淋巴细胞系肿瘤的治疗剂的制作方法

专利名称：淋巴细胞系肿瘤的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以能特异结合自淋巴细胞系肿瘤显示出的蛋白质的抗体为有效成分的淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。本发明还涉及T细胞肿瘤或B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。另外本发明也涉及能特异结合淋巴细胞系肿瘤显示出的蛋白质，具有细胞杀伤活性的抗体。
淋巴细胞系细胞是生物体内主要担当免疫任务的细胞。淋巴细胞系细胞都来自同一血液干细胞，在骨髓中或其它器官中受到各种各样的分化诱导因子或增殖因子的作用反复分化后，释放到外周血液。根据分化的不同，淋巴细胞系细胞又大致分为T细胞和B细胞。一般认为B细胞具有产生抗体的能力，而T细胞具有抗原提示能力、细胞杀伤能力以及其它各种各样的能力。但在分化阶段中由于某些原因使得细胞肿瘤化，在骨髓中、淋巴组织中、外周血液等部位已经异常增殖的细胞就是淋巴细胞系肿瘤。
由于近年来新技术的引入，特别是随着利用对细胞表面的分化抗原的单克隆抗体技术的进步，淋巴细胞系细胞的由来以及分化阶段的鉴定都成为可能。随之而来，有关淋巴细胞系肿瘤其肿瘤细胞的由来不只是T细胞、B细胞的由来，甚至连成熟度的鉴定也成为可能。
淋巴细胞系肿瘤根据其肿瘤细胞的起源或成熟度大致分为B细胞肿瘤和T细胞肿瘤。B细胞肿瘤按照肿瘤细胞成熟度又分为急性B淋巴性白血病(B-ALL)、慢性B淋巴白血病(B-CLL)、pre-B淋巴肿瘤、Burkitt淋巴肿瘤、滤胞性淋巴肿瘤、滤胞外套淋巴肿瘤、弥漫性淋巴肿瘤等。而T细胞肿瘤根据其肿瘤细胞成熟度的不同分为急性T淋巴性白血病(T-ALL)、慢性T淋巴白血病(T-CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL外周性T淋巴肿瘤(PNTL)等(《图解临床[癌]系列》NO.17白血病·淋巴肿瘤、杉村隆等、MEDICAL VIEW社、1987，《B细胞肿瘤》、高月清、西村书店、1991)。
尽管近年来的医疗技术有了进步，然而不得不说有关淋巴细胞系肿瘤的治疗还不充分。例如，急性淋巴白血病(ALL)的治愈率在20％以下。而淋巴肿瘤治疗，如B淋巴瘤治疗虽说是由于多剂并用疗法的进步，治愈率比较高，但进行期中的治愈率是50％左右。T淋巴瘤是更难治的肿瘤，治愈率大约为30％，至于成人T细胞白血病(ATL)治愈率还不到10％，这就是目前治疗的现状。
Goto，T.等人报告(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)，将人骨髓瘤细胞免疫小鼠获得了单克隆抗体(抗HM1.24抗体)。如果给予移植了人骨髓瘤细胞小鼠抗HM1.24抗体，该抗体特异地聚集在肿瘤组织(小阪昌明等、《日本临床》(1995)(53，627-635)，因此，这表明抗HM1.24抗体应用于通过放射性同位素诊断肿瘤部位以及放射免疫疗法等导弹疗法是有可能的。然而还不清楚抗HM1.24抗体对于其它淋巴细胞系肿瘤的治疗是否有用。
现在进行的淋巴细胞系肿瘤的治疗中有各种化学疗法、X射线疗法、骨髓移植等，上述疗法中的任何一种疗法都还不完全，所以期待着能使淋巴细胞系肿瘤缓解、使患者生存期间延长的划时代的治疗剂或治疗方法。
因此本发明的目的在于提供对淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)的新的治疗剂。
本发明人为了提供这样的治疗剂，反复使用抗HM1.24抗体(Goto，T.等人《血》(Blood)(1994)84，1922-1930)，进行FCM(流式细胞测量法)解析、ADCC活性、CDC活性那样的细胞杀伤活性的测定等体外研究，以及体内的抗肿瘤效果的研究，还进一步进行了抗HM1.24抗体特异结合的抗原蛋白质分离的研究，通过这些结果发现抗HM1.24抗体识别的抗原蛋白质出现在淋巴细胞系肿瘤上，以及抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤具有抗肿瘤效果，从而完成本发明。
即，本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，或B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合，而且具有细胞杀伤活性的单克隆抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合，而且具有作为细胞杀伤活性的ADCC活性或CDC活性的抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合，而且具有细胞杀伤活性，作为恒定区域的人抗体的Cγ抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供含有能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合，而且具有细胞杀伤活性的嵌合体抗体或类人化抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供以与抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位特异结合的抗体为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
本发明提供以抗HM1.24抗体作为有效成分的T细胞肿瘤治疗剂，以及B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
另外本发明还涉及能特异结合淋巴细胞系肿瘤表达的蛋白质的，具有细胞杀伤活性的抗体。附图的简单说明

图1表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图2表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图3表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图4表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图5表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图6表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图7表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图8表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图9表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图10表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图11表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图12表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图13表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图14表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图15表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图16表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图17表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图18表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图19表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的T细胞株进行FCM解析时的直方图。
图20表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图21表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图22表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图23表示用抗HM1.24抗体和对照小鼠IgG2a通过间接法对图中所示的非T非B细胞株进行FCM解析时的直方图。
图24是表示抗HM1.24抗体对作为T细胞肿瘤株的CCRF-CEM，CCRF-HSB-2以及HPB-MLT，引起的细胞杀伤与抗体浓度依赖性关系图。
图25是表示抗HM1.24抗体对作为B细胞肿瘤株的EB-3，MC116以及CCRF-SB，引起的细胞杀伤与抗体浓度依赖性关系图。
图26是表示人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠中，抗HM1.24抗体给予群与对照小鼠IgG2a给予群相比，其肿瘤体积的增加被抑制的图。
图27是表示人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠中，抗HM1.24抗体给予群与对照小鼠IgG2a给予群相比，其生存期间延长的图。发明的实施形式1.抗体的制备1-1.杂交瘤的制备产生本发明中使用的产生抗体的杂交瘤基本上是利用众所周知的技术，可以按以下方法制备。即，使用显示出HM1.24抗原蛋白质或HM1.24抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，使用通常的细胞融合方法将得到的免疫细胞与众所周知的亲本细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，就可以制备杂交瘤。
具体来说，为了制备单克隆抗体可以按如下方法进行。例如，作为能获得抗体的致敏抗原的HM1.24抗原显示细胞可以使用人多发性骨髓瘤细胞株KPMM2(特开平7-236475)或KPC-32(Goto，T.等，《日本临床血液学杂志》(Jpn.J.Clin.Hemato1.(1991)32，1400)。作为致敏抗原还可以使用具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质，或含有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位的肽或多肽。
另外，作为致敏抗原使用的，具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质的cDNA被插入到pUC19载体的Xbal切点之间，制备成质粒pRS38-pUC19。含有这个pRS38-pUC19质粒的大肠杆菌(E.coli)于平成5年(1993年)10月5日以Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)保藏号为FERM BP-4434，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(参照特开平7-196694)。利用包含在pRS38-pUC19质粒中的cDNA片段通过基因工程手法可以制备含有抗HM1.24抗体识别抗原决定部位的肽或多肽。
作为可用致敏抗原免疫的哺乳动物虽然没有特别地限定，但最好是在考虑与细胞融合使用的亲本细胞的适合性后，进行选择。一般来说是使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
在用致敏抗原免疫动物时，按照众所周知的方法进行。例如，作为一般的方法是将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下。具体来说，将致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲盐水Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水适当地稀释，根据需要将悬浊的上述稀释液与常用的佐剂，例如弗罗因德完全佐剂进行适量混合，乳化后，最好是每隔4-21天对哺乳动物进行免疫数次。致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
在进行这样免疫，确认血清中所需要的抗体水平上升后，从哺乳动物中取得免疫细胞，进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞最好是脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的另外的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞已经知道的各种各样的细胞株都适用，例如，P3X63Ag8.653(《免疫学杂志》(J.Immnol.)(1979)1231548-1550)，P3X63Ag8U.1(《当代微生物学和免疫学论题》(Current Topics in Microbiology and Immunology)(1978)811-7)，NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)(1976)6511-519)，MPC-11(Margulies.D.H.等，《细胞》(Cell)(1976)8405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，《自然》(Nature)(1978)276269-270)，FO(de St.Groth，S.F.等，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)(1980)351-21)，S194(Trowbridge，I.S.《实验医学杂志》J.Exp.Med.(1978)148313-323)，R210(Galfre，G.等，自然(Nature)(1979)277131-133)。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合基本上是按照众所周知的方法进行，例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，《酶学方法》(Methods Enzymol.)(1981)733-46)进行。
更具体来说，上述细胞融合，例如可以在细胞融合促进剂存在下于常用的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，根据需要为了提高融合效率也可以添加二甲基亚砜等辅助试剂。
免疫细胞与骨髓瘤的使用比例，例如，免疫细胞最好是骨髓瘤细胞的1-10倍。作为上述细胞融合使用的培养液，例如可以使用适合于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、此外可以使用该种细胞培养中使用的常用培养液，也可以与胎牛血清(FCS)等血清补液并用。
细胞融合是将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞于上述培养液中充分混合，然后添加事先升温到37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量1000-6000左右的PEG溶液，通常浓度为30-60％(W/V)，通过混合就可形成所需要的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过反复进行逐次添加适当的培养液，离心除去上清的操作可以除去对杂交瘤的增殖不利的细胞融合剂。
该杂交瘤通过在常用的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养进行选择。当在HAT培养液中培养时，为了使除了目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死掉的充分时间通常是持续数日～数周。然后实施极限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
另外除了用抗原免疫人以外的动物得到上述杂交瘤以外，也可以在体外用HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞使人淋巴细胞致敏，致敏的淋巴细胞再与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，也可以得到具有与HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞结合活性的所希望的人抗体(参照特公平1-59878)。另外将成为抗原的HM1.24抗原或HM1.24抗原显示细胞注入具有人抗体基因全部指令的转基因动物，按照上述方法获得所希望的抗体也是可以的(国际专利申请公开号WO 93/12227，WO 93/03918，WO94/02602，WO 94/25585，WO 96/34096，WO 96/33735)。
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常用的培养液中进行继代培养，也可以在液氮中长期保存。
要从该杂交瘤中获得单克隆抗体，可以采用对该杂交瘤按通常的方法进行培养，获取其培养上清的方法，或采用将杂交瘤注入适合杂交瘤增殖的哺乳动物中使其增殖，获得其腹水的方法。前者方法适合于获得高纯度的抗体，后者适用于抗体的大量生产。
具体来说，产生抗HM1.24抗体的杂交瘤的制备可以按照Goto，T.等人的方法(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)进行。可以采用平成7年9月14日以FERM BP-5233按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所的产生抗HM1.24抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠(日本クレア制)的腹腔内，得到腹水，从该腹水可以纯化抗HM1.24抗体的方法，或者是利用将该杂交瘤在适当的培养基，例如含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)的RPMI 1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制)等培养，从培养上清中纯化抗HM1.24抗体的方法。
1-2.重组型抗体在本发明中作为单克隆抗体可以从杂交瘤中克隆抗体基因，然后重组到适当的载体中，再导入宿主，利用基因重组技术生产的重组型抗体。(例如，参见Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，《治疗单克隆抗体》(THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES)，MACMILLAN PUBLISHERS LTD出版，英国1990)。
具体来说，从产生目的抗体的杂交瘤中分离编码抗体可变区(V)的mRNA。mRNA的分离可以按照众所周知的方法，例如梯度超离心法(Chirgwin，J.M.等人，《生物化学》(Biochemistry)(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等人，《分析生物化学》(AnalyticalBiochemistry)，(1987)162，156-159)，制备总mRNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)可直接制备mRNA。
使用逆转录酶由得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒也可以进行cDNA的合成。而为了进行cDNA的合成和扩增，可以使用5′-Ampli Finder Race试剂盒(Clontech制)和PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A等人《核酸研究》Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。从得到的PCR产物纯化目的DNA片断，与载体连接。然后作成重组的载体，导入大肠杆菌，选择菌落制备所希望的重组载体。利用众所周知的方法，例如脱氧法，确认目的DNA。
如果得到编码目的抗体V区的DNA，将它与编码所希望的抗体的恒定区(C区)连接，重组入表达载体。而也可以将编码抗体V区的DNA重组入含有抗体C区DNA的表达载体。
为了制备本发明中使用的抗体，可以象后面叙述的那样，将抗体基因重组入在表达调控区，例如增强子、启动子的控制下能表达的那样表达载体中，然后用该表达载体转化宿主细胞，可以使抗体表达。
1-3改变抗体在本发明中，以使对人的异种抗原性降低等为目的，可以使用人为改变了的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体，类人化(Humanized)抗体等。这些改型抗体可以用已知的方法进行制造。
嵌合抗体可以通过将上述得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后重组入表达载体，导入宿主使其表达得到(参照欧洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公开号WO 96/02576)。使用这个已知的方法可以得到本发明中有用的嵌合抗体。
例如，含有编码嵌合抗体抗HM1.24抗体的L链V区和H链V区的DNA质粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)的名称于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5646，FERM BP-5644(参见特愿平9-271536)。
类人化抗体也称之改造的(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的互补性决定区(CDRcomplementarity determiningregion)移植入人抗体的互补性决定区后形成的抗体，其常用的基因重组手法也已了解(参照欧洲专利申请公开号EP 125023，国际专利申请公开号WO 96/02576)。
具体来说，通过PCR法由末端部位含有重叠部分而制成的数个的寡核苷酸合成一个设计的DNA序列，使小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区(framework region；FR)连接。得到的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后重组入表达载体，再将该载体导入宿主使其产生抗体(参照欧洲专利申请公开号EP 239400，国际专利申请公开号WO 96/02576)。
通过CDR连接的人抗体的FR选择的是互补性决定区形成良好抗原结合部位的区。根据需要为了使改造的人抗体的互补性决定区形成合适的抗原结合部位，也可以替换抗体可变区框架区的氨基酸(Sato，K.等，《癌症研究》Cancer Res.(1993)53，851-856)。
例如，含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区a区(序列号2)以及H链V区r区(序列号3)的DNA的质粒的大肠杆菌分别以Escherichiacoli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)的名称于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5645，FERM BP-5643(参见特愿平9-271536)。另外含有编码类人化抗HM1.24抗体的H链V区s区(序列号4)DNA质粒的大肠杆菌以Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)的名称的名称于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨域县筑波市东1丁目1番3号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-6127(参见特愿平9-271536)。
在嵌合抗体和类人化抗体中使用了人抗体C区，作为表现出细胞杀伤活性的人抗体C区，可以使用人Cγ，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。其中，特别是含有Cγ1、Cγ3的抗体具有很强的细胞杀伤活性，即具有ADCC活性、CDC活性，最适用于本发明。
嵌合抗体是由来自人以外的哺乳动物抗体的可变区和来自人抗体的C区构成的，类人化抗体是由来自人以外的哺乳动物抗体的互补性决定区以及来自人抗体的框架区(framework region；FR)和C区构成的，为了使人体内的抗原性降低，作为本发明的治疗剂的有效成分是很有用的。
作为本发明中使用的类人化抗体的优选具体例子有类人化抗HM1.24抗体(参见特愿平9-271536)。类人化抗HM1.24抗体的L链V区的优选具体例子有由序列号2所示碱基序列编码的氨基酸序列。类人化抗HM1.24抗体的H链V区优选具体例子有由序列号3和4所示碱基序列编码的氨基酸序列。
1-4.表达和生产上述构建的抗体基因可以通过众所周知的方法使其表达来获得。若是哺乳类细胞，抗体基因可以通过含有从功能上使常用的启动子、被表达的抗体基因、其3′侧下游聚A信号功能性结合的DNA或含有该DNA的载体使其表达。例如，作为启动子/增强子如人巨细胞病毒前期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
此外，作为本发明使用的抗体的表达中用的启动子/增强子只要使用逆病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV 40)等病毒启动子/增强子或来自人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳类细胞的启动子/增强子就可以。
例如，使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(《自然》Nature(1979)277，108)、使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等人的方法(《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)(1990)18，5322)可以很容易实施。
若是大肠杆菌，可以从功能上使常用的启动子、抗体分泌用的信号序列、被表达的抗体基因功能性结合，使其表达。例如作为启动子有lacz启动子、araB启动子。使用lacz启动子时，按照Ward等人的方法(《自然》Nature(1980)343，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)进行，使用araB启动子时，可以按照Better等人的方法(《科学》Sciense(1988)240，1041-1043)实施。
作为抗体分泌用的信号序列，使抗体在周质中产生时，只要使用pelB信号序列(Lei，S.P.等，《细菌学杂志》J.Bacteriol.(1987)169，4379)就可以。产生在周质的抗体分离后，对抗体的结构进行适当的再折叠后就可以使用了(例如，参照W096/30394)。
作为复制起源可以使用来自SV 40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的起源，另外为了在宿主细胞系中扩增基因拷贝数，表达载体作为选择标记可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制造本发明中使用的抗体可以使用任意的产生体系。抗体制造用产生体系有体外(体外(in vitro))和体内(体内(in vivo))产生体系。作为体外产生体系可以举出使用真核细胞的产生体系和使用原核细胞的产生体系的例子。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞和真菌细胞的产生体系。作为动物细胞已知有(1)哺乳类细胞，例如CHO，COS，骨髓瘤、BHK(乳仓鼠肾baby hamster kidney)，Hela，Vero，(2)两栖类细胞，例如非洲蛙卵母细胞、或(3)昆虫细胞，例如sf9，sf21，Tn5等。作为植物细胞已知有来自烟草属(Nicotiana)，例如烟草Nicotiana tabacum的细胞，只要进行愈伤组织培养就可以。作为真菌细胞已知有酵母，例如酵母(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)，霉菌，例如曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生体系。作为细菌细胞已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
这些细胞通过转化将作为目的基因的抗体基因导入，经过在体外对转化的细胞进行培养就可得到抗体。培养按照众所周知的方法进行。例如，作为培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以同时使用胎牛血清(FCS)等血清补液。另外通过将已导入抗体基因的细胞移入动物的腹腔，也可以在体内(in vivo)产生抗体。
另外作为体内(in vivo)的产生体系，可以举出使用动物的产生体系和使用植物的产生体系。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生体系。
作为哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，光谱生物技术应用(SPECTRUM Biotechnology Application)，1993)。另外作为昆虫可以使用蚕。
使用植物时，可以用烟草。
将抗体基因导入这些动物或植物，使动物或植物体内产生抗体，然后再回收。例如，将抗体基因插入编码如山羊β-酪蛋白之类的乳汁中固有产生的蛋白质的基因中，制备融合基因。然后将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚内，将该胚导入雌性山羊。从接受了胚的山羊产下的转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以获得所希望的抗体。为了使从转基因山羊产生的含有所希望的抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等，生物/技术(Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
当使用蚕时，用插入了目的抗体基因的杆状病毒感染蚕，然后从感染的蚕的体液获得所希望的抗体(Susumu，M.等，《自然》Nature(1985)315，592-594)。在使用烟草时，将目的抗体基因插入植物表达用载体，例如pMON530，然后将该载体导入根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumeraciens)一类的细菌中。使该细菌感染烟草，例如烟草(Nicotiana tabacum)，从该烟草的叶子中提取所希望的抗体(Julian，K.-c，Ma等《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)(1994)24，131-138)。
象上述那样利用体外(in vitro)或体内(in vivo)的产生体系产生抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别重组入表达载体中，同时转化宿主，或者将编码H链和L链的DNA重组入单一的一个表达载体后，转化宿主也可以(参照国际专利中请公开号WO 94-11523)。
使象上述那样得到的抗体与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合，也可以作为抗体修饰物使用。本专利申请权利要求的范围中，所谓“抗体”也包括这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，通过对得到的抗体进行化学修饰就可实现。这些方法在该领域已经确立。
2.抗体的分离、纯化2-1.抗体的分离、纯化象上述那样产生、表达的抗体可以从细胞内外、宿主中分离纯化至均一。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以利用亲和层析进行。作为亲和层析所用的柱子，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中用的载体，例如有Hyper D，POROS，Sepharose F.F.等。
此外，只要使用通常蛋白质中使用的分离、纯化方法就可以，并没有什么限定。例如通过适当选择、或联合使用除了上述亲和层析以外的层析、过滤、超滤、盐析、透析等方法，就可以分离、纯化本发明中使用的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这些层析也适用于HPLC。另外也可以使用反相HPLC。
2-2.抗体浓度的测定2-1中得到的抗体的浓度测定可以通过吸光度测定或ELISA进行。即，通过吸光度测定时，将本发明中使用的抗体或含有抗体的样品用PBS(-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.35OD就可以算出浓度。而利用ELISA测定时可以按以下方法测定。即，将用0.1M重碳酸缓冲液(pH9.6)稀释成1μg/ml的山羊抗人IgG(BIO SOURCE制)100μl加到96孔板(Nunc制)，于4℃下温育过夜，使抗体固相化。
封闭后，添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含抗体的样品，以及作为标准样品的人IgG(CAPPEL制)100μl，于室温保温1小时。洗净后，添加5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗IgG(BIOSOURCE制)100μl，于室温保温1小时。洗净后，加入底物溶液，温育后，使用MICROPLATEREADER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，可以算出目的抗体的浓度。
3.FCM解析淋巴细胞系肿瘤与本发明中使用的抗体的反应性可以通过FCM(流式细胞计)解析进行。作为细胞可以用树立细胞株或新分离细胞。例如作为树立细胞株可以使用作为T细胞的RPMI 8402(ATCC CRL-1994)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性淋巴性白血病的HPB-ALL(FCCH1018)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT(FCCH1019)、来自急性淋巴性白血病的JM(FCCH1023)、来自急性成淋巴细胞白血病的MOLT-4(ATCC CRL-1582)、来自急性淋巴性白血病的Jurkat(FCCH1024)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL-120.1)、来自成人T细胞白血病的MT-1(FCCH1043)、来自レンネルト淋巴肿瘤的KT-3(Shimizu，S.等，《血液》Blood(1988)71，196-203)等，作为B细胞株可以使用EB病毒转化细胞CESS(ATCC TIB-190)、EB病毒阳性B细胞SKW6.4(ATCC TIB-215)、来自B淋巴肿瘤的MC116(ATCCCRL-1649)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、来自急性骨髓性白血病患者的B细胞RPMI 6410(FCCH6047)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Daudi(ATCC CCL-213)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCCCCL-85)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Jijoye(ATCC CCL-87)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Raji(ATCC CCL-86)等，也可以使用作为非T非B细胞株的来自骨髓性白血病HL-60(ATCC CCL-240)、来自急性单核细胞白血病的THP-1(ATCC TIB-202)、来自组织细胞性白血病的U-937(ATCC CRL-1593)、来自慢性骨髓性白血病的K-562(ATCC CCL-243)、等细胞。
用PBS(-)洗净上述细胞后，加入用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清、0.1％叠氮钠的PBS(-))稀释到25μg/ml的抗体或对照抗体100μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC标记的山羊抗小鼠抗体(GAM，Becton Dickinson制)的抗体100μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600μl或1ml的FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson制)测定各个细胞的荧光强度。
从各个细胞的荧光强度的测定值可以知道本发明中使用的抗体和各个细胞的反应性。就是说，从各个细胞的荧光强度的测定值就可以知道各个细胞中HM1.24抗原是否显示出来(阳性或阴性)以及显示的强度。有关淋巴细胞系肿瘤中HM1.24抗原的显示有无以及显示强度记载于下面的实施例2.2.FCM解析中。
成为本发明治疗对象的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞显示出HM1.24抗原。更详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数不小于5％的肿瘤细胞。更详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在20％以上的肿瘤细胞。再详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在50％以上的肿瘤细胞。再详细地说，理想的淋巴细胞系肿瘤的肿瘤细胞是HM1.24抗原阳性的百分数在80％以上的肿瘤细胞。
4.细胞杀伤活性4-1.CDC活性的测定本发明使用的抗体是具有作为细胞杀伤活性的抗体，例如CDC活性的抗体。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂对淋巴细胞系肿瘤的CDC活性可以按以下方法测定。首先将用适当的培养基，例如含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制)将靶细胞调整至4×105个/ml。作为靶细胞可以用CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB-3(ATCC CCL-85)、MC116(ATCC CRL-1649)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、K-562(ATCC CCL-243)等。将这些细胞50μl加入到96孔平底板(FALCON制)中。于37℃、CO2条件下在培养箱中培养过夜。
然后，加入测定CDC活性的抗体，温育60分钟后，加入适当稀释的补体，例如乳兔补体(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE制)，温育2小时。然后向各个孔中加入Alamar Bule(BIO SoURCE制)10μl，温育4小时后，用荧光测定系统CytoFluor 2350(MILLIPORE制)测定各孔的荧光强度(激发波长530nm，检测波长590nm)。细胞杀伤活性(％)可以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下温育后的荧光强度，B是不含抗体只是培养液温育后的荧光强度，C是不含细胞的孔的荧光强度。
4-2.ADCC活性测定本发明使用的抗体是具有作为细胞杀伤活性的抗体，例如ADCC活性的抗体。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂对淋巴细胞系肿瘤的ADCC活性可以按以下方法测定。首先，用比重离心法从人的外周血液中分离出单核细胞，制备成效应细胞。而作为靶细胞通过用51Cr标记CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB-3(ATCC CCL-85)、MC116(ATCC CRL-1649)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、K-562(ATCC CCL-243)等，制备成靶细胞。接下来，向标记的靶细胞加入测定ADCC活性的抗体，温育，然后加入对靶细胞恰当比例的效应细胞，温育。
取温育后的上清，用γ计数器测定放射活性。此时，在最大游离放射能测定中可以使用1％的NP-40。细胞杀伤活性(％)可以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下游离的放射活性(％)，B是通过NP-40游离出的放射活性(cpm)，C是不含抗体只含培养液而游离出的放射活性(cpm)。
4-3.细胞杀伤活性的增强为了发挥象ADCC活性和CDC活性那样的细胞杀伤活性，对于人最好使用作为抗体恒定区(C区)的Cγ、特别是Cγ1、Cγ3。另外通过对抗体C区的氨基酸进行部分增加、改变、修饰，可以诱导更强的ADCC活性或CDC活性。
例如，通过氨基酸转换的IgG象IgM那样的聚合化(Smith，R.I.F.&Morrison，S.L.《生物/fsy》BIO/TECHNOLOGY(1994)12，683-688)，通过附加氨基酸的IgG象IgM那样的聚合化(Smith，R.I.F.等，《免疫学杂志》(J.Immunology)(1995)154，2226-2236)，通过编码L链的基因的串联的表达(Shuford，W.等，《科学》Science(1991)252，724-727)，通过氨基酸转换引起的IgG的二聚体化(Caron，P.C.等，《实验医学杂志》J.Exp.Med.(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，《免疫学杂志》J.Immunology(1992)148，2918-2922)，通过化学修饰引起IgG的二聚体化(Wolff，E.A.等，《癌症研究》Cancer Res.(1993)53，2560-2565)，以及通过抗体铰链区氨基酸的改变引起的效应功能的导入(Norderhaug，L.等，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)(1991)21，2379-2384)。这些变化通过利用引物的寡聚物部位特异的变异导入法，利用限制酶切部位的碱基序列的添加，以及使用可以引起共价结合的化学修饰剂都可实现。
5.治疗效果的确认为了确认本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂的治疗效果，可以将本发明中使用的抗体注入移植了淋巴细胞系肿瘤细胞的动物，通过评价抗肿瘤效果得出。
作为向动物移植的淋巴细胞型肿瘤细胞，可以使用树立细胞株或新分离的细胞。例如作为树立细胞可以用作为T细胞的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、HPB-MLT(FCCH1019)、MOLT-4(ATCC CRL-1582)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1)等，作为B细胞的CESS(ATCC TIB-190)、SKW6.4(ATCC TIB-215)、CCRF-SB(ATCC CCL-120)、RPMI 6410(FCCH6047)、EB-3(ATCC CCL-85)等。
作为被移植的动物，用免疫功能低下或欠缺的动物最好，例如可以用裸小鼠、SCID小鼠、本色小鼠、裸大鼠等。进行评价的抗肿瘤效果的确认可以利用肿瘤体积和重量的测定以及动物的生存期间等进行。
就象下述的实施例所给出的那样，通过将抗HM1.24抗体注入人淋巴细胞系肿瘤移植鼠，确认肿瘤体积的增加的抑制、肿瘤移植鼠的生存期间进一步延长。这些现象表明抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤有抗肿瘤效果。
6.给药途径和制剂本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂可以非口服的全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射，可以根据患者的年龄、症状选择合适的给药方式。有效的给药量每一次每1kg体重在0.01mg至100mg的范围内选择，或者每个患者选择1-100mg，最好是5-50mg给药量。
本发明的淋巴细胞系肿瘤治疗剂即使是同时含有由给药途径决定，医药上容许的载体和添加物也可以。作为这样的载体和添加物的例子有水、医药上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、呫吨胶(xanthan gum)阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、一缩二甘油、丙(撑)二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HAS)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物容许的表面活性剂等。使用的添加物根据剂型，可以从上述的化合物中选择合适的或组合使用，这些并没有特别限定。
作为本发明的治疗对象疾病，是作为靶细胞的肿瘤细胞上存在结合本发明中使用的抗体的抗原的，除骨髓瘤之外的淋巴细胞系肿瘤。具体来说，有急性B淋巴性白血病(B-ALL)、慢性B淋巴白血病(B-CLL)、pre-B淋巴肿瘤、Burkitt淋巴肿瘤、滤胞性淋巴肿瘤、滤胞外套淋巴肿瘤、弥漫性淋巴肿瘤、急性T淋巴性白血病(T-ALL)、慢性T淋巴白血病(T-CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL外周性T淋巴肿瘤(PNTL)等。本发明的治疗剂作为这些淋巴细胞系肿瘤的治疗剂是有用的。实施例下面，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例1.抗HM1.24抗体的制备
1.含抗HM1.24抗体的小鼠腹水的制备根据Goto，T.等人的方法(《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930)得到产生抗HM1.24抗体的杂交瘤。
首先向于3日前已将2，6，10，14-四甲基十五烷(和光纯药工业制)各500μl注入了腹腔内的小鼠(日本クレア制)，再注入该杂交瘤5×106个。从杂交瘤注入第十天开始，用19口径的留置针ハツピ-キヤス(メデイキツト制)取小鼠腹腔中的腹水。采得的腹水用低速离心机RLX-131(トミ-精工制)离心两次，转数分别为1000，3000rpm，除去杂交瘤、血细胞等杂物。
2.从小鼠腹水中纯化抗HM1.24抗体从上述小鼠腹水中纯化抗HM1.24抗体可以按以下方法进行。向小鼠腹水中加入等量的PBS(-)后，使用中空纤维フイルタ-メデイアフレツプ(MILLIPORE制)进行过滤，用高速抗体纯化装置Consep LC100(MILLIPORE制)和Hyper D Protein A柱(柱体积20ml、日本ガイシ制)按照附带的说明书，作为吸附缓冲液使用PBS(-)，作为洗脱液使用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH4)，进行亲和纯化。洗脱级分在洗脱出来之后马上添加1MTris-HCl(pH8.0)，然后将pH调整到pH7.4附近，然后使用离心超滤浓缩器Centriprep 10进行浓缩和将缓冲液置换为PBS(-)，用孔径0.22μm的膜过滤器MILLEX-GV(MILLIPORE制)过滤灭菌，得到纯化的抗HM1.24抗体。
3.抗体浓度的测定纯化抗体浓度的测定是通过吸光度的测定进行的。即纯化抗体用PBS(-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1mg/ml作为1.35OD就可以算出浓度。实施例2.抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤细胞反应性的研究1.对照小鼠IgG2a的纯化对照小鼠IgG2a的纯化按照以下方法进行。市售的mouseIgG2a(KAPPA)(UPC 10)ascites(CAPPEL制)用精制水和PBS(-)溶解。然后用孔径0.2μm的膜过滤器Acrodisc(Gelman Sciences制)过滤后，用高速抗体纯化装置Consep LC100(MILLIPORE制)和Hyper D Protein A柱(柱体积20ml、日本ガイシ制)按照附带的说明书，作为吸附缓冲液使用PBS(-)，作为洗脱液使用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH4)，进行亲和纯化。洗脱级分在洗脱出来之后马上添加1Mtris-HCl(pH8.0)后，将pH调整到pH7.4附近，然后使用离心超滤浓缩器Centriprep 10进行浓缩和将缓冲液置换为PBS(-)，用孔径0.22μm的膜过滤器MILLEX-GV(MILLIPORE制)过滤灭菌，得到纯化的对照小鼠IgG2a。
纯化的对照小鼠IgG2a的浓度测定按照上述3的抗体浓度测定进行。
2.FCM解析抗HM1.24抗体对淋巴细胞系肿瘤细胞反应性的研究可以通过FCM(流式细胞计)解析进行。可以使用作为T细胞的RPMI 8402(ATCC CRL-1994)、来自急性淋巴性白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性成淋巴细胞白血病的HPB-ALL(FCCH1018)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT(FCCH1019)、来自急性淋巴性白血病的JM(FCCH1023)、来自急性淋巴细胞性白血病的MOLT-4(ATCC CRL-1582)、来自急性成淋巴细胞白血病的Jurkat(FCCH1024)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL-120.1)、来自成人T细胞白血病的MT-1(FCCH1043)、来自レンネルト淋巴肿瘤的KT-3(Shimizu，S.等，《血液》Blood(1988)71，196-203)等，可以使用作为B细胞株的EB病毒转化细胞CESS(ATCCTIB-190)、EB病毒阳性B细胞SKW6.4(ATCC TIB-215)、来自B淋巴肿瘤的MC116(ATCC CRL-1649)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、来自急性骨髓性白血病患者的B细胞RPMI 6410(FCCH6047)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Daudi(ATCC CCL-213)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCC CCL-85)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Jijoye(ATCC CCL-87)、来自Burkitt淋巴肿瘤的Raji(ATCC CCL-86)等，也可以使用作为非T非B细胞株的来自骨髓性白血病HL-60(ATCC CCL-240)、来自急性单核细胞白血病的THP-1(ATCC TIB-202)、来自组织细胞性白血病的U-937(ATCC CRL-1593)、来自慢性骨髓性白血病的K-562(ATCC CCL-243)、等细胞。用PBS(-)洗净上述细胞后，加入用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清、0.1％叠氮钠的PBS(-))稀释到25μg/ml的抗HM1.24抗体或对照小鼠IgG2a100μl，冰中放置30分钟。
用FACS缓冲液洗净后，加入25μg/ml的FITC标记的山羊抗小鼠抗体(GAM)100μl，冰中放置30分钟。用FACS缓冲液洗净后，悬浮于600μl或1ml的FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson制)测定各个细胞的荧光强度。测定结果如图1～23所示，确认若是用T细胞则是全部例子，而若是用B细胞，除Daudi，Raji 2类没有反应外，其它例子都可与抗HM1.24抗体反应，表现出高HM1.24抗原性。另外非T非B细胞株全部例子都不能与抗HM1.24抗体反应，也不能检测出抗原显示。
在图1～23的各个细胞的直方图中，使用对照小鼠IgG2a的染色，使阴性细胞为98％，阳性细胞为2％那样设定直方图标示，按照该直方图标示，可以算出使用抗HM1.24抗体时的HM1.24抗原阳性细胞的百分数，结果如表1所示。从HM1.24抗原阳性细胞的百分数可以将HM1.24抗原显示率分为-、+/-、+、++、+++5个区段，结果表明与图1～23一样，T细胞株全部例子、而B细胞株除去Daudi，Raji其它都显示为++或+++的非常高的HM1.24抗原性。而非T非B细胞株全部例子中，HM1.24抗原阳性细胞不到5％，这表明没有抗原的显示，或是非常少。表1细胞名显现率B细胞株CESS +++ 94.5SKW6.4 +++ 92.8MC116 ++ 65.0CCRF-SB+++ 98.4RPMI6410 +++ 94.5EB-3 +++ 88.3Jijoye +++ 92.3Daudi -2.8Raji-2.0T细胞株RPMI8402 +++ 94.0CCRF-CEM +++ 97.8HPB-ALL++ 63.8HPB-MLT+++ 94.6JM +++ 99.6MOLT-4 +++ 84.1Jurkat ++ 70.9CCRF-HSB-2 +++ 100.0MT-1 +++ 95.9KT-3 +++ 96.0非T非B细胞株HL-60 -2.9THP-1 -1.5U-937 -1.1K-562 -3.9实施例3.CDC活性的测定抗HM1.24抗体对淋巴细胞类肿瘤细胞的CDC活性按以下方法测定。
1.靶细胞的制备用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制)将作为靶细胞的来自急性淋巴性白血病的CCRF-CEM(ATCC CCL-119)、来自急性成淋巴细胞白血病的CCRF-HSB-2(ATCC CRL-120.1)、来自T淋巴肿瘤的HPB-MLT(FCCH1019)、来自Burkitt淋巴肿瘤的EB-3(ATCC CCL-85)、来自B淋巴肿瘤的116(ATCC CRL-1649)、来自急性淋巴性白血病的CCRF-SB(ATCC CCL-120)、来自骨髓性白血病K562(ATCC CCL-243)调整至4×105个/ml。将这些细胞悬浊液50μl加入到96孔平底板(FALCON制)中，于37℃、CO2条件下在培养箱中(TABAI制)培养过夜。
2.抗HM1.24抗体的制备用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制)将上述实施例1中得到的纯化抗HM1.24抗体调整为0，0.2，2，20μg/ml，然后向上述1中制作的96孔平板的各孔中各加入50μl。于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)培养60分钟后，用低速离心机05PR-22(日立制)，1000rpm，离心5分钟，除去上清50μl。
3.补体的制备每1小玻璃瓶1ml的精制水溶解“乳鼠补体”(Baby RabbitComplement)(CEDARLANE制)，再用不含FCS的RPMI1640培养基(GIBCO-BRL制)5ml稀释。然后加入到上述2的96孔平板的各孔中，每孔50μl，于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)培养2小时。
4.CDC活性的测定培养后，向上述3的96孔平板各孔中各加入Alamar Bule(BIO SOURCE制)10μl，于37℃、5％CO2条件下在高湿培养箱中(TABAI制)温育4小时后，用荧光测定系统CytoFluor 2350(MILLIPORE制)测定各孔的荧光强度(激发波长530nm，检测波长590nm)。细胞杀伤活性(％)可以用(A-C)/(B-C)×100计算。其中，A是抗体存在下温育后的荧光强度，B是不含抗体只是培养液温育后的荧光强度，C是不含细胞的孔的荧光强度。
测定结果就象图24和25给出的那样。在FCM解析中没有与抗HM1.24抗体反应的K562即使添加抗HM1.24抗体也不引起细胞杀伤，与此相反，与抗HM1.24抗体反应的CCRF-CEM，CCRF-HSB-2，HPB-MLT，EB-3，MC116和CCRF-SB可以看到细胞杀伤依赖于抗HM1.24抗体的浓度。这一现象表明抗HM1.24抗体对细胞表面存在抗HM1.24抗体特异结合的抗原蛋白的淋巴细胞系肿瘤显示出CDC活性。实施例4.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠的抗肿瘤效果1.实验用抗体的制备1-1.抗HM1.24抗体的制备上述实施例1中得到的纯化抗HM1.24抗体用过滤灭菌的PBS(-)调整为1mg/ml，200μg/ml，用于以下实验。
1-2.对照小鼠IgG2a的制备上述实施例2中得到的纯化抗HM1.24抗体用过滤灭菌的PBS(-)调整为1mg/ml，用于以下实验。
2.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植小鼠的抗肿瘤效果2-1.人淋巴细胞系肿瘤移植鼠的制备人淋巴细胞系肿瘤移植鼠可以象以下那样制备。用含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的RPMI 1640培养基将使用SCID小鼠(日本クレア)体内(in vivo)传代的来自急性成淋巴细胞系白血病CCRF-HSB-2细胞(ATCC CRL-120.1)调整为1×108个/ml。将上述制备的细胞悬浊液注入于前一天腹腔注入了抗唾液酸基缺乏GM1(和光纯药工业制)100μl的SCID小鼠(雄性、6周龄)(日本クレア)的腹部皮下。
2-2.抗体注入肿瘤移植后第7天，用卡尺测量急性淋巴细胞肿瘤移植小鼠CCRF-HSB-2移植部位的肿瘤直径，算出肿瘤体积后，使各组的肿瘤体积的平均值大致相等那样进行分组(各组都是8只，共3组)。从同日开始，将上述1制备的1mg/ml或200μg/ml的抗HM1.24抗体，以及对照小鼠IgG2a各100μl注入各群鼠腹腔中。每周注入2次，同样注入总计进行19次。注入期间，每周两次用卡尺测量肿瘤直径，算出肿瘤体积。
2-3.抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植鼠抗肿瘤效果的评价关于抗HM1.24抗体抗肿瘤效果是用肿瘤体积的变化和小鼠的生存期间评价的。结果如图26所示的那样，抗HM1.24抗体注入组与对照鼠IgG2a注入组相比，其肿瘤体积的增加被抑制了。又如图27所示，抗HM1.24抗体注入组与对照鼠IgG2a注入组相比，可以看到其生存期间延长了。以上现象表明抗HM1.24抗体对人淋巴细胞系肿瘤移植鼠具有抗肿瘤效果。参考例1.产生小鼠抗HM1.24抗体杂交瘤的制备按照Goto，T.等，《血液》(Blood)(1994)84，1922-1930记载的方法制备产生鼠抗HM1.24抗体杂交瘤。
将取自人多发性骨髓瘤患者骨髓的浆细胞株KPC-32(1×107个)(Goto，T.等，《日本临床血液学杂志》Jpn.J.Clin.Hematol.(1991)32，1400)相隔6周向BALB/C小鼠(チヤ-ルスリバ-制)的腹腔内注入两次。
为了使小鼠的抗体效价进一步提高，在处死小鼠之前3天再向小鼠的脾脏内注入1.5×106个KPC-32(Goto，T.等，《德岛实验医学杂志》Tokushima J.Exp.Med.(1990)37，89)。在将小鼠处死后，摘出脾脏，按照Groth，de St.&Schreidegger的方法(《癌症研究》Cancer Research(1981)41，3465)，使摘出的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。
通过使用KPC-32的Cell ELISA(Posner，M.R.等，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)(1982)48，23)进行杂交瘤培养上清中的抗体的筛选。将5×104个的KPC-32悬浮于50ml的PBS中，分别注入96孔板(U型，Corning，Iwaki制)，于37℃风干过夜。用含有1％血清白蛋白(BSA)封闭后，加入杂交瘤培养上清，于4℃培养2小时。然后使其与过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体(Zymed制)反应，洗净后，于室温与间苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite制)反应30分钟。
用2N硫酸中止反应，用ELISA reader(Bio-Rad制)测定492nm处的吸光度。为了除去产生抗人免疫球蛋白抗体的杂交瘤，首先使阳性杂交瘤培养上清吸附于人血清，通过ELISA筛选对其它细胞株的反应性。选择阳性的杂交瘤，用流式细胞测量法研究对各种细胞的反应性。对最后选择的杂交瘤克隆进行2次克隆，再将它注入进行了降植烷处理的BALB/C小鼠的腹腔，取得腹水。
单克隆抗体可以通过硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析试剂盒(Ampure PA、Amersham)从小鼠的腹水中纯化。纯化抗体通过使用Quick Tag FITC结合试剂盒(Boehringer Mannheim制)进行FITC标记。
结果30个杂交瘤克隆产生的单克隆抗体可以与KPC-32和RPMI 8226反应。克隆后，考查这些杂交瘤的培养上清与其它细胞株或外周血液单核细胞的反应性。
其中有3个克隆是对浆细胞特异反应的单克隆抗体。这3个克隆中，在流式细胞测量法中最有用的，而且选择对RPMI 8226具有CDC活性的杂交瘤克隆，取名HM1.24。这个杂交瘤产生的单克隆抗体的亚类是通过使用了亚类特异的抗小鼠兔抗体(Zymed制)的ELISA确定的。抗HM1.24抗体具有IgG2aк亚类。产生抗HM1.24抗体的杂交瘤HM1.24于平成7年9月14日，以FERM BP-5233的名称，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目3号)进行国际保藏。参考例2.类人化抗HM1.24抗体的制备类人化抗HM1.24抗体通过下述方法得到。
从参考例1中制备的杂交瘤HM1.24中利用常规方法制备总RNA。通过聚合酶链式反应(PCR)法和5′-RACE法由总RNA合成、扩增编码小鼠抗体V区的cDNA，得到含有编码小鼠抗体V区基因的DNA片段，将这些DNA片段分别连接于各个质粒pUC系克隆载体中，导入大肠杆菌感受态细胞，得到大肠杆菌转化体。从该转化体可以得到上述质粒，通过常规方法可以确定质粒中的cDNA编码区的碱基序列，进而确定各个V区的互补决定区(CDR)。
为了制备表达嵌合抗HM1.24抗体的载体，将分别编码小鼠抗HM1.24抗体L链和H链V区的cDNA插入HEF载体。而为了制备类人化抗HM1.24抗体，利用CDR移植法将小鼠抗HM1.24抗体的V区CDR向人抗体移植。作为人抗体的L链用人抗体REI的L链，而关于作为人抗体H链的框架区(FR)1-3，使用人抗体HG3的FR1-3，对于FR4使用人抗体JH6的FR4。为了使移植了CDR的抗体形成恰当的抗原结合部位进行了H链V区的FR的氨基酸置换。
为了使这样制备的类人化抗HM1.24抗体的L链和H链的基因能在哺乳动物细胞中表达，将各个基因分别导入HEF载体，制备表达类人化抗HM1.24抗体的L链或H链的载体。
通过将这两个表达载体同时导入CHO细胞，建立了产生类人化抗HM1.24抗体的细胞株。通过Cell ELISA研究培养上述细胞株得到的类人化抗HM1.24抗体对来自人羊膜的细胞株WISH的抗原结合活性和结合抑制活性。结果类人化抗HM1.24抗体具有与嵌合抗体同等的抗原结合活性，即便就使用了生物素化小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性来说，也具有与嵌合抗体或鼠抗体同等的活性。
另外，含有编码嵌合抗HM1.24抗体的L链V区和H链V区的DNA质粒的大肠杆菌分别以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)的名称于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1号)进行国际保藏，保藏号分别为FERM BP-5246，FERM BP-5644。含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区a区(序列号2)以及H链V区r区(序列号3)的DNA的质粒大肠杆菌分别作为Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和Escherichiacoli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)于平成8年8月29日，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1号)，保藏号分别为FERM BP-5645，FERM BP-5643。另外含有编码类人化抗HM1.24抗体的L链V区s区(序列号4)DNA质粒的大肠杆菌作为Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)于平成9年(1997年)9月29日，按照布达佩斯条约保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1丁目1号)，保藏号为FERM BP-6127。参考例3.HM1.24抗原蛋白质cDNA的克隆对编码抗HM1.24抗体特异识别的HM1.24抗原蛋白质进行克隆。
1.cDNA文库的制备1)总RNA的制备根据Chirgwin等人(生物化学(Biochemistry)，18，5294(1979))的方法从人多发性骨髓瘤细胞株提取总RNA。即将2.2×108个KPMM2于20ml的4M的胍基硫氰酸盐(ナカライテスク制)中使其充分匀浆。
将匀浆液加到离心管中的5.3M氯化铯溶液上，然后在Beckman SW40转子中用301,000rpm于20℃离心24小时，使RNA沉淀。用70％乙醇洗RNA沉淀物，然后溶解于含有1mM EDTA和0.5％SDS的10mMTris-HCl(pH7.4)300μl中，然后加入最后浓度达到0.5mg/ml的链霉蛋白酶(Boehringer制)，于37℃温育30分钟。混合物用苯酚和三氯甲烷萃取，用乙醇使RNA沉淀。RNA沉淀物溶解于含有1mM EDTA的10mMTris-HCl(pH7.4)200μl中。
2)poly(A)+RNA的制备以上述那样制备的总RNA中的大约500μg作为材料，使用Fast Track2.0 mRNA Isolation Kit(Invitrogen制)，按照试剂盒附带的处方纯化poly(A)+RNA。
3)cDNA文库的构建以上述poly(A)+RNA 10μg作为材料用cDNA合成试剂盒TimeSavercDNA Synthesis Kit(Pharmacia制)，按照试剂盒附带的处方合成双链cDNA，再用Directional Cloning Toolbox(Pharmcia)，用试剂盒附带的EcoRI结合体按照试剂盒附带的处方连接。EcoRI连接体的カイネ-シヨン以及限制酶NotI处理都是按照试剂盒附带的处方进行。另外用1.5％低熔点的琼脂糖凝胶(Sigma制)分离、纯化大约500bp以上的大的带有连接体的双链cDNA，得到带有连接体的双链cDNA约40μl。
象上面那样制备的带有连接体的双链cDNA用事先经限制酶EcoRI和NotI及碱性磷酸酶(宝酒造制)处理的pCOSI载体(特愿平8-255196)和T4DNA连接酶(GIBCO-BRL制)连接，构建cDNA文库。构建的cDNA文库转入大肠杆菌细胞株DH5α(GIBCO-BRL制)，据推测总转化数大约是2.5×106个独立的克隆。
2.通过直接表达法进行克隆1)转染COS-7细胞上述转化的大约2.5×105克隆大肠杆菌通过在含有50μg/ml的氨苄青霉素的2-YT培养基(《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningALaboratory Mannual.)Sambrook等人、冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))，进行cDNA扩增，利用碱法(《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Mannual.)Sambrook等人、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))从大肠杆菌中回收质粒DNA。得到的质粒DNA用Gene Pulser装置(Bio-Rad制)通过电穿孔法转染COS-7细胞。
即，将纯化的质粒DNA 10μg加到悬浮于PBS中的COS-7细胞液0.8ml(1×107细胞/ml)，以1500V，25μFD容量加脉冲。于室温下经10分钟恢复期间后，经电穿孔处理的细胞于含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL制)的DMEM培养液(GIBCO-BRL制)中，在37℃，5％CO2的条件下培养3天。
2)淘选盘(パンニングデイツシユ)的制备根据B.Seed等人(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，84，3365-3369(1987))的方法制备铺了小鼠抗HM1.24抗体的淘选盘。即，将鼠抗HM1.24抗体加到50mM Tris-HCl(pH9.5)中，溶液中抗体最后浓度为10μg/ml。将这样制备的抗体溶液3ml加到直径60mm的细胞培养皿中，于室温培养2小时。用0.15M NaCl溶液洗3次后，加入含有5％胎牛血清、1mMEDTA、0.02％NaN3的PBS，封闭后，用于下面的克隆。
3)cDNA文库的克隆象上述那样转染的COS-7细胞通过含有5mM EDTA的PBS剥离，用含有5％胎牛血清的PBS洗一次后悬浮于含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS中，使细胞的密度变为1×106细胞/ml，然后加到上述那样制备的淘选盘中，于室温培养2小时。用含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS温和地洗三次后，然后用含有0.6％SDS和10mM EDTA的溶液从结合于淘选盘上的细胞进行质粒DNA的回收。
回收的质粒DNA再转化导入大肠杆菌DH5α，象上述那样使质粒DNA扩增后，用碱法回收。回收的质粒DNA通过电穿孔法转染COS-7细胞，与上述一样从结合的细胞回收质粒DNA。同样的操作再重复一次，回收的质粒DNA用限制酶EcoRI和NotI消化，结果可以确认大约0.9kbp大小的插入片段被浓缩。将转化导入了回收的质粒DNA的一部分的大肠杆菌接种于含有50μg/ml的氨苄青霉素的2-YT琼脂板，培养过夜后，从单一的菌落回收质粒DNA。用限制酶EcoRI和NotI消化，得到显示插入片段的大小大约为0.9kbp的克隆p3.19。
就本克隆用PRISM，Dye Terminater Cycle Sequencing试剂盒(PerkinElmer制)，根据试剂盒附带的处方进行反应，通过ABI 373A DNA测序仪(Perkin Elmer制)确定碱基序列。该碱基序列和对应的氨基酸序列表示在序列号1中。
FCM解析的结果表明，抗HM1.24抗体可以与来自几乎所有的人淋巴细胞系肿瘤的细胞进行强烈的反应。这表示在许多淋巴细胞系肿瘤中，强烈地显示出具有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位的多肽。另外，在移植了与抗HM1.24抗体反应的人淋巴细胞系肿瘤移植鼠实验中，确认通过抗HM1.24抗体的注入抑制了肿瘤体积的增加，而且生存期间延长。从这些现象表明抗HM1.24抗体或识别具有抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位的多肽的抗体对很多淋巴细胞系肿瘤表现出细胞杀伤活性，其结果对淋巴细胞系肿瘤患者的治疗非常有用。
根据《专利合作条约》细则13条之二的微生物的保藏以及保藏机构、保藏机构 名称工业技术院生命工学工业技术研究所地址日本国茨城县筑波市东1丁目1-3微生物(1)名称Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)保藏号FERM BP-4434保藏日1993年10月5日(2)名称杂交瘤HM1.24保藏号FERM BP-5233保藏日1995年9月14日(3)名称Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)保藏号FERM BP-5643保藏日1996年8月29日(4)名称Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)保藏号FERM BP-5644保藏日1996年8月29日(5)名称Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHN-gκ)保藏号FERM BP-5645保藏日1996年8月29日(6)名称Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏号FERM BP-5646保藏日1996年8月29日(7)名称Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)保藏号FERM BP-6127保藏日1997年9月29日序列表序列号1序列长度1013序列类型核酸链数一条链拓扑学直链型序列种类cDNAGAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC49Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys1 5AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10 15 20 25ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG145Ile GIy Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu30 35 40ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC 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CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC 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Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120
权利要求
1.淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂，含有以能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合的，而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分。
2.权利要求1记载的治疗剂，其中淋巴细胞系肿瘤是T细胞肿瘤。
3.权利要求1记载的治疗剂，其中淋巴细胞系肿瘤是B细胞肿瘤(骨髓瘤除外)。
4.权利要求1记载的治疗剂，其中的抗体是单克隆抗体。
5.权利要求1记载的治疗剂，其中的细胞杀伤活性是ADCC活性。
6.权利要求1记载的治疗剂，其中的细胞杀伤活性是CDC活性。
7.权利要求4记载的治疗剂，其中的抗体具有人抗体恒定区Cγ。
8.权利要求7记载的治疗剂，其中的人抗体恒定区Cγ是Cγ1或Cγ3。
9.权利要求4记载的治疗剂，其中的抗体是抗HM1.24抗体。
10.权利要求4记载的治疗剂，其中的抗体是嵌合抗体或类人化抗体。
11.权利要求9记载的治疗剂，其中的抗体是嵌合抗HM1.24抗体。
12.权利要求9记载的治疗剂，其中的抗体是类人化抗HM1.24抗体。
13.权利要求1记载的治疗剂，其中的抗体是与抗HM1.24抗体识别的抗原决定部位特异结合的抗体。
14.能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合的，而且具有细胞杀伤活性的抗体。
15.权利要求13记载的抗体，其中的细胞杀伤活性是ADCC活性。
16.权利要求13记载的抗体，其中的细胞杀伤活性是CDC活性。
全文摘要
能与具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质特异结合的,而且具有细胞杀伤活性的抗体为有效成分的淋巴细胞系肿瘤(骨髓瘤除外)治疗剂。
文档编号C07K14/47GK1250381SQ98803379
公开日2000年4月12日 申请日期1998年2月12日 优先权日1997年2月12日
发明者小石原保夫, 吉村康史 申请人:中外制药株式会社