专利名称：针对囊依赖的淋巴细胞白血病基因的反义核酸的抑癌作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制人体肿瘤细胞生长的寡核苷酸，具体地讲涉及抑制人体肿瘤生长的针对囊依赖的淋巴细胞白血病—2(B细胞白血病—2，Bcl—2)的反义寡聚脱氧核苷酸及含有所述的寡核苷酸的组合物，以及将所述的寡聚核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明所阐述的寡核苷酸，其碱基排列顺序与人体Bcl—2基因的一段序列互补，这些寡核苷酸在细胞内特异地与人体Bcl—2基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交，从而阻止Bcl—2基因编码的Bcl—2蛋白表达，达到抑制肿瘤细胞生长的作用(Shinichi kitada，Antisense Research and Development．471—79，1994)。
Bcl—2基因主要存在于细胞的线粒体内膜、核膜、内质网膜等细胞器中，分布很广，存于淋巴细胞、未成熟的造血干细胞，上皮细胞、神经细胞等。Bcl—2基因于1984年Tsujimoto从淋巴瘤病人B淋巴细胞中发现。Bcl—2基因对细胞凋亡有明显的抑制作用，并与肿瘤的耐药性密切相关。现已发现许多与Bcl—2基因同源的基因，有Bcl—2、Bcl—XL、BAX、BAK、AI、MCL1、LMWS—HL、BHRF1、CED—9等。该基因家族的共同点是有两个保守序列BH1、BH2(Bcl—2homologuel 1 and 2)，用点突变技术替代BH1 145位甘氨酸和BH2 155位的色氨酸，改变后的Bcl—2失去抗辐射及抗糖皮质激素引起凋亡的能力。
Bcl—2基因有3个外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中Ⅰ不翻译，Bcl—2的开放读框位于Ⅱ和Ⅲ的结合区，在Ⅰ和Ⅱ之间有220bp的内含子，在Ⅱ和Ⅲ之间有370bp的内含子。外显子Ⅱ及外显子Ⅰ内剪接位点的5’端都有启动子，用不同的启动子可产生由Ⅰ、Ⅱ或Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组成的不同mRNA。
Bcl—2基因可加速细胞分裂、细胞增殖、维护细胞生存、延长细胞寿命，导致细胞数目增加。实验表明Bcl—2转染的细胞存活时间大大增长，Bcl—2抗细胞凋亡机理表明其可调节细胞的氧化还原状态，与BAX结合成杂二聚体，抑制BAX的促调亡作用，影响细胞钙离子的重新分布。钙离子激活内源性的内切酶和谷氨酰胺转移酶，抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆。细胞色素C是促进调亡的，在细胞调亡中，线粒体膜有去极化作用，通透性改变，细胞色素C从而流出线粒体膜外，进入胞浆，从而促进细胞死亡。
Bcl—2分子异常表达有促进肿瘤形成的作用，常见于T、B淋巴瘤的发生过程。90％的B细胞滤泡淋巴瘤病人中有t(14；18)的易位，这样14q32上的Ig重链Jh段基因与18q21上有转录活性的Bcl—2基因并置，使Bcl—2基因在Ig重链Jh段的调控下高表达，而且Bcl—2在转基因动物中过量表达，可干扰过氧化物的产生和脂膜的过氧化作用，从而抑制氧化物应激诱导的细胞死亡。
Bcl—2在许多类型的人类肿瘤中被表达而且促进其转录，26K道尔顿Bcl—2蛋白被封闭可以导致细胞程序化死亡(Michael．L．cleary，Cell(47)10．1986．19—28)。Bcl—2通常在非何杰金淋巴瘤上表达可以引导抵抗程序化细胞死亡和促进肿瘤生长(Webb．D．Cunningham．TheLancet．349．April．19．1997，1137—1141)。如果用反义寡聚核苷酸攻击Bcl—2的mRNA，可以使Bcl—2表达下降，从而使程序化细胞死亡增加，这样可以有效的抑制肿瘤的生长(Fionna．J．Keith，Leukemia 1995．9．131—138)。
Bcl—2基因与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肾脏损伤、心血管系统疾病、肿瘤等有关，如肾小球肾炎中系膜增殖型肾小球肾炎，发现能表达细胞凋亡的抑制基因Bcl—2的细胞数与细胞增殖有明显的相关性。试验证明，Bcl—2过量表达可以使肾小球肾炎中系膜细胞数目增多，增殖时间延长。
上述有关Bcl—2基因在肿瘤发生中起作用的研究使得人们将Bcl—2基因作为肿瘤治疗用药的靶点。大量的筛选工作表明，可以筛选出许多分子，其中大多数作用于细胞器的活性部位或调节位点。希望筛选出的分子可以作为抗癌药物，能够发挥与现存的抗癌药不同的药物机理，而且这些分子可以产生细胞生长抑制但不产生细胞毒性。然而很大的不利点在于这些化合物虽然有时对Bcl—2基因是特异性的，但对其他基因却显示不出很强的选择能力。Bcl—2基因在肿瘤发生和生长调控方面的深入研究还在进一步进行，是否能够通过针对Bcl—2基因的调控来抑制肿瘤的生长还要不断研究，否则会造成与肿瘤发生无关的针对Bcl—2基因调控的很多不希望出现的副作用。
我们所选择的反义核酸是通过与Bcl—2的mRNA互补杂交，通过多种机制来抑制mRNA表达Bcl—2蛋白。由于反义核酸可特异性的结合目标mRNA，可以设计出一种反义核酸，要求其与肿瘤发生有关的Bcl—2的mRNA互补，高度的特异性选择亦可使之不产生目前其他药物所产生的毒副作用。
本发明在细胞培养中筛选出对Bcl—2特异的反义核酸，结合于Bcl—2基因的mRNA 3’端非翻译区，显示出对Bcl—2的mRNA表达蛋白质的抑制。目前研究表明Bcl—2基因表达下降，可以促进程序化细胞死亡，进而抑制肿瘤生长，达到治疗目的。
本发明的目的之一是能够提供一种反义寡聚脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，其特征在于可特异性结合Bcl—2基因的mRNA的不同区域。
本发明的另一目的是提供含有本发明反义寡聚核苷酸的药物组合物。
本发明的另一目的是提供了本发明反义寡聚核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明还设计了一系列可以结合于Bcl—2基因的Bcl—2的mRNA的不同区域的反义核酸分子，在细胞培养中筛选对Bcl—2基因表达特异性抑制的反义核酸。细胞培养采用A549细胞，设立一个阴性对照PAC23b，两个阳性对照PAC14、PAC66，所有进行筛选的反义核酸分子长度均为20个核苷酸。筛选结果表明其中九个反义核酸均具有不同程度的抑制人体肿瘤细胞生长的特性，将它们分别定名为PAC60、PAC61、PAC62、PAC63、PAC64、PAC67、PAC68、PAC69、PAC70，其中PAC63能最大地抑制人体肿瘤细胞生长的活性。
具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的PAC系列反义寡聚核苷酸碱基组成及顺序如下所示PAC60 5’—AGT CCG GTA TTC GCA GAA GT—3’ 20merPAC61 5’—CAA TGT ATT AAG CTG CCT GG—3’ 20merPAC62 5’—GTC TAC TTC CTC TGT GAT GC—3’ 20merPAC63 5’—CGC GGA ACA CTT GAT TCT GG—3’ 20merPAC64 5’—AGG AGT TAT AAT CCA GCT AT—3’ 20merPAC67 5’—CAG TAA ATA GCT GAT TCG AC—3’ 20merPAC68 5’—TCC GTC TGC TCT TCA GAT GG—3’ 20merPAC69 5’—CGA TCT CGG ACC TGT GGC CT—3’ 20mer
PAC70 5’—TTC GCC GGC TCC ACA GCC TC—3’ 20mer设立阳性对照两个，PAC14C和PAC66，其序列如下所示PAC14 5’—TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT—3’ 20merPAC66 5’—TCT CCC AGC GTG CGC CAT—3’18mer设立阴性对照一个PAC23，其序列如下所示PAC23 5’—CAC GGT GCG TCG ACG CAC TA—3’ 20mer以上所设计的反义寡聚核苷酸除PAC66是18个核苷酸外，其余均是长度为20个核苷酸并经过硫代修饰的寡聚核苷酸，攻击目标为人体Bcl—2基因的信使核糖核酸(mRNA)。这段反义核苷酸可以在细胞质中与Bcl—2基因的信使核糖核酸(mRNA)特异性结合，从而阻断Bcl—2基因编码的Bcl—2蛋白的表达，促进细胞程序化死亡，这样可以最终达到抑制肿瘤生长的作用。本发明所设计的反义核苷酸序列是通过与Bcl—2基因的mRNA的特异性杂交来发挥其特有的生物学特性。从目前来看，核酸杂交中RNA与mRNA的杂交亲和力比DNA与mRNA的杂交亲和力要高，在医学药用价值上具有很高的地位。但是由于人工合成DNA又远远比合成RNA的成本要低的许多，根据医药市场的需要以及临床应用的成本要求，目前在临床试验应用的反义药物均为DNA。合成RNA的成本居高不下，随着科技的不断进步和技术的改进，合成RNA的成本将会在未来有所降低，有望在临床上应用。合成的寡聚核糖核酸(RNA)和核糖核酸RNA单体与脱氧核糖核酸(DNA)单体嵌合相连而成的反义核酸将作为新药进行开发。
本发明设计的反义核酸药物，其序列具有特异性生物学活性。对于某一基因位点互补的反义核酸与互补长度有很大关系，如互补的长一些，则生物学活性就高一些，治病的效果就会好一些，但人工合成的反义核酸的成本就会增加，这样就不符合反义核酸作为药用的目的。此发明均采用经过筛选的20个碱基长度的反义核酸序列，增加或减少一个至数个碱基而互补于同一基因位点的反义核酸，同样也会具有不同程度的生物学活性，也可达到不同程度的治病作用。同时互补于相同基因位点附近的反义核酸结合部位有不同程度的重叠，这些可以认为具有不同程度的序列同源性，也同样具有不同程度的相同生物学活性。
现在反义核酸研究中各种化学修饰方法很多，之所以采用硫代修饰的反义核酸，主要是硫代的反义核酸的药理学、药代动力学、毒理学等临床前研究是各种化学修饰的反义核酸中研究最为全面的。硫代反义核酸在体内可以有效的防止人体内大量核酸外切酶对反义核酸的酶切降解作用，使反义核酸保持其应有的生物学活性。此外硫代的反义核酸还可激发RNA酶的活性，降解与之杂交的RNA链，因此选用硫代修饰的特定设计的反义核酸都具有不同程度的生物学活性。
综上所述，互补于Bcl—2基因mRNA不同区域的反义核酸具有抑制人体肿瘤细胞生长的特性，在临床上治疗肿瘤具有很广泛的应用价值。经过化学修饰筛选出不同长度和不同程度同源性的反义核酸序列，可发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。可以将本发明的反义核酸与药用载体结合，用于动物(包括哺乳动物和人)。所用的药用载体可为磷酸盐缓冲液(PH7．4)以及其他常用的载体和缓冲液。图例说明
图中反义核酸PAC系列对Bcl—2基因表达的抑制结果(WesternBlotting)。
将A549细胞株分成对照组(无处理)和反义核酸处理组，在含10％胎牛血清的HAM’S S／F—12培养液中培养，培养至细胞总数为10万时，将细胞培养液换成无血清培养液，除对照组外其余组加入20ug／ml的脂质体和终浓度为800 nM的不同序列的硫代反义核酸处理5小时，再换成普通培养液，恢复20小时。用NP40裂解缓冲液提取蛋白，在200V电压、12％的SDS—PAGE上电泳，转移至Hybond尼龙膜上。Western分析，一抗用鼠抗Bcl—2抗体，二抗用羊抗鼠抗体(上面结合AP)，显色用Promega公司的BCIP／NBT。
图中0号样品为无处理空白对照，23号样品为阴性对照，其他为不同的PAC系列反义核酸的样品。由图可见，PAC系列反义核酸对Bcl—2的表达具有不同的抑制能力，其中以PAC60的抑制程度最高。
图2反义核酸PAC系列对人体肿瘤细胞株A549生长抑制将A549细胞分成空白组、阳性对照组、阴性对照组和PAC系列反义核酸处理组。分别用10％胎牛血清的HAM’S S／F—12培养液中培养至细胞总数为10万时，换成无血清培养液，除空白外，其余组均分别加入10ug／ml的脂质体和终浓度为800的不同硫代反义核酸处理5小时，再换成正常的含10％的胎牛血清的培养液，在37℃下继续培养。66小时后进行细胞计数，用MTT法测定细胞生长程度。以空白组数值为100％，作出细胞生长抑制图，从图中可见，黑色柱体代表针对Bcl—2基因的阳性反义核酸结果，灰色柱体为阴性对照反义核酸结果，白色柱体为针对Bcl—2基因的PAC系列反义核酸结果。其中PAC66为针对Bcl—2基因的阳性对照反义核酸结果，图中的PAC系列的反义核酸对细胞生长均有不同程度的抑制，其中以PAC63抑制程度最高。
实施例1反义核酸攻击靶位目标的确定及反义核酸的合成使用美国PE公司应用生物系统部(Applied Biosystems)制造的391—04型DNA—RNA合成仪。以亚磷酸酰胺固相合成硫代的反义核酸。
合成原料购自美国Glen公司，主要原料有四种二异丙基—氰乙基亚磷酸酰胺单体脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、脱氧胸苷(dT)。
四种控制孔径玻璃粉(CPG)。固相合成柱(A、C、G、T)，规模为10微摩尔。
盖帽试剂盖帽试剂A乙酸酐、二甲基吡啶、四氢呋喃盖帽试剂B一甲基咪唑、四氢呋喃硫代反应试剂Beaucage试剂、乙腈脱三苯甲基试剂三氯乙酸、二氯甲烷液体试剂乙腈、三氯甲烷合成规模为10微摩尔，碱基单体溶于无水乙腈中，浓度为100毫摩尔，其它试剂浓度及用量均按照仪器手册进行。
合成过程仪器本身可以用程序控制。
合成产物用浓氨水(28％)切割下来收集在密封耐压的玻璃瓶中，于55℃处理15小时脱去反义核酸分子上的各种羟基保护基团和氨基保护基团。脱保护结束后，挥发除去大部分氨气，冻干得白色粉末状粗品，重新溶于缓冲液中，用Pharmacia Source 30Q层析柱及AKTA层析系统进行纯化，纯化样品用G—15分子筛葡聚糖凝胶层析柱除盐，冻干得白色絮状反义核酸纯品，储存于一30℃。取少量样品进行如下分析1、用毛细管电泳法测其纯度及分子量；2、用高效液相层析法测其纯度；3、DNA测序法测定其序列准确度；4、P31NMR(核磁共振)法测定其硫代程度；毛细管电泳法及高效液相法纯度分析结果显示Pac系列反义核酸纯品纯度均大于90％。
序列测定证明Pac系列反义核酸序列与设计序列相同。
P31NMR分析显示Pac系列反义核酸硫代率大于98．5％。
实施例2针对Bcl—2的Pac系列反义核酸在培养细胞中对Bcl—2表达的抑制选用人体肺癌细胞株A549作为筛选实验用细胞株，参照Miwa．W等的文献(Miwa．W．et，al．1994 Biologicai Chemistry Lipopeseyler，375(10)705—709)，将试验分组为空白无处理组、阴性对照组、阳性对照组、反义核酸处理组。将A549细胞株在含10％胎牛血清的HAM’S S／F—12培养液中培养，培养至细胞总数为10万时，将细胞培养液换成无血清培养液，除对照组外其余组加入20ug／ml的脂质体和终浓度为800 nM的不同序列的硫代反义核酸处理5小时，再换成普通培养液，恢复20小时。用NP40裂解缓冲液提取蛋白，在200V电压、12％的SDS—PAGE上电泳，转移至Hybond尼龙膜上。Western杂交分析参照Sambrook．J等编写的Molecular CloningA Loboratory Manual．2nd．ed ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y．。杂交中一抗用鼠抗Bcl—2抗体，二抗用羊抗鼠抗体(上面结合AP)，显色用Promega公司的BCIP／NBT。
杂交的结果由Pharmcia Image Master扫描仪定量得出。以无处理对照组细胞的Bcl—2杂交带含量为100％，结果如
图1所示。图中0号样品为无处理空白对照，23号样品为阴性对照，其它为不同的PAC系列反义核酸的样品。由图可见，PAC系列反义核酸对Bcl—2的表达具有不同的抑制能力，其中以PAC60的抑制程度最高。
实施例3 Pac63的化学组成结构参照Nucleic Acids Research．1995，Vol24，No2．P4219—4223的方法对Pac63进行序列测定，结果如下PAC635’—CGC GGA ACA CTT GAT TCT GG—3’与设计序列一致，以毛细管电泳法测定Pac63的分子量，结果为6416，与理论分子量6418近似相等。
Pac63是20个脱氧核苷以磷酸硫酯键相连的反义核酸，其攻击的靶向目标是Bcl—2基因的mRNA。
实施例4 MTT法测定反义核酸Pac系列对人体肿瘤细胞株A549生长的抑制将A549细胞分为空白组、阳性对照组和Pac系列反义核酸处理组，分别在含10％的胎牛血清的HAM’s S／F—12培养液中培养至细胞总数为10万。换成无血清培养液，除空白组外，其余组均分别加入10ug／ml的脂质体和终浓度为800nM的各自不同的反义核酸处理5小时，换成正常含10％的胎牛血清的培养液，在37℃继续培养。66小时后进行细胞计数，用MTT法测定细胞生长程度。以空白组数值为100％，作出细胞生长抑制图。图中可见，黑色柱体代表针对Bcl—2基因的阳性对照反义核酸结果，灰色柱体为阴性对照反义核酸结果，其余的白色柱体为针对Bcl—2基因的Pac系列反义核酸结果，其中Pac66为针对Bcl—2基因阳性对照反义核酸结果。图中的Pac系列反义核酸对细胞生长均有不同程度的抑制，其中Pac63抑制程度最高。
实施例5含反义核酸的药物组合物作为动物体内给药的反义核酸药物组合物组成如下反义核酸Pac6310mg／ml一水合磷酸一氢钠 1．73mg／ml七水合磷酸氢二钠 14．33mg／ml氯化钠 4．4mg／ml注射用水 适量本发明中其它几种反义寡聚核苷酸也采用同样配方。
勿用赘言，本发明的反义核酸很大程度上能通过不同的化学修饰、采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。它可单独使用或与其它药物联合使用进行肿瘤的治疗，这些对在本领域的普通技术人员看来是显而易见的。
序列表(1)、一般情况(ⅲ)序列总数9(1)．第1号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第1号序列 PAC60AGT CCG GTA TTC GCA GAA GT 20(2)．第2号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第2号序列 PAC61CAA TGT ATT AAG CTG CCT GG 20(3)．第3号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第3号序列 PAC62GTC TAC TTC CTC TGT GAT GC 20(4)．第4号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第4号序列 PAC63CGC GGA ACA CTT GAT TCT GG 20(5)．第5号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第5号序列 PAC64AGG AGT TAT AAT CCA GCA GCT AT 20(6)．第6号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第6号序列 PAC67CAG TAA ATA GCT GAT TCG AC 20(7)．第7号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第7号序列 PAC68TCC GTC TGC TCT TCA GAT GG 20(8)．第8号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第8号序列 PAC69CGA TCT CGG ACC TGT GGC CT 20(9)．第9号序列情况(ⅰ)．序列特征(A)．长度20个碱基(B)．类型核酸(C)．链接单链(D)．构型线性(ⅱ)．分子类型脱氧核酸(ⅳ)．是否反义核酸是(ⅹⅰ)．序列说明第9号序列 PAC70TTC GCC GGC TCC ACA GCC TC20
权利要求
1.一种寡聚反义脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其特征在于可特异性结合人体B细胞白血病—2(Bcl—2)基因的不同区域，所述寡聚核苷酸序列选自1． PAC60 5’—AGT CCG GTA TTC GCA GAA GT—3’2． PAC61 5’—CAA TGT ATT AAG CTG CCT GG—3’3． PAC62 5’—GTC TAC TTC CTC TGT GAT GC—3’4． PAC63 5’—CGC GGA ACA CTT GAT TCT GG—3’5． PAC64 5’—AGG AGT TAT AAT CCA GCT AT—3’6． PAC67 5’—CAG TAA ATA GCT GAT TCG AC—3’7． PAC68 5’—TCC GTC TGC TCT TCA GAT GG—3’8． PAC69 5’—CGA TCT CGG ACC TGT GGC CT—3’9． PAC70 5’—TTC GCC GGC TCC ACA GCC TC—3’及其同源序列。
2.权利要求1中的反义核酸，其中所述同源序列与序列1—9有至少70％的同源性。
3.权利要求1中的反义核酸，其中所述同源序列与序列1—9有至少80％的同源性。
4.权利要求1中的反义核酸，其中所述同源序列与序列1—9有至少90％的同源性。
5.含有权利要求1中的反义核酸序列及可药用载体的药物。
6.权利要求1中的反义核酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
全文摘要
本发明涉及用化学方法合成系列序列特异的反义核酸,其碱基排列顺序与人体内B细胞白血病－2基因(Bcl－2)的一段序列互补。这些寡核苷酸可以在细胞内特异地与人体Bcl－2基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交,从而阻止Bcl－2基因编码的Bcl－2蛋白的表达,达到抑制肿瘤细胞生长的作用,这些反义寡聚核苷酸可用来发展成为抑制人体肿瘤生长的药物。
文档编号C07H21/00GK1279243SQ9910936
公开日2001年1月10日 申请日期1999年6月25日 优先权日1999年6月25日
发明者胡前进 申请人:北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司