肝系细胞分化时程与肝脏间 质成分如血管结构等分化时程脱节，因此在分化得到的肝细胞中间缺乏血管间质成分，也 就不能形成真正意义上的肝脏组织结构。