专利名称：治疗b型肝炎病毒和非洲淋巴细胞瘤病毒的l-核苷的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗B型肝炎病毒(也可表示为“HBV”)和非洲细胞瘤病毒(表示为“EBV”)的方法，其中包括使用一个或多个有效量的本发明公开的活性化合物，或其药学上可接受的衍生物或前体药物。
背景技术：
B型肝炎病毒已在世界范围内流行。在宿主无感觉的二到六个月的潜伏期后，HBV感染可导致急性肝炎并造成肝脏损伤，这将引起腹痛，黄疸，并升高血液中某些酶的水平。HBV可引起暴发性肝炎，迅速地发展，最终常形成破坏大部分肝脏的疾病。患者一般可从急性病毒性肝炎中康复。但是，对于某些患者，血液中病毒抗原的高水平经过延长的，或不确定的时期，导致慢性感染。慢性感染可导致慢性持久性肝炎。感染慢性持久性HBV的患者最常见于发展中国家。到1991年中期，仅在亚洲就大约有225000000慢性HBV携带者，而在世界上，几乎有300000000携带者。慢性持久性肝炎可引起疲劳，肝硬度，和肝细胞癌，一种主要的肝癌。
在西方工业化国家，HBV的高危人群包括接触HBV携带者或其血液样品的人。事实上HBV流行与获得性免疫缺陷综合征的流行非常相似，这也就说明了HBV感染在AIDS或与HIV有关的感染的患者中常见的原因。不过，HBV比HIV更易接触感染。
HBV仅次于烟草，为人类癌症的第二大原因。HBV引起癌症的机理尚不清楚，有人假设它可直接激发肿瘤的产生，或通过慢性炎症，硬变，和与感染有关的细胞再生间接地激发肿瘤的产生。
非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)为Lymphocryptovirus属的一种，属于gammaherpesvirine亚科。它显然是亲淋巴的。EBV具有典型的疱疹病毒的结构，也就是说，它的双链DNA基因组含于二十五面体(icosapentahedral)病毒粒子中，换句话说，它被布满病毒糖蛋白的脂质膜包围。一种无定形的被体蛋白占据了膜和病毒粒子之间的空间。
某种程度上所有人类疱疹病毒都感染淋巴细胞并在其中复制，但EBV的作用极强。更重要地，EBV感染的发病机理及宿主反应比其他人类疱疹病毒更明显地取决于淋巴细胞的感染。
EBV现在被认为是B-细胞淋巴组织增生疾病的起因，并与各种其他严重的及慢性的疾病，包括AIDS患者罕见的进行性的单核细胞增多样综合症以及口腔毛状粘膜白斑病有关。那种EBV为导致慢性疲劳的主要原因的说法已经不起仔细推敲。
尽管某些感染通过输血传播，但EBV主要通过唾液传播。超过85％的患者在传染性单核细胞增多症的急性期分泌EBV。
已证明EBV与癌症有关。至少两组患者受到与EBV有关的淋巴组织瘤的威胁，那些在免疫抑制法治疗下接受过肾脏、心脏、骨髓、肝脏、或胸腺移植的患者，以及AIDS患者。与EBV有关的癌症包括Burkitt′sLymphoma和Nasopharyngeal Carcinoma。
由于B型肝炎病毒和非洲淋巴细胞瘤病毒对被感染的患者具有严重的，并且常常是灾难性的影响这一事实，因而急需提供对宿主低毒性的新的有效的药剂治疗人类的此类感染。
因此，本发明的目的是提供治疗B型肝炎病毒感染的化合物，组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供治疗非洲淋巴细胞瘤病毒感染的化合物，组合物和方法。
发明概要本发明提供一种治疗宿主、特别是人类HBV或EBV感染的方法，其中包括使用治疗HBV或EBV感染有效量的下式L-核苷 其中R为嘌呤或嘧啶碱基，作为优选的方案，所提供的核苷为指出的对映体并实际上不含它的相应另一个对映体(即，对映体浓度高的形式，包括对映纯的形式)。
作为一个优选的方案，活性化合物为2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶核苷(也表示为L-FMAU)。该化合物为有效的抗HBV和EBV的抗病毒剂，并具有低细胞毒性。活性化合物的其他特例包括N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶。和N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基-5-碘尿嘧啶。
作为另一个方案，如
图1所示，含有2′-阿拉伯糖基-羟基的L-核苷，例如，L-阿拉伯糖基胸苷，L-氟达拉滨，L-阿拉伯糖基鸟苷，和L-阿拉伯糖基肌苷被用来治疗HBV和EBV感染。
这里公开的L-核苷及其药学上可接受的衍生物或含有这些化合物的药学上可接受的剂型可用来预防和治疗HBV感染及其他与此相关的疾病如抗HBV抗体阴性和HBV阴性，由HBV引起的慢性肝炎，肝硬变，急性肝炎，暴发性肝炎，慢性持久性肝炎，和疲劳。该化合物也可用来治疗与EBV有关的疾病。这些化合物或剂型也可用来预防或阻止抗HBV或抗EBV抗体或HBV-或EBV-抗原阳性的人或已经接触到HBV或EBV的人的临床病症的发展。
作为另一个方案，可将活性化合物或其衍生物或盐与包括上面所列出的其他抗HBV剂或抗EBV剂，或者抗HIV剂联合或交替使用。交替治疗期间，通常连续地使用有效量的各个药剂，而在联合治疗期间，通常同时使用两种或两种以上的有效量的药剂。剂量取决于吸收，灭活，和药物的排泄以及其他本领域技术人员已知的因素。显然剂量值也随被治疗的疾病的严重程度变化。另外显然应该根据个体的需要和对使用或监督使用药物的人的职业性的判断来调整特定的病人用药期的特别的剂量制度和时间表。
可用来与本申请公开的化合物联合用药的抗病毒剂的非限制性特例包括2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧杂硫醇烷(oxathiolane)的(-)对映体(FTC)；2-羟甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧杂硫醇烷(oxathiolane)的(-)对映体(3TC)；carbovir，阿昔洛韦，干扰素，AZT，DDI(2，′3′-二脱氧肌苷)，DDC(2′，3′-二脱氧胞苷)，L-DDC，L-5-F-DDC和D4T。
附图的简要说明图1表示选自本发明范围内的L-核苷；L-FMAU(2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷)，L-FIAU(2′-氟-5-碘-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷)，L-FC(2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶)，L-FIAC(2′-氟-5-碘-β-L-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶)，L-2-Cl-2′-F-2′-脱氧腺嘌呤，L-FEAU(2′-氟-5-乙基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷)，L-阿拉伯糖基胸苷，L-氟达拉滨，L-阿拉伯糖基鸟苷，和L-阿拉伯糖基肌苷。
图2为存活细胞的百分数与H1细胞中L-FMAU药物浓度的关系曲线图。
图3为制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(化合物10)的示意图。
图4为可供选择的制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(化合物10)的另一种方法的示意图。
图5为制备1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-脱氧-2-氟-α-L-呋喃阿拉伯糖(化合物13)的方法的示意图。
图6为制备N9-[3′，5′-二-O-苯甲酰基-2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(化合物15)和N9-[2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(化合物16)的方法的示意图。
图7为制备某些2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-嘧啶(化合物17-24)的方法的示意图。
图8为制备N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-碘胞嘧啶(化合物22)的方法的示意图。
图9为制备9-β-L-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤的方法的示意图。
图10为由1，2-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃木糖(化合物3)制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(化合物10)的可供选择的另一种途径的示意图。
图11为口服给药一段时间后小鼠血浆中L-(-)-FMAU浓度的曲线(十字，以10mg/kg的剂量bid(每天二次)给药29天来进行药物动力学研究，然后在第三十天以相同的浓度给药进行研究；黑点，以50mg/kg的剂量bid给药29天，然后在第三十天以相同的浓度给药，进行研究；圆圈，以50mg/kg的剂量，在第一天首次给药，进行研究)。
图12为口服给药一段时间后小鼠肝脏中L-(-)-FMAU浓度的曲线(十字，以10mg/kg的剂量bid(每天两次)给药30天来进行药物动力学的研究，然后在第三十一天以相同的浓度给药进行研究；黑点，以50mg/kg的剂量bid给药30天，然后在第三十一天以相同的浓度给药，进行研究；圆圈，以50mg/kg的剂量，在第一天首次给药，进行研究)。
图13a表示对照组BDF1雌性小鼠在三十天内体重的变化。图13b和13c表示以10mg/kg bid的剂量(13b)和50mg/kg的剂量(13c)使用L-(-)-FMAU后BDF1雌性小鼠在三十天内体重的变化，所示体重是5至7个小鼠的平均体重和标准偏差。
图14-20提供了以10mg/kg(三只小鼠)或50mg/kg(三只小鼠)bid的剂量给药三十天后小鼠血浆的临床化学环境。图14为以mg/dL表示的小鼠血浆中总胆红素浓度的直方图。图15为以U/L表示的小鼠血浆中碱性磷酸酯酶的浓度的直方图。图16为以mg/dL表示的小鼠血浆中肌酸酐浓度的直方图。图17为以U/L表示小鼠血浆中AST(SGOT，血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶)的浓度的直方图。图18为以U/L表示的小鼠血浆中ALT(SGPT，血清谷氨酸丙酮酸转氨酶)浓度的直方图。图19为以mmol/L表示的小鼠血浆中乳酸浓度的直方图。图20为以U/L表示小鼠血浆中乳酸脱氢酶浓度的直方图。
发明的详细描述这里使用的术语“对映体浓度高的形式”指其中包括至少约95％，优选约97％、98％、99％，或100％的核苷的某一对映体的核苷组合物。
这里使用的术语烷基特别地包括但不限于C1到C10烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、异戊基、戊基、叔-戊基、环戊基和环己基。
这里使用的术语酰基特别地包括但不限于乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、3-甲基丁酰基、琥珀酸氢酯、3-氯苯甲酸酯、苯甲酰基、乙酰基、新戊酰基、甲磺酸酯、丙酰基、戊酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基和油酸酰基。
这里使用的术语芳基，除非另外指出，指苯基。
这里使用的术语“被保护的”，除非另外指出，指在分子中另一部分的氧或氮原子反应的过程中，加入一个基团防止其他部分的氧或氮原子进一步反应，氧和氮保护基可任意地选自有机合成领域技术人员已知的那些。
术语嘌呤或嘧啶碱基包括，但不限于，腺嘌呤基N6-烷基嘌呤基，N6-酰基嘌呤基(其中酰基为C(O)(烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基)，N6-苄基嘌呤基、N6-卤代嘌呤基、N6-乙烯基嘌呤基、N6-炔基嘌呤基、N6-酰基嘌呤基、N6-羟烷基嘌呤基、N6-硫代烷基嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、6-氮杂嘧啶基、2-巯基嘧啶基、尿嘧啶基、N5-烷基嘧啶基、N5-苄基嘧啶基、N5-卤代嘧啶基、N5-乙烯基嘧啶基、N5-炔基嘧啶基、N5-酰基嘧啶基、N5-羟烷基嘌呤基、N6-硫代烷基嘌呤基、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑异吡啶基、咪唑异吡啶基、吡咯异吡啶基、吡唑异嘧啶基。碱基上的功能性氧和氮基可按需要成要求保护。合适的保护基为本领域技术人员已知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲游基甲基、烷基、酰基如乙酰基、丙酰基、丁基、甲磺酰基和P-甲苯磺酰基。特别地包括5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-乙基尿嘧啶。
这里也公开本发明的治疗HBV感染、EBV感染，及其他在人或其他宿主动物体内以相似的方式复制的病毒如HIV感染的方法和组合物，该方法包括使用有效量的一种或一种以上的上面定义的L-核苷，或其生理上可接受的衍生物，或生理上可接受的盐，非强制性地使用药学上可接受的载体，本发明化合物既可具有抗HBV活性，抗EBV活性，也可被代谢成具有抗HBV或抗EBV活性的化合物。这里公开的化合物也可用于治疗与HBV和EBV有关的疾病。
活性化合物可以任何衍生物的形式使用，根据对患者的使用方式，该衍生物可直接地或间接地提供母体化合物，或者该衍生物本身具有活性它的非限制性例子为药学上可接受的盐(选择性地称为“生理学上可接受的盐”)，以及活性化合物5′和嘌呤或嘧啶被酰基化或烷基化的衍生物(选择性地称为“生理活性的衍生物”)。作为一个方案，酰基为羧酸酯类基团(即，-C(O)R′)，其中非羰基部分(R′)选自直链，支链，或环状C1到C10烷基，烷氧烷基包括甲氧甲基，芳烷基包括苄基，芳氧烷基如苯氧甲基，芳基包括非强制性地由卤素，C1到C4烷基或C1到C4烷氧基取代的苯基，磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺酰基，单，双或三磷酸酯，三苯甲游基或单甲氧基三苯甲游基，取代的苄基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。该酯中的芳基最适宜地包括苯基或苄基。烷基可为直链，支链，或环状，最适宜地为C1到C10基团。I.L-核苷的合成这里公开的L-核苷可按下面的详细描述，或按本领域技术人员已知的其它方法制备。
在下述合成方案中，其他标准试剂，包括等价的酸，碱，和溶剂可按本领域技术人员已知知识代替这里所述的那些试剂。可使用很宽范围的氧或氮保护基，它们公开于，例如，Greene等，“Protective Groupsin Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，Second Edition，1991。合适的氧和氮的保护基包括，例如，三取代的硅烷基如三甲基甲硅烷基，二甲基己基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基，三苯甲游基，烷基，酰基如乙酰基，丙酰基，苯甲酰基，P-NO2苯甲酰基，苄基，或甲苯甲酰基，甲磺酰基，或P-甲苯磺酰基。杂环碱基上的功能性氧和氮应在与糖缩合以前被保护起来。
合适的还原剂包括NaBH4，氢化二异丁基铝(DIBAL-H)，硼氢化锂(LiBH4)和氢化双(2-甲氧乙氧基)铝钠(Red-Al)。合适的氧化剂包括含水酸性铬酸(CrO3)，重铬酸钠(Na2Cr2O7)，氯铬酸吡啶鎓(PCC)，重铬酸吡啶鎓(PDC)，高锰酸钾(KMnO4)，四醋酸铅/吡啶，氧气与钯/碳催化剂，RnO4，RuO4/NaIO4，二甲亚砜/二环己基碳化二亚胺(DMSO/DCC)和质子给体，碳酸银，碳酸三苯基铋，Oppenaner氧化剂(丙酮中的铝的醇盐)和二氧化锰(用于在其他醇中的烯丙基或苄醇的选择性氧化)。
可用于缩合反应的Friedel-Crafts催化剂(Lawis酸)包括SnCl4、ZnCl4、TiCl4、AlCl3、FeCl3、BF3-乙醚和BCl3。由于水的存在会降低催化剂的活性，因此这些催化剂需要无水条件。这些催化剂也在具有活性氢的有机溶剂。如醇和有机酸，存在下失活。这些催化剂典型地在溶剂如，二硫化碳、二氯甲烷、硝基甲烷、1，2-二氯乙烷、硝基苯、四氯乙烷，氯代苯、苯、甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃，二噁烷，或乙腈中使用。无水氯化铝不溶于二硫化碳。Niedballa，et al.，J.Org.Chem.39，25(1974)。优选的催化剂是SnCl4，优选的溶剂是1，2-二氯乙烷。三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯可在与上述Friedel-Crafts催化剂相同的条件下使用。反应进行的温度范围为-10℃到200℃。可用各种试剂，包括乙酸、三氟乙酸、氢氟酸、氟化四丁基铵、氟化钾和吡啶鎓HCl进行脱甲硅烷基化。
参见附图3，由L-木糖(1a)开始，以20％的总产率合成关键的中间体1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(10)(L.Vargha，Chem.Ber.，1954，87，1351；Holy.A.，et al.，Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry，VI，163-67)。如附图4所示，化合物10也可由更昂贵的原料L-核糖合成(Holy，A.，et al.，Synthetic Procedures in Nucleic AcidChemistry，V1，163-67)。图3说明化合物10的选择性合成(产率53％)，随后将其在C2氟化(J.Org.Chem.，1985，50，3644-47)得到1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-脱氧-2-氟-L-呋喃阿拉伯糖(13)，将其通过溴代糖与不同碱基缩合，得到各种产率的2′-脱氧-2′-氟-呋喃阿拉伯糖基核苷。
1，2-二-O-异丙烯基-α-L-呋喃木糖(3)在650ml无水丙酮中加入4ml浓硫酸，5g分子筛(4A)，80g无水硫酸铜和50g L-木糖，并将该混合物在室温搅拌36小时。将反应混合物过滤并用丙酮充分洗涤，将合并后的滤液用氢氧化铵中和，然后蒸干。加入乙酸乙酯(200ml)。过滤并蒸发，将所得油状物溶于250ml0.2％HCl溶液并在室温搅拌2.5小时。用sat NaHCO3将pH调至8，然后蒸干，用乙酸乙酯萃取残留物。除去溶剂，得到黄色油状化合物3(41.7g，82.3％)。
1H-NMR(CDCl3)δ5.979(d，J＝3.78Hz，1H，H-1)；4.519(d，J＝3.6Hz，1H，H-2)；4.308(bd，1H，H-3)；4.080(m，3H，H-4 and H-5)；1.321(s，3H，CH3)；1.253(s，3H，CH3).
1，2-二-O-异丙烯基-3，5-二-O-o-甲苯磺酰基-α-L-呋喃木糖(4)0℃下将化合物3(40g，210mmol)在500ml无水吡啶中搅拌，同时滴加TsCl(75g，393mmol)溶于100ml CHCl3形成的溶液。3小时后，按与上述相同的方式，加入另一部分TsCl(50g，262mmol)在50mlCHCl3中形成的溶液。将该混合物在r.t.搅拌24小时，然后冷却至0℃，加入水(10ml)，然后在r.t.搅拌30分钟。将反应混合物倒入500ml冰水，用CHCl3(150ml×4)萃取。用1.5M H2SO4(150ml×4)，sat.NaHCO3(200ml×2)洗涤，干燥(MgSO4)。除去溶剂得到棕色糖浆状物，将其用EtOH结晶，得到白色固体状4(103.8g，99％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.282，7.836(m，8H，OTs)；5.849(d，J＝3.51Hz，1H，H-1)；4.661，4.779(m，2H，H-3和H-4)；4.193(dd，1H，H-2)；4.011(d，2H，H-5)；2.448，2.478(2s，6H，-OTs)；1.261，1.320(2s，6H，CH3).
1，2-二-O-乙酰基-3，5-O-p-甲苯磺酰基-α，β-呋喃木糖(5)将化合物4(70g，140.5mmol)溶于700ml冰AcOH和100ml Ac2OH中，在0℃滴加50ml浓硫酸。将所得溶液在r.t.搅拌过夜，然后倒入1L冰水中，用CHCl3(200ml×4)萃取，用sat.NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)。真空除去溶剂后，得到糖浆状5(84.2g，粗产率110％)。
甲基-3，5-二-O-p-甲苯磺酰基-α，β-呋喃木糖(6)在r.t.下将粗产物5(80g)在500ml 1％HCl/CH3OH中搅拌30小时。减压除去溶剂，将残留物溶于300ml CHCl3，用sat.NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)。除去溶剂得到糖浆状6(60g，90％由4计算)。
甲基-2-O-苯甲酰基-3，5-二-O-p-甲苯磺酰基-α，β-呋喃木糖(7)将糖浆状物6(60g，127mmol)溶于200ml吡啶并在0℃搅拌，同时滴加苯甲酰氯(40ml，345mmol)，将所得溶液在r.t.搅拌17小时。将其浓缩至约50ml，然后倒入300ml冰水中，用CHCl3萃取，用3NH2SO4和sat.NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)。蒸发溶剂后，得到糖浆状7(71g，97％)。
甲基2，3，5-三-O-苯甲酰基-α-β-呋喃核糖(9)
将糖浆状物7(70g)和苯甲酸钠(100g，694mmol)悬浮于1200mlDMF中并在回流下机械搅拌16小时。将其冷却至r.t.，然后倒入1L冰水，用乙醚萃取，干燥(MgSO4)。蒸发溶剂得到糖浆状物(50g，8a和8b)，将其溶于180ml吡啶并在r.m.苯甲酰化(BzCl，20ml，172mmol)17小时。处理后，得到棕色糖浆状9(48g，83％由7计算)。
1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(10)将化合物9(26g，54.6mmol)在0℃到r.t.下用275ml冰醋酸，55ml乙酸酐和16ml浓硫酸处理17小时。然后倒入1L冰水中，用氯仿(200ml×4)萃取。将合并的萃取液用sat.NaHCO3洗涤并干燥(MgSO4)。除去溶剂得到棕色糖浆状物，将其用乙醇处理得到白色固体状10。(8.8g，3.2％)。m.p.124.7℃，lit.129-130℃，D型130-131℃[α]D＝-45.613(c1.0)，CHCl3，D型[α]D＝+44.2。
1H-NMR(CDCl3)δ7.317，8.134(m，15H，OBz)；6.437(s，1H，H-1)；5.835(m，2H，H-2和H-3)；4.649(m，3H，H-4和H-5)；2.003(s，3H，CH3COO-).
1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(由L-核糖制备)将L-核糖(5g，33.3mmol)悬浮在120ml 1％HCl/MeOH中并在r.t.搅拌3小时，得到透明溶液。加入30ml无水吡啶猝灭反应，然后减压蒸发。将所得糖浆状物与吡啶(30ml×2)共蒸，然后溶于80ml无水吡啶，并在0℃搅拌，同时滴加苯甲酰氯(20ml，172mmol)。在r.t.搅拌17小时后，反应完全。加入水(10ml)并将该混合物在r.t.搅拌0.5小时，然后浓缩至约50ml，倒入150ml冰水中，用氯仿(50ml×4)萃取，用3N H2SO4(30ml×2)，sat.NaHCO3(30ml×3)连续洗涤，并干燥(MgSO4)。除去溶剂得到13g糖浆状9。
将粗品9溶于80ml HBr/AcOH(45％，w/v)并在r.t.搅拌1.5小时。在该混合物中加入冰醋酸(50ml)并将所得溶液在0℃搅拌，缓慢加入34ml水以保持温度低于7℃。然后将其在r.t.搅拌1小时，倒入200ml冰水中，用氯仿(50ml×5)萃取。将合并的萃取液用sat.NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)。除去溶剂得到糖浆状物(13g)，将其溶于40ml无水吡啶，在0℃搅拌。然后滴加乙酸酐(14ml，148.4mmol)。反应完全后，将其倒入150ml冰水中，用氯仿(50ml×4)萃取。用3N H2SO4(30ml×2)，sat.NaHCO3(50ml×2)连续地洗涤，并干燥(MgSO4)。除去溶剂并用甲醇处理得到白色固体状10(9.2g，53.7％由L-核糖计算)。
1，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃核糖(11)在0℃下将化合物10(9g，17.84mmol)在100ml CH2Cl2中搅拌，同时一次加入含HBr(3.2g，30.5mmol)的70ml CH2Cl2。将该混合物在0℃搅拌3.5小时，加入水(55ml)并将该混合物在r.t.搅拌18小时。将有机层分出，用sat.NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)。蒸发溶剂后，得到泡沫状物，用CH2Cl2和n-己烷重结晶，得到白色固体状11。(6.2g，75.5％)。m.p.137-138℃，lit.140-141℃，[α]D＝-81.960(c0.55，CHCl3；D型[α]D＝+83.71.
1H-NMR(CDCl3)δ7.312，8.187(m，15H，OBz)；6.691(d，J＝4.59Hz，H-1)； 5.593(dd，J4-3＝6.66Hz；J2-3＝1.8Hz，1H，H-30；4.637，4.796(m，4H，H-2，H-4和H-5)；2.3(b，OH).
1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-O-咪唑磺酰基-α-L-呋喃核糖(12)在-15℃下(干冰-CCl4)将化合物11(5.94g，12.84mmol)在50ml无水CH2Cl2中搅拌。连续地加入无水DMF(15ml)和磺酰氯(3.2ml，3.98mmol)。将该溶液在-15℃搅拌30分钟，然后在r.t.下放置4小时。在冰浴冷却下，在反应混合物中分三份加入咪唑(8.7g，12.78mmol)。然后将其在r.t.搅拌17小时。将该混合物倒入150ml冰水中，用CH2Cl2(50ml×3)萃取水相。将合并的有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)通过柱层析(己烷∶EtOAc/5∶1-1∶1)纯化，得到白色固体状12(3.7g，49％)。m.p.124.5-125.5℃，lit129℃；[α]D＝-68.976；D型+66.154.
1H-NMR(CDCl3)δ6.9，8.2(m，18H，Ar-H)；6.67(d，J＝4.4Hz，1H，H-1)；5.59(dd，1H，H-3)，5.21(dd，1H，H-2)；4.5，4.8(m，3H，H-4和H-5).
1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-脱氧-2-氟-α-L-呋喃阿拉伯糖(13)。
氩气下搅拌12(3.33g，5.62mmol)，KHF2(1.76g，22.56mmol)在30ml 2，3-丁二醇中的悬浮液。将其加热至180℃，同时加入1ml HF/H2O(48％，27.6mmol)并将该混合物在160℃搅拌1.5小时。加入冰盐水猝灭反应，然后用二氯甲烷(50ml×4)萃取该溶液。将合并的萃取液用盐水，水，sat.NaHCO3洗涤，用无水硫酸镁和活性碳(Darco-60)干燥。将其置于硅胶短柱(5cm×5cm)上，先用二氯甲烷，后用EtOAc洗脱，得到糖浆状物，在95％EtOH中结晶，得到13(1.3g，49.8％)。m.p.77-78℃；lit82℃。
1H-NMR(CDCl3)δ7.314，8.146(m，15H，OBz)；6.757(d，J＝9.1Hz，1H，H-1)；5.38(d，J＝48.5Hz，1H，H-2)；5.630(dd，J＝22.5Hz，1H，H-3)；4.768(m，3H，H-4和H-5).
N9-[3′，5′-二-O-苯甲酰基-2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(15)将化合物13(464mg，1mmol)溶于10ml二氯甲烷，加入1.4mlHBr/AcOH(45％，w/v)，将该溶液在r.t.搅拌24小时，然后蒸干。将残留物溶于20ml二氯甲烷中，用水，sat.NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)。过滤，蒸发得到溴基糖14(100％，根据TLC)。
同时，将2，6-二-氯嘌呤(378mg，2mmol)悬浮在15ml HMDS和2mg硫酸铵中，然后回流2小时。高真空N2下蒸去HMDS得到白色甲硅烷化的碱。
将溴基糖14溶于25ml无水1，2-二氯乙烷。N2下将所得溶液加入甲硅烷化的碱中。将该混合物搅拌回流2天。加入氯仿(30ml)，然后用水(20ml×2)，sat.NaHCO3(20ml×2)，sat.NaCl溶液(20ml×2)连续洗涤，干燥(MgSO4)。以CHCl3中结晶，得到化合物15(105mg，19.7％)。m.p.158℃；D型158℃。UV(甲醇)λmax238.50nm，273.0nm。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.82(d，J＝1.5Hz，1H，H-8)；7.49，8.33(m，10H，OBz)；6.767(dd，JH-H＝4Hz，KF-H＝13.8Hz，1H，H-1′)；5.854(dq，J＝67.4Hz，1H，H-2′)； 5.910(m，1H，H-3′)；4.751(m，3H，H-4′和H-5′).
N9[2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-2，6-二氯嘌呤(16)在密封的钢罐中将化合物15(70mg，0.13mmol)溶于25ml sat.NH3/CH3OH中，并在90℃加热6小时。减压除去溶剂得到黄色半固体。将其通过制备TLC(9∶1/CHCl3∶CH3OH)纯化。从水和1，4-二噁烷中冷冻干燥，得到白色粉末状16(30mg，75％)。UV(H2O)pH2，λmax212.00nm，263.50nm(ε6711)；pH7，λmax213.50nm，263.00nm(ε7590)；pH11，λmax213.5nm，263.00nm(ε5468).
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.279(d，J＝1.5Hz，1H，H-8)；7.908(bs，2H，NH2)；6.321(dd，JH-H＝4.4Hz，JF-H＝13.8Hz，1H，H-1′)； 5.986(t，1H，5′-OH)；5.230(dt，JF-H＝52.6Hz，1H，H-2′)； 5.115(d，1H，3′-OH)；4.425(dq，JF-H＝19Hz，1H，H＝3′)；3.841(m，1H，H-4′)；3.636(d，2H，H-5′).
N1-(2′-脱氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苄基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-胸腺嘧啶(17)在13(400mg，0.86mmol)溶于无水CH2Cl2(10ml)形成的溶液中加入醋酸中的溴化氢(45％ w/v，1.5ml)，并将所得溶液在r.t.搅拌17小时。蒸发溶剂并用甲苯共蒸后，得到化合物14。
同时，将胸腺嘧啶(215mg，1.72mmol)在HMDS(25ml)中在氮气氛下回流17小时，得到均相溶液。蒸去溶剂得到甲硅烷化的胸腺嘧啶。
将14的二氯乙烷(50ml)溶液加入甲硅烷化的胸腺嘧啶，并将所得溶液在氮气下回流3天。加入水，然后用CHCl3萃取。将有机层用水，盐水洗涤并干燥(MgSO4)。蒸发溶剂得到粗产物，将其经制备TLC纯化，用2％MeOH/CHCl3展开，得到17(235mg，58％)。m.p.99-101℃.UV(Methanol)230，264nm[α]D＝+22.397.
1H-NMR(CDCl3)δ7.343-8.389(m，12H，Ar-H，NH)；6.34(dd，JH-H＝2.97Hz，JF-H＝28.32Hz，1H，H-1′)；5.383(dd，JH-H＝2.7Hz，JF-H＝63.27Hz，1H，H-2′)；5.565(dd，1H，H-3′)；4.812(d，2H，H-5′)；4.466(m，1H，H-4′)；1.775(s，3H，CH3).Anal.(C24H2lN2O7F)，C61.01；H，4.57；N5.73；F3.92.
N1-(2′-脱氧-2′-氧-β-L-呋喃阿拉伯糖基)胸腺嘧啶(18)在r.t.将化合物17(145mg，0.309mmol)用NH3/CH3OH处理18小时，蒸发溶剂，经制备TLC(15％MeOH/CHCl3)纯化，得到18(70mg，87.5％)。m.p.174-175℃.UV264nm，[α]D＝-104.36.
H-NMR(DMSO-d6)δ11.401(s，1H，NH)；7.575(s，1H，H-6)；6.093(dd，JH-H＝4.41Hz，JF-H＝15.6Hz，H-1′)；5.844(d，1H，3′-OH)；5.019(dt，JF-H＝53.3Hz，1H，H-2′)；5.087(t，1H，5′-OH)；4.194(dq，1H，H-3′)；3.647(m，3H，H-4′and H-5′)；1.781(s，3H，CH3).Anal.(C10H13N2FO5)，C44.80；H4.97；N10.04；F7.03.
N1-(2′-脱氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶(19)在13溶于无水二氯甲烷(10ml)形成的溶液中加入醋酸中的溴化氢(45％ w/v，0.97ml，5.385mmol)。将该溶液在r.t.搅拌18小时，蒸发溶剂并用甲苯共蒸后，得到14。
同时，将5-乙基尿嘧啶(0.75g，5.39mmol)悬浮在HMDS(10ml)与硫酸铵(5mg)中，并在氮气氛下回流5小时，得到均相溶液。
在避免湿气的情况下将甲硅烷化碱溶液蒸干。在所得糖浆状物中加入14在无水1，2-二氯乙烷(10ml)中的溶液。氮气氛下将反应混合物在95℃搅拌20小时，然后真空蒸发至干，得到黄色固体，将其与5mlCH3OH/CHCl3(1∶11混合并过滤。蒸发滤液，残留物经硅胶柱层析(CH3OH/CHCl3，0-1％)，得到白色固体19(0.557g，100％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ11.55(s，1H，NH)；7.51，8.08(m，10H，Ar-H)；7.32(s，1H，H-6)；6.29，6.37(dd，JH-H＝3.7Hz，JF-H＝20Hz，1H，H-1′)；5.68-5.75(dd，JF-H＝20Hz，1H，H-3′)，5.47-5.65(dd，JF-H＝54Hz，1H，H-2′)；4.62-4.83(m，3H，H-4′and H-5′)；2.01，2.09(q，2H，CH2-CH3)；0.85(t，3H，CH3).
N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶(20)将化合物9(500mg)溶于甲醇胺(50ml)中并在r.t.搅拌44小时。将该溶液蒸于，得到白色固体。经硅胶柱层析(CH3OH/CHCl3，0-5％)得到白色固体20(240mg，84％)。m.p.158-161℃。UV(MeOH)λmax260nm.
1H-NMR(DMSO-d6)δ11.42(s，1H，NH)；7.57(s，1H，H-6′)；6.10，6.17(dd，JH-H＝5.0Hz，JF-H＝14Hz，1H，H-1′)；5.88(bs，1H，3′-OH)；5.14，5.19(m，2H，H-2′and 5′-OH)；4.98(t，1H，H-3′)；4.22，4.28(m，1H，H-4′)；3.55，3.78(m，2H，H-5′)Anal.(C11H15N2O5F)C47.93；H5.56；N10.06；F6.68.
N1-(2′-脱氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-N4-苯甲酰基-5-碘胞嘧啶(21)在13(150mg，0.323mmol)溶于无水二氯甲烷(5ml)形成的溶液中加入醋酸中的溴化氢(45％ w/v，0.29ml，1.615mmol)。将反应混合物在r.t.搅拌9.5小时。蒸发溶剂并用甲苯共蒸后，得到黄色糖浆状15。
同时，将N4-苯甲酰基-5-碘胞嘧啶(550mg，1.615mmol)悬浮于HMDS(8ml)与硫酸铵(3mg)中并在氮气氛下回流5小时，得到均相溶液。
在避免湿气的情况下将甲硅烷化的碱溶液蒸干。在所得糖浆状物中加入14在无水1，2-二氯乙烷(10ml)中的溶液。氮气氛下将反应混合物回流23小时，然后蒸干，得到棕色糖浆状物，将其用氯仿(30ml)研制。将所得沉淀过滤除去并用氯仿洗涤，将滤液的洗液合并并蒸发，得到棕色糖浆状物。通过硅胶柱层析(CH3OH/CHCl3，0-1％)分离混合产物，得到白色固体状21(100mg，45％)。
1H-NMR(CDCl3)δ11.40(bs，1H，NH)7.26，8.20(m，17H，Ar-H，H-6 and NH)；6.36，6.44(dd，JHH＝2.8Hz，JF-H＝21Hz，1H，H-1′)；5.62，5.68(dd，1H，H-3′)；5.39，5.56(dd，1H，H-2′)；4.58，4.85(m，3H，H-4′和H-5′).
N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶(22)在r.t.下将化合物21(100mg，0.27mmol)用sat.NH3/MeOH(60ml)处理24小时。经硅胶柱层析(0-10％CH3OH/CHCl3)得到白色固体状化合物22(35mg，71％)。[α]D＝-65.4(c 0.34，CH3OH)；UV(MeOH)λmax＝293nm.
1H-NMR(DMSO-d6)；δ8.04(s，1H，H-6)；6.74，7.94(s，1H，NH)；6.01，6.08(dd，JH-H＝3.9Hz，JF-H＝16.6Hz，1H，H-1′)；5.85(d，1H，3′-OH)；5.17(t，1-H，5′-OH)；5.08(t，1H，H-2′)；4.89(t，1H，H-3′)；4.15-4.23(m，1H，H-4′)；3.63-3.79(m，2H，H-5′).
N1-(2′-脱氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苯甲酰基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶(23)在13(260mg，0.56mmol)溶于10ml无水CH2Cl2形成的溶液中加入HBr/AcOH(45％，w/v，0.5ml，2.8mmol)。将反应混合物在r.t.搅拌36小时。然后蒸干。将残留物溶于20ml CH2Cl2，用水(10ml)，sat.NaHCO3(10ml)洗涤，干燥(MgSO4)。过滤并蒸发得到糖浆状溴基糖14。
同时，将5-碘尿嘧啶(270mg，1.12mmol)悬浮于10ml HMDS中并回流36小时，得到均相溶液。将其真空蒸干。在其中加入14在无水1，2-二氯甲烷中的溶液，并在N2下将所得溶液回流1.5天。加入CHCl3(20ml)，并将该溶液用水(10ml)、盐水(10ml)和sat.NaHCO3(10ml)连续洗涤，然后干燥(MgSO4)。除去溶剂，将所得糖浆状物用CH2Cl2结晶，得到黄色固体状23(237mg，73％)。将其中一部分(70mg)用2-异丙醇重结晶，得到白色固体(67mg)。UV(Methanol)λmax230.0nm，276.0nm.
1H-NMR(CDCl3)δ8.4，7.3(m，12H，Ar-H)；6.29(dd，JH-H＝2.43Hz，JF-H＝21.6Hz 1H，H-1′)；5.377(dd，JH-H＝2.8Hz，JF-H＝61.3Hz，1H，H-2′)；5,55(dd，1H，H-3′)；4.865，4.793(d，2H，H-5′)；4.588，4.502(m，1H，H-4′).
N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶(24)将化合物23(40mg，0.069mmol)溶于25ml sat.NH3/MeOH并在r.t.搅拌24小时，然后蒸干。将所得糖浆状物经制备TLC(5∶1/CHCl3∶MeOH)纯化，得到固体状24(19mg，74％)。UV(MeOH)λmax280.5nm.
1H-NMR(DMSO-d6)δ11.82(bs，CONH)；8.24(s，1H，H-6)；6.082(dd，JH-H＝4.45Hz，JF-H＝13.7Hz，1H，H-1′)；5.947(d，1H，3′-OH)；5.296(t，1H，5′-OH)；5.07(dt，JF-H＝53Hz，1H，H-2′)；4.24(bd，JF-H＝21Hz，1H，H-3′)；3.81，3.55(m，3H，H-4′，H-5′).
2，3，5-三-O-苄基-L-阿拉伯糖如附图9所示，先将三十克(0.2mol)L-阿拉伯糖(5)粉末，再将0.4ml浓硫酸加入600ml(14.8moles)无水甲醇中。将此悬浮液搅拌并温和地加热回流2小时，得到透明的溶液。将反应混合物用1.5g碳酸氢钠中和，干燥，然后真空蒸发，得到重糖浆状物6，将其用新纯化的四氢呋喃(50ml)稀释并再浓缩(35-40℃浴)以除去残留的甲醇。加入新纯化的四氢呋喃(400ml)，并用30g Drierite，156g(2.78mole)氢氧化钾和200ml(1.74mole)苄基氯处理该混合物。将该混合物温和地加热回流过夜，冷却，用一薄层硅藻土过滤，真空浓缩，然后使其处高真空和100°(浴)下。将粗品糖浆状甲基2，3，5-三-O-苄基-L-阿拉伯糖甙(7)溶于400ml冰醋酸中。将此水解混合物在65-70℃加热2小时，真空浓缩至三分之一体积，并倒入2.5L冰水混合物中。种晶后(晶种最初来自层析，用二氯甲烷洗脱)，使混合物保持5°过夜。将水层从部分结晶的块中滗出，并将后者溶于200ml二氯甲烷。将该溶液用冷的碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，用一薄层脱色碳过滤，真空浓缩成稀糖浆状物，并将其溶于200ml环己烷。种晶之后，使该溶液在室温下保持1小时并在5°下过夜。得到27.7g(33.2％)2，3，5-三-O-苄基-L-阿拉伯糖(8)，m.p68-73℃。[α]D25＝-1.69[c 2.01，9∶1(v/v p-二噁烷-水)]。UV(MeOH)λmax220；300-MHz 1HNMR(CDCl3)δ3.48-3.62(m，2H，H-5)，3.94-4.18(m，3H，H-2，3，4)，5.33(d，1H，J＝4.07，H-1)，5.29(s，H-1)，7.25-7.33(m，15，H-aromat).
2，3，5-三-O-苄基-1-O-(p-硝基苯甲酰基)-L-阿拉伯糖(9)将化合物8(附图9)(2g，4.76mmole)溶于7.5ml二氯甲烷，并在此溶液中加入0.95g(5.1mmoles)p-硝基苯甲酰氯在5ml二氯甲烷和1.5ml吡啶的混合物中形成的溶液。将反应混合物保持室温过夜，然后用1N盐酸(2×10ml)、碳酸氢钠水溶液(2×10ml)和水(3×30ml)连续洗涤。用Na2SO4除湿，真空浓缩该溶液，得到2.67g(98.4％)化合物9的端基异构体混合物。通过硅胶柱层析(己烷∶丙酮，8∶1)进一步纯化，产物mp89-93℃。[α]24D＝13.04(C6.8，CH2Cl2)，UV(MeOH)λmax215.5 and 258.5，250MHz 1NMR(CDCl3)δ3.54-3.69(m，2H，H-5)，4.06(m，1H；H-4′)，4.22(m，1H，H-3′)，4.33(m，1H，H-2′)，4.38-4.78(m，6H，benzyl CH2)，6.50(d，1H，J＝2.35，H-1)，7.23-7.36(m，15H，苄基上的芳香H)，8.01-8.25(m，4H，硝基苯甲酰基上的芳香H)。
10(2，3，5-三-O-苄基-β-L-阿拉伯糖基)胸腺嘧啶(12)将0.444g(3.52mmole)的胸腺嘧啶和硫酸铵(2mg)悬浮于10ml六甲基二硅氮烷中，在氩气中回流(140℃)过夜得到一澄清溶液。在真空无水条件下除去过量的六甲基二硅氮烷得到糖浆状物11。
将化合物9(1g，1.76mmole)0℃下加入17ml用无水氯化氢预饱和的二氯甲烷中。0℃保持2小时后，将沉淀对-硝基苯甲酸(0.25g)过滤除去，将滤液真空浓缩成稀糖浆状物、然后室温下在高真空泵中保持2小时得到氯化2，3，5-三-O-苄基-α-L-阿拉伯糖(10)。
将上述制备的化合物10溶于15ml无水二氯甲烷中，将溶液加入甲硅烷基化的胸腺嘧啶和3g 4A分子筛的混合物中。将反应混合物在氩气中室温下搅拌18小时。将反应混合物用50ml的二氯甲烷稀释，并在剧烈搅拌下倾入2ml饱和NaHCO3水溶液中。将出现的白色沉淀(氢氧化亚锡)在硅藻土垫上滤出。将有机层从水中分离出来并用水洗涤(3×30ml)。水层用二氯甲烷萃取，合并二氯二烷层并用Na2SO4干燥，然后真空蒸发得到糖浆状物并用硅胶柱层析纯化(氯仿∶甲醇，100∶1)得到0.68g糖浆状物12(73％)。25D＝-56.71(C 0.6，CH2Cl2).UV(MeOH)λmax218 and 265；300MHz 1HNMR(CDCl3)δ1.67(d，3H，J＝1.11，CH3)，3.66-3.70(m，2H，H-5′)4.06(m，1H，H-4′)，4.13(t，1H，J＝4.7，H-3′)，4.24(t，1H，J＝4.7，H-2′)，4.41，4.54，4.56(m，6H，benzyl CH2)，6.28(d，1H，J＝5.24，H-1′)，7.15-7.33(m，15H，芳香-H)，7.43(d，1H，J＝1.31，H-6).
1-β-2-阿拉伯呋喃胸腺嘧啶(13)将氯化钯(680mg，3.85mmole)悬浮于100ml甲醇中，室温下在氢气中振摇还原。然后将450mg 12的25ml甲醇溶液加入酸性钯黑悬浮液中。室温下将反应混合物于氢气中振摇38小时。除去催化剂后，将溶液用Dowex(HCO3-)中和至pH7并且真空浓缩得到白色固体并用乙醇重结晶得到13(105mg，47.7％)m.p.244-249℃.[α]25D＝-91.48(0.25，H2O)；IR(KBr)1750，1600cm-1(CO)；UV(MeOH)λmax268；300MHz 1HNMR(DMSO-d6)δ1.76(s，3H，CH3)，3.62(t，2H，J＝4.56，H-5′)3.69(m，1H，H-4′)，3.90(t，1H，J＝3.88，H-3′)，3.99(t，1H，J＝4.10，H-2′)，5.08(brs，1H，C′5-OH，可互换的)，5.42(d，1H，J＝4.24，C′2-OH or C′3-OH，可互换的)，5.54(d，1H，J＝5.23，C′2-OH或C′3-OH，可互换的)，5.97(d，1H，J＝4.64，H-1′)，7.51(d，1H，J＝0.97，H-6)，11.26(s，1H，NH，可互换的)元素分析理论值C10H14N2O6；C，46.51；H，5.46；N，10.85；实测值C，46.67；H，5.63；N，10.56.
1-(2，3，5-三-O-苄基-β-L-阿位伯糖基)胞嘧啶(15)将0.61g(6mmole)胞嘧啶和硫酸铵(2mg)悬浮于15ml六甲基二硅氮烷中，在氮气中回流(140℃)2小时得到澄清溶液。在无水真空条件下将甲硅烷基化的胞嘧啶混合物蒸发至干得到糖浆状物14。
将化合物9(2.82g，5mmole)0℃下加入47ml用无水氯化氢预饱和的无水二氯甲烷中。在0℃保持2小时后，将沉淀对-硝基苯甲酸(0.807g)过滤除去，将滤液真空浓缩得到糖浆状的氯化2，3，5-三-O-苄基-α-L-阿拉伯糖(10)。
将上述制备的化合物10溶于28.5ml无水二氯甲烷中，将溶液加入甲硅烷基化的胞嘧啶(14)和8.3g的4A分子筛的混合物中。将反应混合物在氮气中室温搅拌5天。然后将反应混合物用50ml二氯甲烷和20ml水稀释，并且在剧烈搅拌下倾倒入2ml饱和NaHCO3水溶液中。将出现的白色沉淀(氢氧化亚锡)在硅藻土垫上滤出。从水中分出有机层并用水洗涤(3×30ml)。水层用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层并用Na2SO4干燥，然后真空蒸发得到糖浆状物，将其用硅胶柱层析(氯仿∶甲醇，96∶4)纯化得到15为白色固体，用2-丙醇重结晶得到1.53g产物(60％)。m.p.146-148℃，[α]25D＝-105.2(Cl，CH2Cl2)，UV(MeOH)λmax211.5，λmin 272.5，pH1，pH7；λmax 211.5，λmin284，pH9. 300MHz 1HNMR(CDCl3)δ3.65(d，2H，J＝4.85，H-5′)，4.00(t，1H，J＝3.72，H-3′)，4.11(m，1H，H-4′)，4.28(m，1H，H-2′)，4.38-4.55(m，6H，苄基-CH2)，5.56(d，1H，J-7.5，H-5)，6.39(d，1H，J＝4.59，H-1′)，7.12-7.31(m，15H，芳香-H)，7.63(d，1H，J＝7.5，H-6).
通过催化氢化15得到1-β-L-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶盐酸盐(16)将氯化钯(315mg，1.78mmole)悬浮在160ml甲醇中，室温下在氢气中振摇还原。然后在钯黑的酸性悬浮液中加入300mg 15的54ml甲醇溶液。室温下将反应混合物在氢气中振摇3小时。除去催化剂后，用Dowex(HCO3-)中和该溶液，真空浓缩然后用制备TLC(MeOH∶CHCl3，3∶5)得到糖浆状物，将其溶于3ml甲醇中，加入1％的HCl甲醇溶液至pH1，浓缩至干并用2一丙醇研制得到36mg(22.1％)16。m.p.190-194℃，[α]25D＝-115.47(C 0.07，H2O)；UV(H2O)λmax275，DH7；λmax209.5，273，pH11；λmax280，pH1；300MHz1HNMR(DMSO-d6)；δ3.61(d，2H，H-5′)，3.82(m，1H，H-4′)，3.93(m，1H，H-2′or H-3′)，4.04(brs，1H，H-2′)or H-3′)，5.18(brs，1H，C5′-OH，可互换的)，5.61(brs，1H，C2′-OHor C3′OH，可互换的)，5.67(brs，1H，C2′-OH orC3′-OH，可互换的)，6.00(d，1H，J＝4.02，H-1′)，6.01(d，1H，J5.6＝7.8，H-5)7.92(d，1H，J5.6＝7.8，H-6)，8.49(brs，1H，NH，可互换的)，9.38(brs，1H，NH，可互换的).
用三氯化硼处理化合物15得到1-β-L-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶盐酸盐(16)将5ml 1M三氯化硼的二氯甲烷溶液冷却至-72℃(干冰-丙酮)。将15(180mg，0.351mmole)的3ml二氯甲烷溶液缓慢地加入三氯化硼溶液中。总反应时间达2.75小时后，除去冷却浴并将溶剂和气体真空除去。将残余物溶于冷二氯甲烷(10ml)中并将溶液蒸发至干(3次，直到得到白色固体残余物)，加入冷的饱和碳酸氢钠溶液调pH至6-7。混合物用乙醇稀释，加热至沸，用活性炭处理，并过滤。将滤液蒸发至干得到糖浆状物并将其溶于3ml甲醇，加入1％的HCl甲醇溶液至pH1，浓缩至干并用2-丙醇研制得到16(66mg，78.4％)。
9-(2，3，5-三-O-苄基-β-L-阿拉伯糖基)腺嘌呤(18)将彻底干燥的化合物9(5g，8.8mmole)在0℃下加入82ml用无水氯化氢预饱和的二氯甲烷中。0℃反应2小时后，将沉淀对-硝基苯甲酸(1.53g)过滤除去，将沉淀真空浓缩成糖浆状物然后室温保持全真空2小时。将如此制备的氯化2，3，5-三-O-苄基-α-L-阿拉伯糖(10)溶于50ml二氯甲烷中，并将溶液加入4.5g(18.8mmole)干燥N-苯甲酰腺嘌呤5(17)和14.5g 4A分子筛的混合物中。将反应混合物室温下搅拌1周，通过硅藻土垫过滤，真空浓缩成糖浆状物，用己烷-丙酮(3∶1，Rf＝0.22)进行硅胶色谱纯化。分离产物并真空浓缩成糖浆状物，再在不锈钢高压气体贮罐中用甲醇化的氨(20ml)溶解并搅拌，在50-55℃加热过夜。将溶液减压浓缩得到半固体物并用热异丙醇重结晶得到2.4g 18(50.7％)。m.p.128-129℃.[α]27D＝-20.04(1.04，CH2Cl2)；UV(CH2Cl2)λmax213，258.5；250MHz1HNMR(CDCl3)δ1.95(brs，1H，NH，可互换的)，3.69(d，2H，J＝4.82，H-5′)，4.18-4.30(m，6H，苄基CH2)，4.51-4.64(m，3H，H-2′，3′，4′)，5.73(brs，1H，NH，可互换的)，6.52(d，1H，J-4.00，H-1′)，6.89-6.93，7.17-7.37(m，15H，苄基上的芳香H)，8.17(s，1H，H-2 or H-8)，8.32(s，1H，H-2或H-8).
9-β-L-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤(19)将三氯化硼(1M 5ml)的二氯甲烷溶液冷却至-72℃(干冰-丙酮)。将18(150mg，0.279mmole)的5ml二氯甲烷溶液缓缓加入三氯化硼溶液中。总反应时间达3.5小时后，除去冷却浴，真空除去溶剂和气体。将残余物溶于冷二氯甲烷(10ml)中并将溶液蒸发至干(6次，直至得到黄色固体残余物)。加入冷饱和碳酸氢钠溶液调pH至7-8。将混合物用乙醇稀释，加热至沸，用硅藻土过滤悬浮液，滤液真空浓缩成糖浆状物并用水重结晶。得到55mg(74％)19。
m.p.256-258℃，UV(H2O)λmax259；300MHz 1HNMR(DMSO-d6)δ3.62-3.66(m，2H，H-5′)，3.77(brs，1H，H-4′)，4.13(brs，2H，H-2′，3′)，5.12(t，1H，J＝5.4，C′5-OH，可互换的)，5.54(d，1H，J＝3.78，C′2-OH or C′3-OH，可互换的)，5.63(d，1H，J＝4.32，C′2-OH or C′3-OH，可互换的)，6.25(d，1H，J＝4.02，H-1′)，7.25(brs，2H，NH2，可互换的)，8.13(s，1H-H-2或H-8)，8.18(s，1H，H-2 or H-8).
图10是改变路线由1，-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃木糖(化合物3)制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(化合物10)的图解。
1，2-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃木糖(3)在650ml无水丙酮中加入4ml浓硫酸，5g分子筛(4A)，80g无水硫酸酮及40g L-木糖。将混合物室温搅拌36小时。然后将反应混合物过滤并用丙酮彻底洗涤，合并滤液并用氢氧化铵中和然后蒸发至干。加入乙酸乙酯(200ml)，然后过滤并蒸发，将所得油状物溶于250ml0.2％的HCl中并将溶液室温搅拌2.5小时。用饱和NaHCO3调pH至8，然后蒸发至干。残余物用乙酸乙酯萃取。除去溶剂得到黄色油状物3(41.7g，82.3％)。1H-NMR(CDCl3)δ5.979(d，J＝3.78Hz，1H，H-1)；4.519(d，J＝3.6Hz，1H，H-2)；4.308(bd，1H，H-3)；4.080(m，3H，H-4 and H-5)；1.321(s，3H，CH3)；1.253(s，3H，CH3).
5-O-苯甲酰基-1，2-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃木糖(25)将化合物3(41g，215.6mmol)0℃下在吡啶(150ml)和CH2Cl2(150ml)中搅拌。滴加溶于30ml吡啶中的BzCl(27.5ml，237mmol)。30分钟后，加入水(5ml)并将混合物蒸发至干，再溶于EtOAc中，用饱和NaHCO3洗涤，然后干燥(Na2SO4)。蒸发溶剂得到橙色糖浆再用Et2O结晶得到化合物20(36g)。将母液蒸发至干，残余物用硅胶柱层析纯化(1％CH3OH/CHCl3)得到另一批化合物25(12g，总收率76％)m.p.82-83℃.lit1D形式83.5-84.5℃.1H-NMR(CDCl3)δ7.43，8.07(m，5H，Ar-H)；5.97(d，1H，J＝3.6Hz，H-1)；4.80(q，1H，H-4)；4.60(d，1H，J＝3.6Hz，H-2)；4.40，4.20(m，3H，H-5，H-5′，H-3)；3.50(bs，1H，D2O可互换的，3OH)；1.51，1.32(2s，6H，2CH3).
5-O-苯甲酰基-1，2-二-O-异亚丙基-α-L-赤-呋喃戊-3-酮糖(26)将化合物25(40g，136mmol)在450ml CH2Cl2中搅拌。在其中加入重铬酸吡啶鎓盐(PDC，30.7g，81.6mmol)和Ac2O(42.3ml，448.8mmol)。将混合物回流2.5小时。将溶液浓缩至原体积的1/5，然后加入乙酸乙酯(50ml)，并过滤。将滤液倾到在硅胶短柱(10cm×5cm)上，用EtOAc洗脱，合并洗脱液并浓缩，用甲苯共蒸发(50ml×2)。用己烷和EtOAc结晶得到21，为白色固体(38g，96％)。m.p91-93℃，[α]D-132°(c，1.0，CHCl3)；lit2D形式m.p.93-94.5℃，[α]D+135°(c，1.0，CHCl3)；IR(KBr)1773cm-(ArCO)，173°Cm-(CO).1H-NMR(CDCl3)δ7.97，7.42(m，5H，Ar-H)；6.14(d，1H，J＝4.4Hz，H-1)；4.74，4.68(m，2H，H-4，H-2)；4.50 4.44(m，2H，H-5，H-5′)；1.52，1.44(2s，6H，2CH3)。元素分析理论值(C15H16O6)C，61.64；H，5.52；实测值C，61.42；H，5.53.
5-O-苯甲酰基-1，2-二-O-异亚丙基-α-L-赤-呋喃戊-3-酮糖(26)将化合物25(40g，136mmol)在450mlCH2Cl2中搅拌。在其中加入重铬酸吡啶鎓盐(PDC，30.7g，81.6mmol)和Ac2O(42.3ml，448.8mmol)。将混合物回流2.5小时。将其浓缩为原体积的1/5，然后加入乙酸乙酯(50ml)。将溶液过滤，并将滤液倾到在硅胶板(10cm×5cm)上，用EtOAc洗脱，合并洗脱液并浓缩，用甲苯共蒸发(50ml×2)。用己烷和EtOAc结晶得到26为白色固体(38g，96％)。m.p91-93℃，[α]D-132°(c，1.0，CHCl3)；lit2D形式m.p.93-94.5℃，[α]D+135°(c，1.0，CHCl3)；IR(KBr)1773cm-(ArCO)，173℃m-(CO).1H-NMR(CDCl3)δ7.97，7.42(m，5H，Ar-H)；6.14(d，1H，J＝4.4Hz，H-1)；4.74，4.68(m，2H，H-4，H-2)；4.50 4.44(m，2H，H-5，H-5′)；1.52，1.44(2s，6H，2CH3).元素分析理论值(C15H16O6)C，61.64 ；H，5.52；实测值C，61.42； H，5.53.
1，2-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃核糖(27)将化合物26(37g，127mmol)在0℃溶于EtOH/H2O(400ml/100ml)中，并分批加入NaBH4(23.3g，612mmol)。将悬浮液室温搅拌4小时。过滤并将滤液蒸发至干再用甲醇共蒸发。硅胶柱层析(0-15％CH3OH/CH2Cl2)之后从EtOAc/己烷中结晶，得到27为白色针晶(19g，79％)。m.p.86-87℃；[α]D-31.5°(c，0.62，CHCl3)；lit3，D形式m.p.86-87℃，[α]D+37°(c，0.59，CHCl3)；IR(KBr)3356cm-(OH).1H-NMR(CDCl3)δ5.83(d，1H，J＝3.98Hz，H-1)；4.595(t，1H，H-2)；4.055，3.72(m，4H，H-3，H-4，H-5，H-5′)；2.38(d，1H，D2O交换，3-OH)；1.83(t，1H，D2O交换，5-OH)；1.58，1.38(2s，6H，2CH3).元素分析理论值(C8H14O5)C，50.50；H，7.42；实测值C，50.62；H，7.46.
3，5-二-O-苯甲酰基-1，2-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃核糖(28)将化合物27(19g，100mmol)0℃下在300ml吡啶中搅拌，分批加入132cl(40ml，348mmol)然后在室温搅拌3小时。将溶剂蒸发至干。残余物用EtOAc萃取，用饱和NaHCO3洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂并用乙醚结晶得到23为白色固体39g(98％)m.p.83-85℃.1H-NMR(CDCl3)δ8.07，7.36(m，10H，Ar-H)；5.94(d，1H，J＝3.6Hz，H-1)；5.05，5.00(m，1H，H-2)；4.73，4.63(m，3H，H-4，H-5，H-5′)；1.58，1.35(2s，6H，2CH3).元素分析理论值(C22H22O7)C，66.50；H，5.64；实测值C，66.32，H，5.57.
1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖(31)将化合物28(38g，95mmol)在300ml 1％的HCl/CH3OH中室温搅拌30小时。加入吡啶(20ml)然后将溶液蒸发至干。残余物用吡啶共蒸发(30ml×2)，然后在0℃将其溶于100ml无水吡啶同时分滴加入BzCl(17ml，146mmol)，再于室温搅拌3小时。蒸发溶剂，将残余物溶于EtOAc中，依次用0.5N HCl和饱和NaHCO3洗涤，然后干燥(Na2SO4)。蒸发溶剂得粗产物30为糖浆状物。
将粗产物30在冰醛酸(400ml)中搅拌，然后在0℃加入Ac2O(100ml)同时分批加入浓H2SO4(10ml)将该溶液室温下搅拌过夜。将混合物倾入冰水中，用CHCl3萃取，用饱和NaHCO3中和，然后干燥(Na2SO4)。将溶剂蒸发之后，得到浅黄色糖浆状物，用甲醇结晶得到31为白色固体23.89g(49.6％，从28-31)。
m.p.124.7℃，[α]D＝45.613(c1.0，CHCl3)；lit4，m.p.129-130℃，[α]D＝-43.6(c 1.0，CHCl3).1H-NMR(CDCl3)δ7.317，8.134(m，15H，OBz)；6.437(s，1H，H-1)；5.835(m，2H，H-2 and H-3)；4.649(m，3H，H-4 and H-5)；2.003(s，3H，CH3COO-)II.生物活性本发明公开的化合物可以用下面详细公开的方法，或用其它本领域技术人员已知的方法评价其抗HBV和EBV活性。
实施例1 抗HBV生物活性用携带HBV的人肝细胞(2.2.15细胞)测定。该细胞在含10％的牛胎血清的最低基础培养基中生长至汇集。每隔3天换一次培养液。在汇集层上开始给药然后再继续培养3天。将培养液从培养物上除去之后再在原处加相同浓度的药并将培养物再继续保持3天。在给药6天后收集培养基并用聚乙二醇法沉淀病毒粒。随后消化病毒粒并进行Son thern分析。将印迹与特异性HBV探针杂交测定病毒DNA数量并比较未给药培养物的DNA水平。基因组DNA用HindIII消化并进行Southern分析。游离型DNA水平的测定与整合型HBV的DNA相关。计算与对照组相比DNA 50％抑制率(ID50)的药物浓度。结果概括于表I中。
表1通过L-核苷的HBV抑制率化合物 ID50(μM) MT2 CEM CD50(μM)抗-HBV活性 CD50(μM) CD50(HI cells)L-FMAU0.1 100 ＞100 1000D-FMAU2.0 8-910 50D-FEAU5.0 10090 2000L-FEAU ＞5.0 100 ＞100 900实施例2抗EBV的生物学活性将给药后的H1细胞保持在对数期生长2天。将细胞在室温下600g离心10分钟而将其从含有原有病毒粒的培养基中分离。将H1细胞接种在密度为1×105细胞/孔的24孔盘上，该盘为2ml含或不含药的新配培养基，于37℃保温5天。收集含有病毒粒子的培养基用于通过生物测定来评价药物对病毒生成和传染力的抑制作用。将病毒粒子从不含细胞培养基中通过SW-50 Ti转头(Beckman)在45000rpm离心90分钟沉淀将病毒粒子再悬浮于1ml生长液中并用于传染1×106Raji细胞48小时。由于重复传染后的Raji细胞中的EBV DP活性水平与所加病毒粒子的数量成正比，所以EBV特异性DP活性的降低便可测定。药物的抑制作用便可通过与多次稀释的对照组的EBV DP活性相比计算出来。没有发现用1mML-FMAU处理6天后H1细胞线粒体DNA的抑制。
狭缝印迹测定-线粒体DNA的数量用狭缝印迹法测定(2)。2×105给药和未给药的HI细胞在200μl 10mM的Tris、HCl(pH7.5)溶液中用冻/融法裂解。细胞裂解液用10μg/ml的RNase A37℃处理30分钟，然后用蛋白酶K(100μg/ml)在55℃处理2小时，在每个细胞裂解液中加入等量的20×SSC缓冲液。煮沸10分钟后，将样品滴到尼龙膜上(Hybond-N，Amersham Corp)。用放射标记的人线粒体DNA碎片作DNA杂交的探针。在除去线粒体DNA探针后的膜上再用人Alu DNA探测。给药和未给药的线粒体DNA的量可用光密度法确定(LKB Ulfroscan XL)结果列于表2。
表2药物 CD50(μM) ID90(μM) 治疗指数(CD50/ID90)PFA 1200±10075±5 16DHPG 75±6 5±1 15ACV 1000±75 50±8 20PCV 500±55 20±2 25L-FMAU 1000±80 5±0.8 200D-FMAU 50±100.1±0.02 50L-FEAU900±70 60±1115D-FEAU 2000±80 1±0.05 2000L-FIAC400±35 ＜10 ＞40D-FIAC125±15 5±0.5 25L-FIAU240±20 20±4 12D-FIAU 20±4 0.5±0.05 40化合物对EBV的抑制作用CD50通过将在培养基中37℃正常生长72小时的Hl细胞暴露于不同浓度的化合物中来表征；然后将细胞计数并与对照组比较。Hl细胞给药5天后用生物测定法测定ID90。实施例3 L-(-)-FMAU从血浆和肝中的清除率测定L-(-)-FMAU在口服给药的鼠血浆和肝中的清除率。给鼠接种用氚标记(放射特性为9.3μmol/μCi)的L-(-)-FMAU。
图11是小鼠在口服给药超时后的L-(-)-FMAU血浆浓度图，图12是在口服给药超时后鼠肝中的L-(-)-FMAU浓度图(十字形，每天两次10mg/kg给药30天先做药代动力学研究再在第31天给相同浓度的药黑圈；每天两次50mg/kg给药30天先做研究再在第31天给相同浓度的药；开口圈在研究的第一天第一次给50mg/kg的药)。
在指定的时间(见图10和11用肝素化的毛细管从鼠后眼窦放血。血浆用三氯乙酸萃取并用氟利昂/三辛胺中和。上清液直接计数并计算其浓度。
正如图10和11所指出的，血浆和肝中的L-(-)-FMAU的峰浓度出现在大约1小时。4小时后血浆和肝中的化合物彻底被清除。实施例4 L-(-)-FMAU在BDFI雌鼠中的毒性图13a是对照组BDFI雌鼠30天后的体重变化。图13b和13c是BDFI雌鼠分别给10mg/kg(13b)和50mg/kg(13c)每天两次L-(-)-FMAU30天后的体重变化。所示体重是5到7个鼠的平均体重和标准偏差。从图13b和13c可看出，L-(-)-FMAU在超过30天后并未对鼠体重产生显著的影响，这说明化合物有很好的耐受性。实施例5 L-(-)-FMAU给药后鼠血浆临床化学图14-20是以10mg/kg(3个鼠)或50mg/kg(3个鼠)每天两次给L-(-)-FMAU30天后鼠血浆的临床化学。
图14是鼠血浆中总胆红素浓度用mg/dL表示的直方图。图15是鼠血浆中碱性磷酸酶浓度用U/L表示的直方图。总胆红素和碱性磷酶是肝功能的指标。鼠胆红素值处在正常人范围(少于1.2mg/dL)，而碱性磷酸酶值略高于正常人水平(30-114U/L)图16鼠血浆中肌酸酐浓度用mg/dL表示的直方图。肌酸酐是肾功能的指标。除了鼠50-2之外，给药组鼠的肌酸酐水平与对照组鼠的肌酸酐水平没有差异。
图17是鼠血浆中AST(SGOT血清谷草转氨酶浓度用U/L表示的直方图。图18是鼠血浆中ALT(SGPT血清谷丙转氨酶)浓度用U/L表示的直方图。SGOT和SGPT是肝功能的指标。除了50-2鼠SGOT和SGPT均存在差异及10-2鼠只存在SGOT的差别外，给药组鼠的酶水平与对照组的没有差异。
图19是鼠血浆中乳酸浓度用mmol/L表示的直方图。图20是鼠血浆中乳酸脱氢酶(LDH)浓度用U/L表示的直方图。乳酸在肌肉进行糖酯解过程中形成。乳酸脱氢酶(LDH)在不同的组织中的以不同的异构体形式存在。乳酸脱氢酶释放进入而浆有可能是组织损伤的一种表现。给药组鼠的乳酸和乳酸脱氢酶水平与对照组的相比没有显著差异。III.寡核苷酸目标寡核苷酸序列可以通过用一种或几种本发明公开的L-核苷酸取代寡核苷酸序列中的一种核苷酸进行修饰。优选的实施方案是把L-核苷酸放在寡核苷酸的一个末端上。这种修饰的寡核苷酸序列可以用于很多技术，例如反义技术。
反义技术一般指基因表达的修饰，即将一个合成的寡核苷酸与一个互补核酸序列进行杂交而抑制基因的转录和复制(靶序列是DNA时)；翻译(靶序列是RNA)或抑制加工过程(如果靶序列是前-RNA)。细胞的各种活性可以通过这种技术来调节。一个简单的例子就是将反义寡核苷酸结合到信使RNA上后抑制了蛋白质的生物合成。在另外一个方案中，我们将一个合成的寡核苷酸与双链DNA上一段特定的基因序列杂交，形成的三链复合物能够抑制这段特定基因序列的表达。反义寡核苷酸同时也能用于激活基因表达，这种激活作用是通过间接抑制一种天然抑制剂的生物合成来实现的。AOT可用于抑制致病基因的表达。比如那些加速病毒复制的基因。这些病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、疱疹病毒、癌症、特别是实体肿瘤比如神经胶质瘤、乳腺癌和黑色素瘤。
一种选择出来的寡核苷酸对于核酸酶的稳定性是体外应用时的一个重要因素。我们已经知道3′-核酸外切酶的活性是降解血清中大多数未修饰的反义寡核苷酸的库因(Vlassov，V.V.，Yakubov，L.A.，in Prospecls for Anfisense Nucleic Acid Therapy ofCancers and AIDS，1991，243-266，Wiley-Liss，Inc.，New York；Nucleis Acids Res.，1993，21，145)在我们实验中，这里公开的L-核苷酸能将3′-核酸外切酶对反义寡核苷酸的降解作用降至最小。
本发明的能与多聚核糖核酸或多聚脱氧核糖核酸结合的寡核苷酸能够以常规的反义试剂同样的作用方式用作反义试剂。一般参见AntisenseMolecular Biology and S-oligos，Synthesis 1(Oct.1988)(Synthecell Corp.，Rockville，Md.出版)；2 Discoveries inAntisense Nucleic Acids(C.Brakel and R.Fraley eds.1989)；Uhlmann et.al.，“Antisense OligonucleotidesA New TherapeuticTechnique，”Chem.Rev.90(4)，1990；and Milligan J.F.，Matteucci M.D.，Martin，J.C.，J.Med.Chem.，1993，36，1923-1937。本发明的反义试剂也许可用来构建一种新的反义试剂，这样的反义试剂能选择性地与预先已确定的一段多聚脱氧核糖核酸序列或多聚核糖核酸序列或者含有这些序列的一种细胞结合(例如把反义试剂加入含有此种细胞的培养基中)这样反义试剂能被细胞吸收；与预先已确定的序列结合，因此阻断其转录、翻译或有复制。选择性地与反义试剂结合的必要条件是已知的(例如选择性地与从类基因组结合的一段长为17个碱基的核苷酸序列)。IV.药物组合物的制备本发明公开的化合物及其药学上可接受的盐、前药和衍生物可用于预防和治疗HBV和EBV病毒感染和其它相关的疾病例如呈抗HBV或抗EBV抗体阳性反应的疾病及HBV或EBV阳性反应疾病、HBV引起的慢性肝炎、肝硬化、急性肝炎、突发性肝炎、慢性持久性肝炎、疲劳等疾病。这些药剂或化合物对于那些抗HBV、抗EBV抗体阳性反应或HBV、EBV抗原阳性反应的临床病人以及有可能传染上HBV或EBV的人们起到预防或延缓病情恶化的作用。
治疗患了上述疾病中任何一种的病人，可以给他们服一定剂量的本发明所描述的、对HBV或EBV有效的一种或数种活性化合物，或者其药学上可接受的衍生物及其盐。使用这些药时可随意选择或介质或稀释剂。这些活性物质可以以任何适当途径服用，比如以液体或固体形式口服、消化道以外的途径服用、静脉注射、皮内注射、皮下注射、表面应用等。
这种活性化合物包含在药学上可接受的介质或稀释剂里，其剂量足以在施与病人后还能起到有效的治疗作用，并且对病人没有严重的毒副作用。
治疗上述提到的所有疾病的活性化合物优选的剂量范围为每天1-60mg/kg体重、1-20mg/kg更优选。大体上给病人的剂量范围在每天0.1到大约100mg/kg体重。药学上可接受的衍生物的有效剂量范围可以根据传递的原始核苷酸分子量来估计。如果衍生物本身就有活性，其有效剂量可以根据上述方法用衍生物分子量来估计、或者通过已知的其它方法来估计。具体用药时，活性化合物可按照产品说明书或者内科医生用药参考中对HIV适应所用的3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷(AZT)、2′，3′-双脱氧肌苷(DDI)、2′，3′-双脱氧胞苷(DDC)或者2′，3′-双脱氧-2′，3′-双脱氢胸苷(D4T)的说明来应用。
活性化合物适合以任何剂量形态单位来应用，包括但又并不局限在7-3000mg这一剂量范围，优选的是每单位剂量的活性成份是70-1400mg。通常优选的口服剂量是50-1000mg。
理想情况应该是用药后活性化合物在血浆中的浓度达到一个峰值，大约是0.2-70μM，当然1.0-10μM左右更好。这一浓度峰值可以通过比如静脉注射0.1-5％活性成份溶液来达到，可以任意选择含盐的注射液，或者把活性成份做成药丸来应用。
活性化合物以药学上可接受的盐的形式提供。这里我们所用的这种盐或混合物指的是核苷的盐或混合物，它们能保留我们所需要的母体化合物的生物活性而且存在最小的毒理作用。这些盐非限制性例子为(a)无机酸形成的酸加成盐(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)，还有有机酸形成的盐，比如醋酸、乙二酸、酒石酸、丁二酸、羟基丁二酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸以及多聚半乳糖醛酸；(b)阳离子形成的碱性盐例如，钠离子、钾离子、锌离子、钙离子、铋离子、钡离子、镁离子、铝离子、铜离子、钴离子、镍离子、镉离子、钠离子、钾离子等等，以及从N，N-二苯基乙二胺、氨或者乙二胺形成的有机阳离子或者(c)由(a)和(b)结合产生的化合物，比如单宁酸锌盐等等。
活性化合物的修饰，尤其是在N6位置或N4位置以及5′-O位置的修饰可以影响活性成份的生物有效性和代谢率，因此可以通过上述修饰来调节活性成份的传送。
药物成份中活性化合物浓度依赖于药物的吸收、钝化和排泄速度以及其它一些常见因素。需要特别指出的是剂量值随要减轻的疾病的严重程度而不同，对于任何特殊的受治疗者，要进一步认识到特定的剂量范围应根据个体需要和给药者或监督者的职业判断，随时间做调整。这里所确定的浓度范围仅仅是一个例子，我们的目的不是想要限定所需成份的范围。活性成份可以一次，或者在不同时间间隔分成小剂量多次给与。
口服活性化合物是一种优选的服药方式。口服成份一般包括一种惰性稀释剂或者一种可食用的介质。它们可以被包容在胶囊里或者压缩成片剂。为达到口服治疗的目的，活性化合物里掺入赋形剂，做成片剂、锭剂或胶囊来使用，药学上可接受的粘合剂或者一些辅助物质也可以作为药物成份的一部分。
片剂、药丸、胶囊、锭剂等等可以包含下述成份或者具有一种与之相似特点的化合物的任何一种一种粘合剂比如微晶纤维素、黄蓍胶或者明胶；一种赋形剂比如淀粉、乳糖；一种分裂剂如藻酸、伯凝胶或玉蜀黍淀粉；一种润滑剂如硬酯酸镁或硬酯酸盐；一种滑动剂如胶态二氧化硅；一种甜味剂如蔗糖或者糖精；或者包含一种香料如薄荷、水杨酸甲酯、或者橙色香料。当剂量单位形态是胶囊时，除了上述种种试剂外还可以包含一种液体介质。如脂肪族油。此外，剂量单位形态还可以包含各种其他物质，如糖衣、虫胶制剂或其它肠溶衣试剂，这些物质可以修饰剂量单位的物理形态。
活性化合物或药学上可接受的盐及其衍生物可用作酏剂、悬浮液、糖浆、粘剂、咀嚼剂等等药物的一个成份。除活性化合物外，糖浆还可以包含蔗糖这样的甜味剂以及某些防腐剂、染料、颜料和香料。
活性化合物，或者药学上可接受的衍生物及其盐也可以和其它活性物质混合，这些物质必须不含削弱活性化合物的活性；或者与一些能补充其活性的物质混合，例如抗生素、抗真菌药、消炎药，或者其它抗病毒药，包括抗HBV、抗EBV、抗巨细胞病毒，或者抗HIV或抗EBA试剂。
经非肠道途径、皮内、皮下或者表面应用的溶液或悬浮液可以包含下述成份用于注射的无菌稀释剂比如水、盐溶液、凝固的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌试剂如苯甲醇或羟苯甲醇甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸，柠檬酸或磷酸缓冲液以及一些增强体质的试剂如氯化钠或葡萄糖。含活性化合物的原始制剂可以装在安瓿瓶里，一次性注射器或者各种各样玻璃或塑料剂量瓶里。
如果是静脉注射，优选的介质是生理盐水或磷酸盐缓冲液。一个更优选的具体方案是活性化合物与介质一起制备，这样可以防止化合物迅速从体内排除，比如采取一种有控制的释放系统，包括植入法和包在微胶囊内的传送系统。这些介质可以是生物可降解的又具有生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐类，聚乙二醇酸，胶原蛋白，多聚原酸酯以及多聚乳酸。这些聚合物的制备方法对于那些内行人来说是很普通的。这些物质同样也可从Alza Corporalion和Nova PharmaceulicolsInc购买。
脂质体(包括把带有抗病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞作为靶向的脂质体)悬浮液作为药学上可接受的介质也是比较可取的。脂质体悬浮液可用本领域普通技术人员知道的方法来制备，例如美国专利号4,522,811中描述的方法(这里所引用的完全参考此专利的方法)。例如，把适当的脂类(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰卵磷脂、二十四烯酰卵磷脂，以及胆固醇)溶解在无机溶剂里，然后蒸发，容器表面留下一薄层干的脂类，将活性化合物或者衍生物的一磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐的水溶液加入到容器中，用手摇至脂类从表面脱离，在溶液中分散成均匀的脂质体悬浮液。
关于本发明的优选方案已作了叙述。对于本领域普通技术人员来说，根据前面对本发明的详细叙述而作出的对本发明的改变和修饰都是显而易见的。需要指出的是所有这些改变和修饰都包括在所附的权利要求的范围内。
权利要求
1.下式所示的L-核苷化合物 其中R为嘌呤或嘧啶碱基而R″为氢、酰基、烷基、单磷酸酯基、双磷酸酯基，或三磷酸酯基。
2.权利要求1的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗EBV或HBV感染药物中的应用。
3.应用于制备治疗EBV或HBV感染药物中的权利要求1的L-核苷及其药学上可接受的盐。
4.治疗人类HBV或EBV感染的方法，其中包括施用治疗HBV或EBV有效量的下式所示L-核苷 其中R为嘌呤或嘧啶碱基而R″为氢、酰基、烷基、单磷酸酯基、双磷酸酯基，或三磷酸酯基。
5.权利要求4的方法，其中L-核苷为2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷。
6.权利要求1的L-核苷，为2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷。
7.权利要求1或3的L-核苷，选自N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶，和N-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶。
8.权利要求1或3的L-核苷，其中碱基选自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-乙基尿嘧啶。
9.权利要求2的应用，其中L-核苷为2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷。
10.权利要求2的应用，其中L-核苷选自N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶，和N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶。
11.权利要求2的应用，其中碱基选自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-基尿嘧啶。
12.权利要求4的方法，其中L-核苷选自N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-乙基尿嘧啶，N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘胞嘧啶，和N1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶。
13.权利要求4的方法，其中碱基选自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，和5-乙基尿嘧啶。
全文摘要
一种治疗宿主，特别是人，HBV或EBV感染的方法，其中包括施用治疗HBV或EBV感染有效量的式(I)L-核苷，其中R为嘌呤或嘧啶碱基。作为一个优选方案，活性化合物为2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖基尿苷(也称为L-FMAU)。该化合物为低毒高效的抗HBV和EBV的抗病毒剂。其他活性化合物的特例包括N
文档编号C07H19/19GK1143966SQ95191415
公开日1997年2月26日 申请日期1995年1月30日 优先权日1994年1月28日
发明者C·K·朱, Y·C·程, B·S·派, G·Q·姚 申请人:佐治亚州大学研究基金会有限公司, 耶鲁大学