专利名称：检测急性b淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞表型确认过程中的专用试剂盒，具体涉及一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用。
背景技术：
随着治疗策略的改进和新的化疗药物不断出现，急性淋巴细胞白血病(Acut elymphoblastic leukemia, ALL)的缓解率和生存率有了很大的提高,但是仍有一部分患者预后较差，最终死于复发。复发后即使采用强化疗、甚至造血干细胞移植，仍然难以挽回患者的生命，给社会和家庭都造成了极其沉重的精神和经济负担。研究证明，治疗后微量残留病(MRD)的水平是复发的根源。 多参数流式细胞术(flow cytometry, FCM)是MRD检测的常用方法之一,该方法是根据患者发病时的免疫标志，确定该患者白血病细胞的特异性标志，亦称为白血病相关免疫表型(LAIP)，通过对LAIP的识别来检测MRD。目前，国内外的文献主要采用三色或四色的抗体组合来检测LAIP，不同的研究机构采用不同的抗体组合，抗体选择多样化、分析时设门的方法也不一致。例如，欧洲主要报道了 5组三色的抗体组合，共应用15个抗体；美国St. jude儿童研究医院则利用多组四色抗体组合。为了提高检测的灵敏度，三色FCM或四色FCM常常需要多组抗体组合，每组抗体组合中均有相同的抗体，这样一方面增加了抗体总数目，进而增加了试验成本和患者的经济负担；另一方面多组抗体组合需要在多管中分别检测，影响了对检测抗体的多参数分析在分析LAIP时，有时需要多个标志设门来限定一群细胞，例如第一管抗体组合中发现一群可疑LAIP阳性细胞，表型为⑶45+⑶19+⑶10+CD3C，但此群细胞数较低(< 1(Γ4)，此时往往需要观察此群细胞中其他抗原是否表达异常，以确定是否存在LAIP ;但四色组合无法同时检测第4种以外的抗体，从而影响了检测的准确性；若要观察此群细胞的第五种或其他的抗原表达是否有异常，利用四色FCM则无法完成。为了提高LAIP检测的灵敏度，需要能够同时检测多个荧光参数的FCM、以及设计合适的更多荧光参数的抗体组合。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用，所述试剂盒采用七种荧光标记的抗体组合，利用该剂盒、并借助七色流式细胞仪的辅助，可快速准确地分析LAIP的种类、性质及判断LAIP阳性细胞水平，对预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是
一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病相关免疫表型分类装备，该试剂盒中配置了下述单克隆抗体试剂组合⑶58、⑶10、⑶34、CD123、CD38、CD19 和 CD45。优选的，所述单克隆抗体试剂组合⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为FITC、PE、Percp-CY5.5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和 Pacific Blue。本发明还提供了上述试剂盒在制备检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的产品中的应用。借助于上述的试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型进行分析的方法，包括下述步骤
步骤一、试剂配制1.1、配制pH为7. 2 7. 4的10XPBS缓冲液，并稀释10倍成为IXPBS缓冲液，1. 2、取溶红细胞液，并用IXPBS缓冲液稀释10倍，
1.3、取小牛血清加入至I XPBS缓冲液中，制备含O. 5wt. 9T2wt. %血清的PBS ； 步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本
2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下3μΙΧ058-ΡΙΤ(、10 μ LCD10-PEU μ L CD34-PerCP-CY5. 5、I μ LCD123_PE_CY7、2 μ L CD38_APC、5 μ LCD19-APC-Cy7和1. 3μ L CD45_Pacific Blue，然后再加入100 μ L骨髓标本，混匀，室温避光放置15分钟孵育，
2.2、加入步骤1. 2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置8分钟，溶解红细胞，
2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1. 3中2mL含O. 5wt. %"2wt. %血清的PBS，混匀，
2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中O. 3mLl X PBS缓冲液，混匀，制成待测标本；
步骤三、按照七色流式细胞仪的操作要求对待测标本进行处理后检测，获得特异性荧光标记的骨髓细胞数据，用MACSQuant分析软件、在SSC/⑶19和⑶45/⑶19双参数点图中对⑶19+细胞进行连续两次设门，并进一步在⑶19+细胞中对⑶19+⑶38 +的浆细胞设门以去除浆细胞，最终的CD19+B细胞为待测的细胞，并与正常骨髓细胞CD19+B祖细胞表型进行比较。采用上述试剂盒、并借助七色流式细胞仪分析B细胞来源急性白血病治疗前和治疗后肝素抗凝骨髓细胞中，是否具有LAIP细胞、LAIP细胞的表型及LAIP细胞的数量。该分析基于下列患者(1)初诊B-ALL的患者294例；(2)慢性髓细胞白血病(Chronicmyelocytic leukemia, CML) -B细胞急性变患者20例；(3)复发的B-ALL患者70例(20例无发病免疫表型结果)；(4)治疗后MRD+患者146例。其中LAIP的表现包括⑶45和⑶38的弱表达或不表达KDlO的强表达；及在⑶34+TdT+⑶10+分化阶段时不表达⑶10 ；⑶19、CD34、CD123、CD58强表达。结果表明294例初诊B-ALL患者、20例CML-B细胞急性变、70例复发B-ALL患者中，LAIP阳性率占99. 22%、其中92. 2%患者的LAIP表现为两种抗原的表达异常。上述结果表明采用本发明的试剂盒对LAIP的检测具有较高的敏感性和特异性。在146例MRD+患者的328份标本中均存在LAIP+，LAIP的表型特征与治疗前的相似。充分证明本发明的试剂盒适用于99%以上初诊的及治疗后的B细胞来源的急性白血病患者LAIP表型的判断和分析，为临床检测MRD提供依据。采用上述技术方案产生的有益效果在于(1)本发明的试剂盒首次采用7种标记有不同荧光素的抗体组合，能够同时分析7个抗原的特点，经过大量的临床验证证明，在B细胞来源的急性淋巴细胞白血病中LIAP的阳性率达到99%以上，可快速、准确地检测初诊为B-ALL患者、CML-B细胞急性变、复发B-ALL患者和MRD+患者骨髓中LAIP细胞，为B淋巴细胞白血病LAIP分析提供了一种可靠的、新的荧光标记的单克隆抗体组合；(2)本发明采用较少的抗体、能够检出较多的LAIP细胞，降低了试验成本和患者的经济负担，而且单管中抗体的种类增多、增加了检测的灵敏度和准确性；(3)采用本发明的试剂盒可以不依赖于发病时的免疫表型资料，扩大了 LAIP分析的范围和能力，简化了分析的前期条件，为临床检测MRD提供了更多的机会；(4)利用本试剂盒中的一组抗体组合，利于LAIP分析的标准化和规范化。
图1是正常骨髓B组细胞表型示例 图2 图4分别列举了 B-ALL治疗后标本中LAIP+细胞的三种示例具体实施例方式本发明提供了一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其包括下列荧光标记的单克隆抗体组合⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45，依前后顺序分别依次对应下列荧光标记FITC、PE、PerCP-CY5, 5、PE-CY7、APC, APC_Cy7 和 PacificBlue0各单克隆抗体的荧光标记及成分等信息参见表I。表I流式单克隆抗体信息
权利要求
1.一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病相关免疫表型分类装备，其特征在于该试剂盒中配置了下述单克隆抗体试剂CD58、 CD10、CD34、CD123、CD38、CD19 和 CD45。
2.根据权利要求1所述的检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体试剂⑶58、⑶10、⑶34、⑶123、⑶38、⑶19和⑶45依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为FITC、PE、Percp-CY5. 5、PE_CY7、APC、APC_Cy7 和 Pacific Blue。
3.根据权利要求1所述的检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了溶红细胞液和PH为7. 2 . 4的10XPBS缓冲液。
4.根据权利要求3所述的检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了配套计量的小牛血清试剂。
5.根据权利要求广4任意一项所述试剂盒在制备检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的产品中的应用。
6.借助于权利要求4所述的试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型进行分析的方法，其特征在于该方法包括下述步骤步骤一、试剂配制1.1、配制pH为7. 2 7. 4的10XPBS缓冲液，并稀释10倍成为I XPBS缓冲液，1. 2、取溶红细胞液，并用IXPBS缓冲液稀释10倍，.1.3、取小牛血清加入至I XPBS缓冲液中，制备含O. 5wt. 9T2wt. %血清的PBS ；步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本.2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下3μ L⑶58-FITC、 10 μ L CDlO-PEU μ L CD34_PerCP_CY5. 5、I μ L CD123_PE_CY7、2 μ L CD38_APC、5yL CD19-APC-Cy7和1. 3μ L CD45_Pacific Blue，然后再加入100 μ L骨髓标本，混匀，室温避光放置15分钟孵育，.2.2、加入步骤1. 2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置8分钟，溶解红细胞，.2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1. 3中2mL含O. 5wt. %"2wt. %血清的 PBS，混匀，.2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中O. 3mLl X PBS缓冲液，混匀， 制成待测标本；步骤三、按照七色流式细胞仪的操作要求对待测标本进行处理后检测，获得特异性荧光标记的骨髓细胞数据，用MACSQuant分析软件、在SSC/⑶19和⑶45/⑶19双参数点图中对⑶19+细胞进行连续两次设门，并进一步在⑶19+细胞中对⑶19+⑶38 +的浆细胞设门以去除浆细胞，最终的CD19+B细胞为待测的细胞，并与正常骨髓细胞CD19+B祖细胞表型进行比较。
全文摘要
本发明公开了一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病相关免疫表型分类装备，该试剂盒中配置了下述单克隆抗体试剂组合CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45，依前后顺序分别标准荧光素为FITC、PE、PerCP-CY5,5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和PacificBlue。采用本发明的试剂盒可以同时观察7个标志是否存在异常，增加了检测的灵敏度和准确性；而且可以不依赖于发病时的免疫表型资料，扩大了LAIP分析的范围和能力，简化了分析的前期条件，为临床检测MRD提供了更多的机会。
文档编号G01N33/577GK103018463SQ20121055752
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者刘艳荣, 王亚哲, 常艳, 郝乐, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院