一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞工程领域，尤其是设及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血 管内皮样细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 血管的发生和发育对胚胎形成各器官的发育分化，对成体的创伤修复和生殖功 能具有重要意义。血管内皮样细胞是形成屯、血管封闭管道系统的形态基础。体外多种细 胞可经诱导分化产生出内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs)/内皮细胞 (endothelial cells, ECs)，由骨髓来源的单个核细胞、血液来源的祖细胞、间充质干细胞 定向诱导分化而成的内皮祖细胞等都已显示出广泛的治疗前景。但是运些细胞用于替代治 疗依然存在缺陷，如单个核细胞和间充质干细胞存在分化效率低、移植的长期效果不显著 等问题，血液来源的EPCs分化能力有限，起始细胞的数量受限，难W满足治疗的需要量等。
[0003] 人类胚胎干细胞和诱导性多能性干细胞均具备自我更新和无限增殖的潜能，其 向ECs分化的可能性为屯、血管疾病和四肢缺血的治疗提供了新途径。目前普遍采用与小 鼠的基质细胞共培养、诱导形成拟胚体并添加（VEGF)-A、BMP-4、8化-cAMP、（VEGF)-C及 Angiopoietin-1等细胞因子或化学分子或与特殊的二维介质共培养等营造内皮发育微环 境进行诱导分化，整个过程需要在不同阶段更换不同的培养基并加入相应作用的细胞因 子，诱导周期一般为15天左右，然后需要进一步利用内皮细胞表面标记CD31、KDR、vWF等进 行分离纯化。
[0004] 目前已有多个研究小组从人类胚胎干细胞OiESCs)或人类诱导性多能干细胞 化iPSCs)中分化、分离到了 EPCs/ECs。研究结果显示，hESCs来源的ECs能形成新的血管， 提高梗死屯、脏的功能，是细胞替代治疗中新的细胞来源。美国魏尔康奈尔医学院利用人体 胚胎干细胞诱导分化内皮细胞，把胚胎干细胞暴露在转化生长因子-P (TGF-beta)的环境 中时，内皮细胞繁殖速度显著增强。当把培育的内皮细胞置入老鼠体内时，细胞可W正常工 作，并迅速被老鼠的循环系统所同化，和正常血管细胞一起工作。此外，现有研究还发现可 W利用羊膜穿刺术（amniocentesis)取得的诊断性的产前羊水细胞，对其重编程为数量充 足和稳定的内皮细胞，而且所产生的内皮细胞能够再生受损的血管和修复受损的器官。美 国威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员首次将干细胞转化成具有血脑屏障特性的内皮细 胞，制成了可保护大脑的屏障模块。研究人员表示，此前科学家从未借助干细胞生产出特定 的血脑屏障内皮细胞，而其是采用了胚胎干细胞和诱导多能干细胞两种干细胞来形成血脑 屏障的内皮细胞。
[0005] 由于W hESCs或hiPSCs为起始进行诱导分化的方式不同，导致诱导分化的效率存 在差异。例如，利用邸S添加内皮相关诱导因子进行诱导分化，可能会因为培养的邸S大小 不同，致使诱导分化效率不一；与基质细胞共培养又会带来不同种属之间的交叉污染等。
【发明内容】
[0006] 基于此，有必要提供一种能够消除基质细胞污染，并可缩短诱导周期、提高分化效 率的诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法。
[0007] 一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法，包括如下步骤：
[0008] 步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；
[0009] 步骤S2,将化II相关基因转入所述诱导性多能干细胞中，筛选阳性克隆得到 FLIl-iPSC细胞系，其中所述化II相关基因表达的蛋白质氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列的相似度不低于80% ;
[0010] 步骤S3,将所述化Il-iPSC细胞系置于无饲养层细胞的培养容器中进行培养，使 细胞克隆增殖长大；
[0011] 步骤S4,启动所述化II相关基因的过表达，并加入蛋白激酶C的诱导剂，将所述 FLIl-iPSC细胞定向诱导分化成血管内皮样细胞。
[0012] 在其中一个实施例中，所述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA 导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多 能干细胞。
[0013] 在其中一个实施例中，所述诱导因子包括0CT4、S0X2、NAN0G及Lin28。
[0014] 在其中一个实施例中，所述步骤S2中，是利用诱导表达调控系统将所述化II相关 基因转入所述诱导性多能干细胞中。
[0015] 在其中一个实施例中，所述诱导表达调控系统为四环素诱导表达调控系统、光诱 导表达调控系统或甲氧节氨喀晚诱导表达调控系统。
[0016] 在其中一个实施例中，所述步骤S2中，所述筛选阳性克隆是使用所述表达调控系 统中相应的真核细胞筛选因子进行筛选，并在筛选后挑选单克隆构建得到所述化Il-iPSC 细胞系。
[0017] 在其中一个实施例中，所述真核细胞筛选因子为遗传霉素G418。
[0018] 在其中一个实施例中，所述遗传霉素G418的浓度为50~1000 y g/mL。
[0019] 在其中一个实施例中，所述步骤S3中，是将所述化11-iPSC细胞系接种在铺设有 基质胶的培养皿中，使用mTeSR培养基培养使细胞克隆增殖长大。
[0020] 在其中一个实施例中，所述步骤S4中，是使用向培养容器中加入强力霉素D0X启 动化II相关基因的过表达。
[0021] 在其中一个实施例中，所述强力霉素D0X的浓度为0. 1~4 y g/mL。
[0022] 在其中一个实施例中，所述蛋白激酶C的诱导剂包括但不限于丙二醇甲酸醋酸 醋。
[0023] 在其中一个实施例中，所述丙二醇甲酸醋酸醋的浓度为0. 1~10 yM。 W24] 上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法采用无 feeder (饲养层细胞）的培养体系，仅通过过表达化II相关基因和激活蛋白激酶C(PKC)通 路就能获得血管内皮样细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向 诱导分化为血管内皮样细胞的方法，诱导周期短、效率高，且得到的血管内皮样细胞性能稳 定，不存在基质细胞污染的问题。
【附图说明】
[00巧]图1为本发明实施例hiPS诱导形成过程中细胞形态变化示意图，其中，A :人胚胎 成纤维细胞，B :病毒感染后D4天细胞形态，C :感染2周左右天形成的非ES样克隆，D-F : 人feeder上传代培养的典型的iPS克隆，F:iPSCs周边自发分化的克隆，A-D和F标尺为 200 y m，E 标尺为 50 y m;
[00%] 图2为本发明实施例hiPSCs中的全能型相关基因表达检测示意图；
[0027] 图3为本发明实施例hiPSCs与hESCs来源的邸不同分化时间点内、中、外立胚层 代表基因表达示意图，其中，S0X17 :内胚层，RUNX1 :中胚层，PAX6 :外胚层；
[0028] 图4为本发明实施例hiPSCs中端粒酶水平检测示意图；
[0029] 图5为本发明实施例hiPSCs的免疫组化分析示意图，其中，A :AKP染色，B: SSEA-3, C :SSEA-4, D :TRA-1-60, E :TRA-1-81，F :0CT4, A 标尺为 200 ym，B-F 标尺为 100 ym；
[0030] 图6为本发明实施例hiPSCs体外S胚层分化检测示意图，其中，A :B-tubulin/ DAPI，B :SMA/DAPI，C :AFP/DAPI，崎胎瘤组织切片显示S胚层来源的细胞D :软骨（中胚