专利名称：淫羊藿苷在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明属药理学领域，涉及一种中药单体化合物的用途，具体的涉及淫羊藿苷在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途，可用于干细胞移植心肌再生或细胞心肌重建术中的促细胞分化剂。
淫羊藿苷(Epimedium Icariine，EI)是从淫羊藿中分离提纯的天然产物，为一单体化合物，是淫羊藿的有效成分。化学结构式为 R1＝-GlcR2＝-Rha其提取过程大致为取淫羊藿药材，粉碎→乙醇提取→得到浸膏提取物→最佳条件萃取→取得较高纯度的淫羊藿苷。
淫羊藿苷具有多种药理活性，对血液系统、免疫系统、骨髓系统均有一定的药理作用1.淫羊藿苷具有抑制急性早幼粒白血病细胞端粒酶活性的作用。
2.淫羊藿甙具有抗肿瘤作用，已有实验证实其对HL-60细胞具有明显的增殖和分化诱导作用，能诱导肿瘤细胞凋亡。
3.淫羊藿苷能调节成骨细胞内ALP活性，促进成骨细胞增殖，增强成骨细胞活性。
4.淫羊藿甙具有免疫激活效应。通过恢复LAK细胞IL-2Rα表达，提高CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平及促进CD3AK增殖，逆转TGFβ2对LAK、CD3AK的免疫抑制作用。
5.淫羊藿苷能促进神经细胞的生长。
6.淫羊藿苷能抗缺氧再灌注从而改善肝脏功能。
7.淫羊藿苷通过抑制血管平滑肌细胞外钙离子内流达到扩血管作用。
但目前尚未见有淫羊藿苷用于诱导胚胎干细胞定向分化的报道。
本发明的另一个目的是利用淫羊藿苷能诱导胚胎干细胞体外定向分化获得的单一类型细胞，可用于干细胞移植心肌再生或细胞心肌重建术中的促细胞分化剂。
本发明的又一个目的是利用淫羊藿苷能诱导胚胎干细胞体外定向分化获得的单一类型细胞，也可用于构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。
本发明在细胞层面上对淫羊藿苷的药效进行了严格论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有以下优点1.本发明开拓了淫羊藿苷的新用途，即诱导胚胎干细胞定向分化为多种单一类型细胞(心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等)。
2.羊藿苷可用作干细胞移植心肌再生(myocardial regeneration)或细胞心肌重建术(cellular cardiomyoplasty)中的促细胞分化剂。干细胞移植心肌再生目前正处于实验研究阶段(含临床实验研究)，预计促细胞分化剂淫羊藿苷的介入将有助于该领域的研究。
3.本发明一方面明确了具备药理活性的成分淫羊藿苷，为中药防治作用提供物质基础，另一方面药效机制的阐明为中药现代化开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。
具体实例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1淫羊藿苷诱导胚胎干细胞(ES细胞)体外定向分化为心肌细胞的研究1.ES细胞的支持培养ES细胞D3细胞株(ES-D3细胞)在条件培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)中，按2×107-5×107个/ml的密度接种于滋养层细胞(小鼠成纤维细胞或STO细胞株)上，按常规方法进行传代培养。
2.淫羊藿苷诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的培养①ES-D3细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，按20-30μL接种于培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入10ml D-Hanks液，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中悬滴培养2天。此后将悬滴转入盛有10ml ES细胞分化培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)的培养皿中，进行ES细胞集落悬浮培养3天，形成ES细胞拟胚体。
②附着ES细胞的分化培养在显微镜下用吸管将拟胚体转移到24孔板内，孵育4-5小时，使其吸附后，每孔中缓慢加入1ml ES分化培养基，加入中药单体淫羊藿苷与ES细胞拟胚体共孵育。此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉心肌细胞开始跳动的最初时间。
实施例2淫羊藿苷定向分化为心肌细胞在药效评价方面的用途由实施例1获得的拟胚体细胞团，若能有节律性地搏动，则以此作为定向分化成心肌细胞的指标，作出药物淫羊藿苷对ES-D3细胞诱导分化的时效关系曲线和量效关系曲线(参见
图1)，以此作为药效评价的指标。也可以用于药物开发和中药活性成分的筛选。参见图1，淫羊藿苷诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的作用很明显，且具有很好的量效关系，其与ES-D3细胞共培养5-7天时，就有90％以上的细胞克隆出现节律性搏动，并有心脏胚芽纤维蛋白表达上调。图1中，淫羊藿苷终浓度分别为-▲-0，-■-10-8，-◆-10-7mol·L-1。*P＜0.05，**P＜0.01***P＜0.001vs 0mol·L-1，每个浓度n＝400拟胚体，相同实验重复做了6次。
利用胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)定向分化为心肌细胞的药效筛选模型论证了淫羊藿苷对ES细胞定向分化为心肌细胞这一过程具有显著的诱导作用。实验中以ES细胞作为实验测试载体，用培养基(含DMEM和胎牛血清)将ES细胞制成单细胞悬液，再悬滴培养形成拟胚体，拟胚体再进行贴壁培养；此时加入淫羊藿苷共培养(并用国际公认的诱导分化剂维甲酸A作为阳性对照药，以未加药组作为阴性对照组)，以拟胚体细胞团出现有节律性地搏动为定向分化成心肌细胞成功的指标。根据淫羊藿苷诱导拟胚体细胞团出现节律性地搏动，及该药物诱导分化的时效关系和量效关系进行统计学分析，以此作为药效评价指标。结果显示淫羊藿苷可使ES细胞分化时间显著提前(P＜0.05)，分化为心肌细胞率显著提高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)(附图1)。而且，实验中淫羊藿苷组诱导的心肌细胞与对照组比较其跳动频率和强度都有增加。淫羊藿苷对ES细胞分化为心肌细胞这一过程具有显著的诱导分化作用，药物淫羊藿苷有望成为一种以心脏为作用靶点的新型诱导分化剂。由于在淫羊藿苷诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的过程中富含发育依赖性生物信息，能提供很多的靶点供药效评价用，因此可将心肌发育依赖性特殊基因表达、心肌结构蛋白表达和离子通道形成等能够反映心肌细胞功能的指标，借助膜片钳、PCR、免疫组化等技术对淫羊藿苷的药效进行深入评价，以论证淫羊藿苷对心肌细胞生长和功能改善的促进作用。
实施例3淫羊藿苷定向分化为心肌细胞在其他方面的用途利用淫羊藿苷诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞，若能将其成功引入衰竭的心脏并与宿主细胞一起工作，则这条途径能够成为移植治疗心功能不全的重要组织细胞来源；用这种方法可以培育大量心肌细胞克隆，提供组织工程学等其他方面研究。
实施例4淫羊藿苷诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究淫羊藿苷对胚胎干细胞具有很强的诱导作用，并且对神经细胞有滋养保护作用。可选择贴壁培养的方法，用淫羊藿苷诱导胚胎干细胞分化为神经细胞。
1.ES细胞的支持培养ES细胞D3细胞株(ES-D3细胞)在条件培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)中，按2×107-5×107个/ml的密度接种于滋养层细胞(小鼠成纤维细胞或STO细胞株)上，按常规方法进行传代培养。
2.淫羊藿苷诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞取处于对数生长期的ES-D3细胞，以0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化传代，按5×105细胞/ml接种于铺过琼脂的细菌培养皿中悬浮培养，培养液改为含15％胎牛血清、无巯基丙醇和LIF的DMEM培养液。2d后换液继续培养两天形成EB，到第5天，将EB打散，接种于粘附性组织培养瓶中培养，此时加入合适浓度淫羊藿苷(10-8-10-6mol/L)的培养液与ES-D3细胞共孵育，每2d换液1次，诱导其分化为神经细胞。
现已知的许多神经系统疾病如帕金森氏病是由于神经细胞死亡而成熟神经细胞无法分裂加以补充所引起的。如在淫羊藿苷作用下将胚胎干细胞诱导成为神经细胞，再将这些细胞移植入脑中，可以用于神经退行性疾病如帕金森氏以及其他中枢神经系统的细胞治疗研究；也可以用于以神经细胞为作用靶点的药物筛选和毒性评价，构建可靠的生物信息量大的药效评价模型。
实施例5淫羊藿苷诱导胚胎干细胞定向分化为其他种类细胞的研究将淫羊藿苷以合适的浓度与胚胎干细胞共孵育，采用不同的培养方法可以将胚胎干细胞定向分化为其他类型细胞，如胰岛细胞、血管内皮细胞等，均可用于构建药物筛选模型和移植性治疗研究。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的部分参考文献1、H.-R.Liang，P.Vuorela，H.Vuorela，R.Hiltunen Isolation and ImmunomodulatoryEffect of Flaconol Glycosides from Epimedium hunanense Planta Medica63(1997)316-319.2、Joseph MM，Linda CS，Elizabeth MR，et al.Embryonic stem cell cardiogenesisapplication for cardiovascular research.TCM，1997，7(2)63-68.3、Mi-Kyeong Lee，Young-Joo Choi，Sang-Hyun Sung et al.AntihepatotoxicActivity of Icariin，a Major Constituent of Epimedium Koreanum PlantaMed.61(1995)523-526.4、都同功，陈系古，刘兰英，等.小鼠胚胎干细胞的培养.中国实验动物学报，1999，7(1)1-4.5、娟娟，杜冠华.药物筛选模型研究进展.基础医学与临床，2001，21(4)302-304.6、郭晓霞，贺福初.胚胎干细胞的研究与利用.科学通报，2000，45(5)467-474.7、杜忠伟，丛笑倩.胚胎干细胞体外分化的研究进展.细胞生物学杂志，1998，20(3)102-106.8、薛庆善主编.《体外培养的原理与技术》.科学出版社.9、沈干，丛笑倩，刘晓音，汪铮，曹宜林.胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究.国外医学生物医学工程分册，2002，25(4)150-156.10、葛坚，郭彦，王智崇，刘海泉等，体外诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的初步研究，解剖学报，2001，32(4)301-305.11、Minpei Kuroda，Yoshihiro Mimaki，Yutaka Sashida，Emiko Umegaki etal.Flavonol Glycosides from Epimedium sagittatum and Their Neurite OutgrowthActivity on PC12h Cells.Planta Med，2000，66575-577.
权利要求
1.一种淫羊藿苷在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途，其特征是用单体淫羊藿苷诱导胚胎干细胞在体外定向分化为多种单一类型细胞，该单一类型细胞可作为促细胞分化剂，也可用于构建高效率药效筛选模型。
2.根据权利要求1所述的淫羊藿苷在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途，其特征是淫羊藿苷能诱导胚胎干细胞体外定向分化为多种单一类型细胞，包括心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等。
3.根据权利要求1和2所述的淫羊藿苷在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途，其特征是作为促细胞分化剂，是用于干细胞移植心肌再生或细胞心肌重建术中。
4.根据权利要求1和2所述的淫羊藿苷在诱导胚胎干细胞体外定向分化方面的用途，其特征是利用构建的高效率药效筛选模型，可进行药物药效初步筛选与评价。
全文摘要
本发明提供一种淫羊藿苷的新用途，是由淫羊藿苷诱导胚胎干细胞体外定向分化为单一类型细胞，可用于干细胞移植心肌再生或细胞心肌重建术中的促细胞分化剂；也可用于构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。本发明在细胞层面上对淫羊藿苷的药效进行了严格论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨。本发明一方面明确了具备药理活性的成分淫羊藿苷，为中药防治作用提供物质基础，另一方面药效机制的阐明为中药现代化开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。
文档编号A61L27/00GK1425763SQ0216036
公开日2003年6月25日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者楼宜嘉, 王志强, 王丹雁 申请人:浙江大学