Lcmv-gp-vsv假型载体和肿瘤浸润性的病毒生产细胞用于肿瘤的治疗的制作方法

专利名称：Lcmv-gp-vsv假型载体和肿瘤浸润性的病毒生产细胞用于肿瘤的治疗的制作方法
lcmv-gp-vsv假型载体和肿瘤浸润性的病毒生产细胞用于
肿瘤的治疗 本发明涉及衍生自水泡性口炎病毒(VSV)的重组病毒和病毒载体其包含编码淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因，涉及产生GP-LCMV-假型化VSV病毒粒子的包装细胞，并涉及所述病毒粒子和包装细胞用于制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物的用途。
背景技术：
恶性神经胶质瘤(原生颅内脑瘤的最大的组)代表至今未解决的治疗问题。虽然通过高强度的基础研究，对此类肿瘤的生物学的理解已增长，临床过程和预后仍然很差。恶性神经胶质瘤是神经上皮起源的肿瘤并且在细胞学上被划分为室管膜瘤、少突神经胶质瘤、寡星状细胞瘤、星状细胞瘤和胶质母细胞瘤。弥漫浸润性星状细胞瘤(WHO级别II-IV)具有超过60%的比例，组成了颅内肿瘤的最大的组。于2001年修订的WHO分类被最广泛地作为星状细胞瘤的分级方案。根据WHO，介由组织学标准将脑瘤分为4种恶性级别(Kleihues和Cavenee，2000)。弥漫浸润性星状细胞瘤的预后通常不良。预后一方面取决于恶性级别，另一方面取决于肿瘤的位置和治疗方法。对于具有星状细胞瘤WHO级别II 的患者，平均存活时间多于5年；对于具有星状细胞瘤WHO级别III的患者，平均存活时间为2-5年；而对于具有WHO级别IV的星状细胞瘤-胶质母细胞瘤(=胶质母细胞瘤)的患者，平均存活时间少于1年。肿瘤的分子学发病机理是复杂的过程并且是由于负责控制细胞周期的不同基因的突变而产生的。肿瘤抑制因子基因P53中的突变是人类肿瘤中最常发现的改变并且既负责低级别星状细胞瘤的出现也负责向继发性胶质母细胞瘤的发展。原发出现的胶质母细胞瘤反而很罕见地具有P53突变。另一个指示弥散性星状细胞瘤的恶性趋势的基因被怀疑在染色体19的长臂上。在胶质母细胞瘤的情形中其他经常被改变的基因是致癌基因MDM2 和MDM4以及肿瘤抑制因子基因P14ARF，在细胞周期的p53依赖性控制中涉及它们(Dai和 Holland, 2001)。在30-40%的原发性胶质母细胞瘤中观察到了 EGF受体基因的扩增，因此其是此肿瘤组中最常被扩增的致癌基因(Holland，2001)。大多数恶性神经胶质瘤对化学或放射疗法的响应不良。其原因被怀疑是细胞周期相关基因的突变，所述基因也参与细胞凋亡的调控。因为从现存的治疗方法(例如化学或放射疗法)不再期待疾病预后的显著改善， 亟需用于恶性神经胶质瘤的更有效的治疗方法。而胶质母细胞瘤的基因治疗提供了有希望的可能性，所述可能性需被开发。为此目的，已开发了多个不同的、非常有效的基因。对于其中的大多数，也存在动物实验的数据(Shir和LeVitzki，2001)。这些治疗性基因可被划分为四种不同的作用原理(i)所谓自杀基因的基因产物将前体物质转化为细胞毒性分子。实例是单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)，与更昔洛韦的给药相结合。特别的优势是有毒的更昔洛韦三磷酸盐扩散到临近的细胞中，从而产生“旁观者(bystander)”效应。近年来，此酶的所述活性被进一步提高了。目前HSV TK是清除肿瘤细胞以及植入的载体产生细胞的很有效的可能性。(ii)免疫刺激性细胞因子(例如IL-4)在肿瘤中的表达可刺激抗肿瘤细胞的天然防御。(iii)抗血管生成蛋白(例如内皮他丁)的分泌引起血管的缺少，并因此引起代谢上非常活跃的肿瘤组织中营养供给的缺少。肿瘤实际上在经受饥饿。 (iv)最后，描述了一系列基因，其参与肿瘤细胞的细胞周期或信号转导从而抑制所述细胞的不受控生长。然而，这些基因在临床中的应用可能性是受限的，因为这些基因仅在经基因修饰的细胞自身中起作用，而不产生如所述第一个作用原理的“旁观者”效应。这意味着为了实现治疗效果，实际上所有的恶性细胞均需经过遗传修饰，而即使使用理想的载体系统，这也是没有希望的。多个现存的、非常有效的作用原理产生了对于胶质母细胞瘤的成功的基因治疗而言最重要的前提条件。然而，至此仍未解决的问题是至今低效的基因转移和治疗性基因在靶细胞中的不良表达。这也是为什么尽管有许多有效的治疗性基因，胶质母细胞瘤的基因治疗仍在临床中失败。病毒的基因转移相比于物理化学转染方法的优势是更高的基因转移率和基因的更长期表达，因为病毒发展了特别有效的机制来将其基因组引入细胞中并进行表达。作为溶瘤病毒(0V)，目前特别使用的是能够复制的病毒，例如单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒 (Ad)、新城疫病毒(NDV)、呼肠病毒和水泡性口炎病毒(VSV)。对于胶质母细胞瘤的最佳病毒治疗而言，OV应具有下列特征(i)它们应该具有肿瘤特异性趋向性，从而使病毒复制和细胞裂解保持受限于肿瘤组织。此特性可通过修饰病毒包膜或通过使用肿瘤特异性启动子而被增强。由于人们假设，仅有小部分神经胶质瘤细胞在治疗过程中分裂，既感染静止细胞又感染增殖细胞的病毒是有利的。(ii)出于安全相关的考虑，具有高遗传稳定性和在肿瘤组织外的低毒性的病毒特别适合于临床应用。这允许高病毒滴度和在GMP条件下纯化载体。理想地，所述OV对于人类应该是非致病性的并且在人群中应该具有低的传染率。已经存在的免疫性将引起病毒的过早中和并因此将阻碍有效的治疗。在胶质母细胞瘤的治疗中，溶瘤病毒的突出实例是减毒的HSV变体G207和1716 以及腺病毒0NYX-015。对于将溶瘤性的HSV用于治疗CNS肿瘤的严重异议是其在正常脑细胞中的高水平复制，这从而可引起威胁生命的脑炎。此外，除了潜在的持续性外，存在潜伏的HSV再活化的可能性。通过缺失多个基因产生了 HSV变体1716，其选择性地在快速增殖的CNS细胞中、而不在有丝分裂期后的神经元中复制。由此，可显著减少HSV的神经毒性。在大鼠和小鼠中用HSV1716治疗实验性神经胶质瘤引起肿瘤细胞的选择性破坏而周围的脑组织保持为未损伤的。0NYX-015是另外的被开发用于胶质母细胞瘤治疗的溶瘤病毒。 通过在ElB基因中的缺失，此腺病毒会选择性地裂解具有缺陷性p53的细胞。已在临床上测试了溶瘤性HSV和0NYX-015用于治疗神经胶质瘤。这两种减毒的溶瘤病毒均在临床I/II期研究中具有足够的安全性。不依赖于是否在肿瘤内或在切除腔内注射病毒，所述治疗被良好地耐受且没能观察到严重的副作用。然而，细胞裂解的效应仅仅是瞬时性质的，总是继以复发(Cutter等人，2006)。因为通常神经胶质瘤的增殖速率超过病毒的扩增速率和扩散波，仅通过溶瘤来破坏神经胶质瘤是值得怀疑的。相反地，对于有效的治疗而言，需要多种作用原理的组合。通过在OV中使用自杀基因或免疫调节基因，可在临床前的研究中显示出协同效应(Tyminski等人，2005 ；Fukuhara等人，2005)。除了前述DNA病毒外，溶瘤性RNA病毒也在开发中。VSV是有包膜的负链病毒，其宿主谱包括啮齿动物和家畜。人类的感染是罕见的且大多是无症状的。由于在人群中非常低的血清阳性率，将不预期通过VSV中和性抗体破坏治疗效率。VSV的感染和细胞质复制不依赖于细胞类型而发生，从而同等地感染分裂活跃的细胞和静止的细胞。VSV对肿瘤细胞的有效和优选的裂解与这些细胞中大多有缺陷的干扰素信号通路和与之相伴的优选的病毒复制有关(WoIlmarm等人，2007)。还可见，不依赖于细胞的免疫应答，在基因Myc、RaS或 P53中有缺陷的肿瘤细胞也支持VSV的繁殖(Barber，2004)。近年来，通过制备重组病毒进一步优化了 VSV的肿瘤特异性。其中主要焦点在于具有M蛋白中的突变(ΔΜ51)的变体。 此变体不阻止健康细胞中的干扰素应答，从而使这些细胞中的病毒复制被抑制。在具有缺陷性IFN应答的肿瘤细胞中，病毒能够复制并因此有选择性溶瘤活性。即使在全身性的施用之后，在小鼠模型中VSV"M51显示对于人神经胶质瘤的安全有效的溶瘤(Lim等人，2006)。直接在脑中施用病毒载体要求对于肿瘤细胞的高选择性并且仅可能在相对小的体积中。因此，仅能通过极高度浓缩的、对于神经胶质瘤细胞具有显著趋向性的载体制备物 (> 107ml)来实现有效的基因转移。在Y反转录病毒载体和慢病毒载体的情况下，可通过整合非反转录病毒包膜蛋白来影响载体趋向性和载体稳定性。通常用更稳定的VSV的G蛋白来代替反转录病毒的包膜蛋白。此类所谓假型载体的问题在于VSV-G是细胞毒性的(即在产生其的细胞中以及对于周围的健康组织而言)，这至今为止妨碍了此类VSV-G-假型在临床中的广泛应用。发明人已经开发了反转录病毒载体类型，其允许向CNS的神经胶质细胞中有效的基因转移。在此新的载体类型中，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP作为病毒的包膜蛋白(Miletic等人，1999 ;Beyer等人，2002 ;EP 1 006 196)。在比较性体外和体内趋向性研究中，显示了 LCMV-GP假型优选地转导神经胶质瘤细胞(Miletic等人，2004 ； Miletic等人，2007)。与之相反，VSV-G-假型特别地转导神经元，而在神经胶质瘤细胞中的基因转移不如用LCMV-GP-假型时有效。单个的浸润性肿瘤细胞也通过LCMV-GP-假型被有效地转导。在大鼠神经胶质瘤模型中，90%的大鼠通过肿瘤内注射LCMV-GP假型化的慢病毒载体而被治愈(Miletic等人；2007b)。所使用的载体编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶 (TK)，从而在被转导的细胞中以及周围的细胞中，将更昔洛韦转换为细胞毒性的三磷酸盐化合物。对于治疗的成功而言，决定性的不仅是在神经胶质瘤中选择性的基因转移，还有在整个肿瘤中高效的载体分布。因此，发明人开发了肿瘤浸润性包装细胞，其会在整个肿瘤中释放假型化的载体(W02006/008074)。有前景的具有迁移能力的细胞类型是多能成人祖细胞，其可从骨髓中被分离(Jiang等人，2002)。在移植实验中，借助大鼠神经胶质瘤模型研究了这些细胞的迁移表现。其中可见，祖细胞有效地穿透肿瘤团块，但不浸润周围的健康脑组织(Fischer等人，2007)。已建立的细胞系(例如3T3小鼠纤维原细胞、Rat-I大鼠纤维原细胞或人293T)未显示任何肿瘤浸润。事实上，这些细胞被局部限制在注射位点或附近且未显示神经胶质瘤特异性的迁移。在进一步的研究中，发明人检测了表达TK的祖细胞在大鼠神经胶质瘤模型中的治疗效力。这一研究的结果是，仅由于祖细胞和肿瘤细胞之间的“旁观者效应”，在70%的大鼠中实现了肿瘤的破坏(Miletic等人，2007)。此外，通过成像方法证实了祖细胞的肿瘤内定位。经治疗的、无症状的大鼠的组织学脑切片在肿瘤的位置处具有有显著疤痕组织的腔；这表明动物中的肿瘤通过基因治疗被成功地清除了。由于这些祖细胞的强扩增潜力，可能进行遗传修饰并随后选择单个的包装细胞克隆。开发了用于Y反转录病毒LCMV-GP假型的、基于祖细胞的包装细胞。这些包装细胞以l-7xlOE3TU/ml的滴度持续地产生反转录病毒载体。所述滴度在数周间以及在重复地冻融细胞之后保持稳定(Fischer等人，2007)。目前，是低效的体内基因转移而非缺少治疗上有效的基因阻碍胶质母细胞瘤的成功的基因治疗。至今为止已知的、用于神经胶质瘤的基因治疗和溶瘤病毒治疗的载体由于各种原因不是最佳的。迄今为止的基因转移方法的效率、特异性和安全性应被提高到这样的程度以使得治疗上有效的基因转移在患者中是可能的。因此，本发明的任务是开发治疗性基因的高效溶瘤性病毒基因转移系统，用于治疗高度恶性的脑瘤(例如神经胶质瘤)和其他实体肿瘤。发明简述因而，本发明的主题是水泡性口炎病毒(VSV)假型载体，其包含编码淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因，且不包含编码VSV的包膜蛋白G的功能性基因。LCMV-GP可以是LCMV的糖蛋白GP-I或GP-2。根据另一个特征，在VSV-LCMV-GP假型载体中，VSV的包膜蛋白G被LCMV的 GP (LCMV-GP)代替。根据另一个特征，所述载体缺少至少一个选自下组的基因编码VSV的N、L、P和M 蛋白的基因n、l、p和m。根据另一个特征，VSV的M蛋白包含降低VSV的致细胞病变性的突变。降低VSV 的致细胞病变性的突变的实例是在M蛋白的37PSAP4tl区域中的氨基酸置换，以及突变M33A、 M51A、V221F、S226R 或其组合。根据另一个特征，VSV-LCMV-GP假型载体包含至少一个治疗上可应用的转基因。所述转基因可以是自杀基因或免疫刺激性基因。自杀基因的实例是编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶、FKBP-FAS或Π(ΒΡ_胱天蛋白酶9的基因。免疫刺激性基因的实例是编码细胞因子IL-2、IL-4、IL-12、中和性抗TGF β或Flt3L的基因。根据另一个特征，VSV-LCMV-GP假型载体包含标记基因。所述标记基因可以是 LacZ、抗生素抗性基因或编码荧光蛋白(GFP、RFP、GGP等)的基因。本发明的主题还是VSV-LCMV-GP假型载体系统，其包含至少两种互补复制(kr)的 VSV载体；其中所述载体系统的一个载体包含编码LCMV-GP的基因gp ；其中所述载体系统还包含编码VSV的N、L、P和M蛋白的基因η、1、ρ和m，且不包含编码VSV的包膜蛋白G的功能性基因；其中所述载体系统的各载体缺少基因gp、η、1、ρ和m( “互补基因”)之一，且其中所缺少的基因存在于所述载体系统的其他载体上。优选地作为互补基因的是m和gp。根据另一个特征，VSV-LCMV-GP假型载体系统的M蛋白包含降低VSV的致细胞病变性的突变，如上文所述。
根据另一个特征，VSV-LCMV-GP假型载体系统包含至少一个治疗上可应用的转基因和/或标记基因，如上文所述。所述转基因/标记基因可位于所述载体系统的任何载体上。本发明另外的主题是以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子，其包含LCMV的GP蛋白作为包膜蛋白。本发明另外的主题是病毒生产细胞，其产生以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子。根据另外的特征，病毒生产细胞是成人干细胞。所述成人干细胞可以是多能成人祖细胞(MAPC)，神经干细胞(NSC)、间质干细胞(MSC)或衍生自MSC的BM-TIC细胞(源自骨髓的肿瘤浸润性细胞)。根据另外的特征，所述病毒生产细胞包含一个或多个用于表达选自下组的基因的
表达盒编码VSV的N、L、P和M蛋白的基因η、1、P和m，以及编码LCMV-GP糖蛋白的基因 gp°根据另外的特征，所述病毒生产细胞还包含用于包装为以LCMV-GP假型化的VSV 病毒粒子的基因转移载体。根据另外的特征，所述基因转移载体包含治疗上可应用的转基因和/或标记基因，如上文所述。本发明的其它主题是将转基因转移到细胞中的体外方法，在所述方法中，用以 LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子转导细胞，其中所述病毒粒子包含转基因。本发明的其它主题是将转基因转移到细胞中的体外方法，在所述方法中，使细胞与病毒生产细胞接触，所述病毒生产细胞产生以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子，其中所述病毒粒子包含转基因。 优选地，所述细胞是肿瘤细胞，例如神经胶质瘤细胞。本发明的其它主题是本发明的VSV-LCMV-GP假型载体或VSV_LCMV_GP假型载体系统用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗实体肿瘤。本发明的其它主题是以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗实体肿瘤。本发明的其它主题是本发明的病毒生产细胞用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗实体肿瘤。优选地，所述实体肿瘤是脑瘤，特别是神经胶质瘤。根据另一个特征，至少使用两个病毒生产细胞来制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物，其中第一个病毒生产细胞包含VSV-LCMV-GP假型载体系统的第一种载体，且第二个包装细胞包含VSV-LCMV-GP假型载体系统的第二种载体。本发明的主题还是药物组合物，其包含VSV-LCMV-GP假型载体、VSV_LCMV_GP假型载体系统、以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子或产生以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子的病毒生产细胞。所述组合物还可以包含合适的助剂和/或载体。


图 1 通过 LCMV GP 假型化 VSVgfp ncp- Δ G-载体图2 用VSV(LCMV GP)载体转导神经胶质瘤细胞系图 3 在 BM-TIC 中通过 LCMV GP 假型化 VSVgfp ncp- Δ G-载体
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图4 :kr VSV(LCMV-GP)载体系统的图示。a)载体之一包含rfp来代替磷蛋白P 且包含LCMV-GP来代替VSV-G。b)互补的载体编码a)中缺少的P蛋白，但是包含例如单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK)作为治疗性基因来代替病毒糖蛋白。两种载体均包含经修饰的 M 基因(Mncp)。图5:病毒载体的图示。在优化的载体中，克隆治疗性基因来代替P蛋白。除了免疫调节性基因(IL-12，Flt3L)之外，第二种载体还包含HSV的胸苷激酶。

发明内容
本发明涉及重组水泡性口炎病毒(VSV)和VSV载体。VSV基因组包含五个对于病毒的繁殖而言是关键的基因1、m、η、P和g，其编码蛋白L、M、N、P和G。N是核蛋白，其包装 VSV基因组RNA ；VSV基因组仅能作为RNA-蛋白质复合物被复制。L和P —同形成聚合酶复合物，其复制VSV基因组并转录VSV mRNA。M是基质蛋白，其在病毒颗粒中构成脂包膜与核衣壳间的一种配件(Kit)并且其对于细胞膜上的颗粒出芽是重要的。G是包膜蛋白，其被嵌入病毒包膜中并且对于病毒的感染性是关键的。本发明的主题是VSV-LCMV-GP假型载体和以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子。本发明的载体包含编码LCMV的GP蛋白的基因gp来代替编码VSV的G蛋白的基因g。相应地，本发明的病毒/病毒粒子包含LCMV-GP蛋白作为包膜蛋白。所述GP蛋白可以是GPl或 GP2。本发明包括来自不同LCMV株系的GP蛋白。特别的，LCMV-GP变体可衍生自LCMV野生型或 LCMV 株系 LCMV-WE、LCMV-ffE-HPI, LCMV-ffE-HPIopt (W02006/008074)。相比于反转录病毒载体，基于水泡性口炎病毒的载体具有多种优势(i) VSV载体是溶瘤性的并且与其他溶瘤性病毒载体相比，其具有特别高的溶瘤活性。(ii) VSV载体优选在肿瘤细胞中复制并且与其他溶瘤性病毒载体相比，其具有特别高的复制能力。(iii) VSV载体感染分裂活跃的细胞以及静止的细胞。(iv) VSV载体诱导强的先天的(innate)体液和细胞免疫应答。(v) VSV载体完全是胞质复制，因此其作为RNA病毒，既不能整合到宿主细胞的基因组中也不能重组为能够复制的病毒。(vi)VSV载体容易包装。 (vi i) VSV糖蛋白与外来包膜蛋白是可互换的。迄今为止嵌入到VSV包膜中的糖蛋白的实例是:HIVgpl60 (Owens 和 Rosel993)，HCVE1/E2 (Tani 等人，2007)，SARS S (Ge 等人， 2006)和 Lassa GP (Garbutt 等人，2004)。综上，VSV载体具有特别大的治疗潜能。根据本发明的VSV-LCMV-GP假型载体的另一个优点是以LCMV-GP假型化的VSV病毒针对健康的脑细胞(即神经元)显著降低的毒性。VSV的神经毒性归因于VSV的G蛋白 (Shinosaki等人，2005)。其实，VSV-G假型优选地感染正常的神经元。由于对于溶瘤性VSV 的所有应用而言，神经趋向性是剂量限制性的，使用根据本发明的载体对于所有的肿瘤都是很有利的。此外，VSV-LCMV-GP假型载体对于脑瘤细胞具有增加的特异性，这源于所使用的LCMV-GP糖蛋白的神经胶质瘤特异性趋向性和VSV在肿瘤细胞中的选择性转录/复制。与 VSV-G相反，LCMV-GP包膜蛋白对于胶质母细胞瘤细胞具有特别的趋向性。然而，根据本发明的载体也能够被成功地用于CNS外的其他肿瘤中，因为VSV的神经毒性(特别是在全身性应用的情况下)在那些地方也是剂量限制性的。以LCMV-GP假型化的载体具有未假型化的载体所没有的三个决定性的特性，即(i) LCMV-GP不是细胞毒性的。(ii) LCMV-GP假型载体可通过超速离心法被浓缩而不丧失感染性。(iii) LCMV-GP假型载体显示对于神经胶质细胞的优选的趋向性，而神经元被低效地感染。本发明既包括复制缺陷性的病毒也包括能够复制的病毒。后者具有另外的优势， 因为通过使用能够繁殖的病毒可实现高的转导率。在这方面，能够复制的溶瘤性病毒载体比不能复制的载体更有效。为了在治疗性应用中使用可复制的病毒时提高安全性，提供载体系统，其确保VSV 病毒的复制、溶瘤和产生仅在被至少两种彼此互补的复制缺陷性载体感染的细胞中发生。本发明的主题因此是VSV-LCMV-GP假型载体系统，其包含至少两种互补的VSV载体。此类互补复制性(kr)VSV载体能够限制性地在肿瘤组织内扩散，这提高了基因转移和溶瘤的效率。因此，根据本发明的载体系统使得能够制备具有有限繁殖能力的溶瘤性 VSV-LCMV-GP假型载体，其用于神经胶质瘤和其他实体肿瘤中的基因转移。根据本发明的载体系统的原理是所述系统的各载体缺少VSV的关键性基因m、n、l 和P之一或LCMV的gp，然而，所述缺少的基因存在于所述系统的其他载体上。编码LCMV-GP 的基因gp和可选的其他基因(例如治疗基因和/或标记基因)可以存在于所述系统的任何载体上。根据本发明的载体系统的不同变体是可能的。例如，所述载体系统可由两种载体组成，图5中所示。第一种载体包含LCMV的GP来代替VSV的G，且缺失编码P蛋白的基因 P。第二种载体也不包含VSV-G，但表达VSV的P蛋白。各载体表达VSV的核蛋白(N)和聚合酶(L)以及M蛋白的致细胞病变性较弱的变体(Mn。p)。所述第一种载体还携带标记基因 rfp，而第二种载体携带自杀基因HSV-TK和标记基因gfp。在图6中所示的变体中，两种载体均可包含治疗性基因，其中第一种载体包含例如Flt3L或IL-12，且第二种载体包含例如 HSV-TK。迄今为止，已追踪了治疗胶质母细胞瘤的不同概念(i)转移自杀基因，(ii)借助于免疫刺激性基因并介由基于细胞因子的免疫治疗来消除胶质母细胞瘤引起的免疫抑制， (iii)转移阻碍肿瘤诱导的血管生成的因子，(iv)使用细胞周期调节剂和(ν)诱导细胞凋亡。为了本发明的目的，主要考虑前三种方式(i-iii)。除了其固有的溶瘤特性，根据本发明的VSV-LCMV-GP假型载体和基于其的载体系统可通过引入自杀基因或/和免疫刺激性基因而被进一步改善。自杀蛋白的实例是单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶、FKBP-FAS或FKBP-胱天蛋白酶9。免疫刺激性蛋白的实例是细胞因子(例如IL-2、IL-4、11^-12和？1130、中和性抗16卩3。最多4. 5kb 大的基因插入被VSV基因组容忍，从而甚至能够在一个VSV基因组中联合两个或更多个治疗性基因(例如HSV-TK+细胞因子)。此外，基因产物也介由所谓的旁观者效应在未被感染的肿瘤细胞上发挥作用。被注射的病毒载体从注射位点向肿瘤组织中仅渗透几毫米。为了优化载体分布且为了靶向地破坏肿瘤，使用肿瘤浸润性的病毒生产细胞，所述肿瘤浸润性的病毒生产细胞特异性地迁移到肿瘤中，从而在远离注射位点的位置释放病毒。在本发明意义中，病毒生产细胞既包括用于从不能复制的载体生产病毒粒子的经典包装细胞，也包括用于从能够繁殖的载体生产病毒粒子的生产细胞。包装细胞通常包含一个或多个用于表达关键基因的质粒，所述关键基因从待包装的相应载体中缺少和/或对于产生病毒粒子是必需的。在迄今为止的研究中，虽然包装细胞被用于转移病毒载体；然而，这主要涉及不向肿瘤中迁移的纤维原细胞(Short等人，1990, Culver等人，1992)。相反地，成人干细胞(特别是神经干细胞(NSC)和间质干细胞(MSC))具有高迁移潜力。他们保持被限制在肿瘤组织中，从而实现非常有效但也是特异性的、向肿瘤组织中的基因转移。然而，这些干细胞在体外具有有限的传代能力。成人间质干细胞的亚群(所谓的BM_TIC(源自骨髓的肿瘤浸润性细胞))在被注射到经实验诱导的神经胶质瘤中后浸润整个肿瘤，并且此外，其追踪离开肿瘤团块的单个肿瘤细胞(Miletic等人，2007)。BM-TIC是从成人骨髓中分离的，其具有高扩展潜力且可被用作用于MLV (Fischer等人，2007)和VSV载体的迁移性生产细胞。本发明的主题因此是产生溶瘤性VSV-LCMV-GP假型载体的病毒生产细胞。特别地，这些细胞是肿瘤浸润性的生产细胞，当其在肿瘤内迁移时释放所述载体。优选的是成人干细胞，特别是神经干细胞(NSC)和间质干细胞(MSC)。特别优选的是衍生自MSC的BM-TIC 细胞。对于制备棒状病毒的病毒生产细胞而言，障碍是蛋白M和G的致细胞病变性。由于在本发明的VSV-LCMV-GP假型载体中，VSV的G蛋白被神经胶质瘤特异性的和非细胞毒性的、LCMV的糖蛋白所代替，仅M蛋白仍然是问题。为了在产生VSV的细胞系中减少M蛋白的毒性，可使用M蛋白的非致细胞病变性变体。因此，本发明的病毒生产细胞以及相应地由所述细胞产生的VSV-LCMV-GP假型载体可相应地包含编码突变的M蛋白的基因。这一载体变体对于肿瘤细胞是选择性溶瘤性的，而其对于健康的细胞是无毒的。优选的是在M蛋白的37PSAP4°区域中有氨基酸置换的M 变体，或在M蛋白的PSAP区域外具有单一 (M51R)或多重(V221F和S226R ；M33A和M51A) 突变的M变体。特别优选的是包含突变M33A、M51R、V221F和S226R的M蛋白。为了确保包装细胞中有效的病毒生产，可用病毒干扰素拮抗剂稳定地转染所述M变体。此外，本发明的主题是用于基因转移的体外方法，其中将包含转基因的 LCMV-GP-VSV假型载体或LCMV-GP-VSV假型载体系统直接地、或借助于本发明的病毒生产细胞(包装细胞)引入细胞中。如果使用具有至少两种载体的kr载体系统，则使用至少两个包装细胞，其各产生所述(不能复制的)kr载体中的一种。VSV病毒的产生仅发生在被所述kr载体系统的所有载体所感染、并相应地包含所有关键病毒基因的细胞中。此外，本发明涉及根据本发明的载体和病毒生产细胞在治疗方法中作为药物的用途。特别地，本发明的载体和病毒生产细胞用于实体肿瘤的治疗。所述治疗效果既通过所述重组载体和病毒的溶瘤特性也通过使用治疗性基因而产生。
实体肿瘤可以是脑瘤、肝肿瘤(特别是肝细胞癌)、肺肿瘤(特别是支气管癌)和肠肿瘤(特别是结肠癌)。优选的肿瘤是脑瘤，例如神经胶质瘤，特别是室管膜瘤、少突神经胶质瘤、寡星状细胞瘤、星状细胞瘤、胶质母细胞瘤或髓母细胞瘤。本发明的主题还是药物组合物，其包含本发明的载体、病毒粒子、病毒生产细胞和可选地添加剂(例如载体和助剂)。为了提高病毒的溶瘤性和治疗性基因的转移效率，将持续释放载体的、肿瘤浸润性的病毒生产细胞配制为用于直接植入肿瘤中。根据下述实施例阐释本发明。
实施例实施例1 通i寸LCMV-GP-假型仆Jfe彳本转导神经胶质瘤细朐用编码GFP但不编码病毒包膜蛋白的缺陷性VSV载体(VSVgfp-ncp- Δ G)转导 ΒΗΚ-21和Vero细胞，所述ΒΗΚ-21和Vero细胞转而稳定地表达LCMV的GP。每24孔板腔中接种 IxlO5 细胞(BHK-21, -GP，Vero, -GP)，四小时后用 VSVgfp-ncp-Δ G 载体以 MOI = 5 进行转导。24小时后，收集培养物上清并通过对ΒΗΚ21中的GFP表达进行FACS分析来确定滴度。图1显示，被转导的细胞产生LCMV-GP-假型化VSV载体，其中取决于所使用的细胞类型，假型滴度在2-7xlOE 5TU/ml间变化。由于所述假型意在用于神经胶质瘤中的基因转移，检测了所述载体对于不同的神经胶质瘤细胞系的转导效率。测试了两种人神经胶质瘤细胞系(U87、G44)和大鼠神经胶质瘤细胞系(9L)。BHK-21再次被用作对照。每24孔板腔中接种IxlO5细胞，四小时后用 VSV-LCMV-GP假型载体以MOI = 0. 3 (在BHK-21上滴定)进行转导。24小时后，通过FACS 分析确定表达GFP的细胞的百分比并由此计算出滴度。图2显示，神经胶质瘤细胞系有效地被LCMV-GP假型化VSV载体转导了。实施例2 在多能祖细胞中包装VSV-LCMV-GP假型载体发明人已经显示了根据C. Verfaillie的方案分离的干细胞(Jiang等人，2002) 具有肿瘤浸润的特性。由于仅检测了其迁移潜力而没检测其分化潜力，将这些细胞称为BM-TIC(源自骨髓的肿瘤浸润性细胞)。为了测试BM-TIC对于VSV载体的包装能力， 以缺陷性的VSV-GFP载体转导表达LCMV-GP的BM-TIC。每24孔板腔中接种IxlO5细胞 (BM-TIC，-GP，BHK-21)，四小时后用VSVgfp-ncp-AG载体以MOI = 5进行转导。24小时后， 收集培养物上清并在BHK-21细胞上滴定。图3显示，也可以在BM-TIC中制备VSV-LCMV-GP 假型。然而，滴度相比于例如BHK-21GP细胞较低(见图1)。实施例3 开发互补复制性(kr) VSV-LCMV-GP假型载体用能够繁殖的病毒允许实现高转导率。为了提高神经胶质瘤中的基因转移率并同时确保高度的安全性，建立了受限的、能够复制的VSV假型载体。对于反转录病毒 (Trajcevski等人，2004)和不同的黄病毒(Ri印1和Mandl，2007)，已描述了具有互补的缺陷性病毒的复制系统。此类系统的原理是在两个不完全的复制子中分配病毒基因组。当同一个细胞被两种载体均感染时才能产生感染性的病毒，并且只有通过这种共感染，才包含所有用于包装病毒基因组的必要组份。图4显示了根据本发明的载体系统的互补性载体的实例。为了有效的复制和包装，第一种载体缺少磷蛋白P。为了能够更简单地确定这些载体的病毒滴度，所述载体编码红色荧光蛋白(rfp)来代替P。所缺少的P功能通过用第二种载体共转染细胞而得到补给。 然而，所述第二种载体单独不能够繁殖，因为其缺少关键的包膜蛋白VSV-G。治疗性基因借助于此载体而被施用。正链RNA病毒的基因组RNA单独地就是感染性的，而负链RNA病毒(例如VSV)为了从克隆的病毒cDNA产生感染性的病毒粒子，除病毒RNA基因组外还至少需要病毒核蛋白 (N)和病毒聚合酶(L)。制备重组VSV的系统是基于病毒(+)RNA和病毒蛋白N、P和L的胞质表达，所述胞质表达借助于构成性地在BSR T7/5细胞中表达的T7-RNA聚合酶。为了制备所需要的载体，用基因组构建体与N、P和L的表达质粒以及还有VSV-G的表达质粒在载体 b)的情况下(图4)) 一同共转染到BSR T7/5中。通过将如此获得的病毒传递给反式(in trans)表达所缺少的组份的细胞，能够可观地提高滴度。对于LCMV-GP缺陷性载体，建立了稳定表达GP的BHK-21细胞系。对于P缺陷性载体，建立了表达P蛋白的BHK-21细胞系。制备和表征kr LCMV-GP-假型化VSV载体在关于其滴度和其转导效率表征了单个载体后，在体外检测了所述载体的扩散。 为此，用两种载体共转染BHK-21细胞并通过将培养物上清在天然BHK-21上的系列传递来检测复制以及新载体的出现。用作为单层以及作为椭球体培养的不同胶质母细胞瘤细胞系 (G44、G62、U87)重复了这些实验。肿瘤椭球体是三维的器官样细胞组，其比单层培养物更好地反映肿瘤的性质和异质性。分裂活跃的肿瘤细胞以松散的集合位于细胞聚集体的边缘处，而更深处的细胞不再分裂并且也在此发生坏死区域的形成(Carlson等人，1984)。所述椭球体实验提供了关于 krVSV-LCMV-GP假型载体系统的肿瘤内转导效率、扩散动力学和溶瘤效果的信息。因此，此类椭球体使得能够对所述系统进行初始优化而不必进行动物实验。在动物模型中检测了 kr LCMV-GP-假型化VSV载体可能的毒性、溶瘤的治疗效果和去除肿瘤后病毒的残存(见实施例6)。病毒RNA聚合酶没有重组酶活性且在细胞质中也没有细胞的重组酶，从而两个负链RNA病毒间的重组仅能通过RNA聚合酶的模板交换实现。然而，这是极其罕见的事件 (Finke和Conzelmann，2005 ；Spann等人，2003)。重组的、可复制的VSV的产生提出了安全性风险并对此进行了检测。其中，在不同的时间点从经共转染的细胞的培养物上清中分离病毒RNA并用转基因特异性(例如gfp)探针在RNA印迹中进行检测。如果具有“过度长度”的RNA种类是可检测的，对来自上清的病毒进行噬斑纯化并介由标准方法就其感染性进行检测并随后进行分子生物学表征。实施例4 建立用于制备治疗上有效的VSV(LCMV-GP)假型载体的迁移性生产细胞对于kr VSV载体和不能复制的VSV-LCMV-GP载体建立了迁移性的VSV-LCMV-GP 生产细胞。不同M变体的制备和表征VSV M蛋白在VSV循环中有两个重要的任务。一方面，其作为病毒粒子的结构组份对于病毒的装配和出芽是关键的。另一方面，所述VSV M蛋白通过其宿主蛋白合成的“宿主关闭”活性以及通过诱导细胞凋亡而显著地促成病毒致病。在此关联中，M蛋白的重要的功能是抑制IFN mRNA的核-细胞质转运。由此，细胞抵抗病毒感染的第一个防御机制就被抑制了。由于此种强毒性效果，不可能长期在细胞系中表达M蛋白。然而，已知M蛋白中引起病毒的减毒的多个突变。Irie和同事们表明了通过在M蛋白的所谓37PSAP4°区中的氨基酸置换，产生了具有大大降低的致细胞病变性的VSV突变体(Irie等人，2007)。此外，如在小鼠实验中所显示的，在所述PSAP区域之外有单个突变(M51R)或多个突变(V221F和 S226R ;M33A 和 M51A)的 M 变体也被大大减毒了(Desforges 等人，2001 Jayakar 和 Whitt， 2002)。这些病毒不抑制IFN-a/β的释放并因而诱导保护动物抵抗感染的抗病毒状态。然而，在经常在IFN系统中有缺陷的肿瘤中，这些病毒能够繁殖并溶解肿瘤。由于安全性技术的原因，此类减毒的变体对于基因治疗有特别的意义，因为其优选地在肿瘤细胞中复制。发明人也克隆了 M蛋白的非致细胞病变性变体(Mnep)，其包含所述的突变M33A、 M51R、V221F和S226R且不再抑制IFN-β的合成。此变体以类似于亲本病毒的效率在IFN 不健全的细胞上复制，但其在IFN健全的细胞上是减毒的。为了确保BM-TIC中有效的病毒生产，用病毒干扰素拮抗剂(Haller等人，2006)稳定地转染所述细胞。制备和表征用于VSV-LCMV-GP假型载体的衍牛自BM-TIC的牛产细胞因为基于VSV-LCMV-GP假型的神经胶质瘤特异性趋向性，主要是肿瘤细胞被转导，也可备选地使用仍显示一定的致细胞病变性的M变体。为了使毒性效应在BM-TIC中保持是低的，应通过Tet-可诱导性启动子使抗病毒的MxA蛋白在细胞中表达。具有Tet-可诱导性启动子的反转录病毒载体是已知的(L5W等人，2006)。也通过反转录病毒载体将 Tet-反应性元件(tTA)引入BM-TIC中。MxA是干扰素诱导的、具有针对RNA病毒的抗病毒活性的GTP酶(Pavlovic等人，1992 ;Staheli和Pavl0vic，1991)。在细胞质内，其以大
寡聚体的形式存在，其是无毒的且通过迄今仍不清楚的机制抑制VSV的复制。用Tet-调控的MxA和tTA载体转导表达LCMV-GP的BM-TIC，且随后用VSV载体感染所述表达LCMV-GP 的BM-TIC。只要培养基中存在抗生素，细胞就通过MxA而对VSV(LCMV-GP)的生产性感染有抗性。直至体内应用期间才去除抗生素并且逐渐发生VSV(LCMV-GP)的病毒复制和生产。 由于具有两天的半衰期的MxA是非常稳定的，备选地使用突变体MxA(L612K)。MxA(L612K) 以与野生型蛋白相同的效力抑制VSV的感染，但不形成寡聚体。由此其被去稳定化并具有仅两小时的短的半衰期(Janzen等人，2000)。产生具有非致细胞病变性M的载体的BM-TIC和通过表达MxA来防止VSV-相关裂解的BM-TIC这两种生产细胞如下被表征(i)确定载体的滴度和载体产生的持续时间。(ii)分析细胞的冷冻和融化对于载体滴度的影响。(iii)首先在椭球体模型中，随后在动物模型中分析细胞是否仍具有肿瘤浸润的特性和在肿瘤组织中达到了何种转导效率。(iv)检测所产生的载体上清中可复制的VSV的存在。实施例5 治疗性基因的克隆和包装自杀基因可用于作为根据本发明的治疗性基因。此类基因的实例是单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)，对其在临床中有最多的经验。通过HSV-TK的构成性表达，可以在治疗结束时可靠地清除包装细胞和被转导的肿瘤细胞，从而没有危险可产生自有有丝分裂活性的包装细胞。
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为了恶性神经胶质瘤的免疫治疗，即为了强化在脑中较弱地产生的局部免疫应答，可使用免疫调节性基因。此类基因的实例是细胞因子，特别是IL-12和Flt3L。在抗原刺激之后，IL-12被抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞和B细胞)天然地分泌并介导强的基于Thl的抗肿瘤免疫应答。其增强了天然T细胞的生长和其向Thl细胞的分化并因此阻碍了神经胶质瘤所诱导的对T细胞增殖和IFNy的产生的抑制。IL-12增强天然杀伤者细胞和⑶8+细胞的细胞毒性活性且此外具有抗血管生成的活性(Majewski等人，1996)。 在多个动物模型中，已经令人印象深刻地表明了 IL-12介导的免疫应答抵抗神经胶质瘤的效力(Toda等人，1998 ;Kikuchi等人，1999)。细胞因子Flt3L对于呈递抗原的树突细胞的增殖和分化是关键的，因此其似乎特别适于基因治疗方法。Sumia和同事(2004)在用 Flt3L基因在大鼠/小鼠中皮内(i.e.)转导神经胶质瘤后，观察到强的树突细胞的局部汇聚。70%经治疗的大鼠显示出肿瘤的衰退并存活了。细胞因子和自杀基因(TK)的组合不仅提供最大的安全性，也由于“旁观者效应” 允许了仅以低的转导效率进行成功的治疗。此方法联合了三种作用原理，即病毒溶瘤作用、 自杀基因诱导的细胞凋亡和局部的免疫刺激，以提高胶质母细胞瘤的基因治疗效率。首先，将IL-12和Flt3L克隆到VSV载体中。IL-12是有物种特异性活性的，从而必须使用鼠类的IL-12来在大鼠神经胶质瘤模型中进行测试。相反地，人和鼠类的Flt3L 是超过70%同源的并且在两个物种中是交叉反应的。将免疫刺激性基因克隆到ρ基因的位置处，而第二种载体上的TKgfp或gfp代替了 VSV-G基因。将下列基因组合克隆到kr VSV-LCMV-GP假型载体系统的两种载体中(图5)1)载体 a = IL12 或 Flt3L+ 载体 b = TKgfp (或 TK)2)载体 a = IL12 或 Flt3L+ 载体 b = gfp3)载体 a = IL12 或 Flt3L+载体 b =空白4)载体 a =空白 + 载体 b = TKgfp (或 TK)5)载体a =空白+载体b = gfp6)载体a =空白+载体b =空白克隆之后，转导神经胶质瘤细胞系和BM-TIC，并在ELISA中检验上清中细胞因子的浓度。产生有生理学意义的量，然后通过超速离心浓缩所述载体。所述载体首先用于转导椭球体并在此系统中检测其“旁观者致死”的能力。然后，将载体上清与所制备的包装细胞一同送到Bergen我们的合作伙伴处。在那里，在同系大鼠神经胶质瘤模型中进行体内测试。施用更昔洛韦后评估了经处理的大鼠的存活率。与此同时，检测了没有TK时免疫治疗的治疗效果。载体组合6)提供了关于溶瘤作用的效力的信息。通过MRI和PET观察了肿瘤的大小及治疗成果(Miletic等人，2007)。借助于检测浸润性细胞的免疫组织化学方法评估免疫调节基因的效果。如下文中所述，也在人神经胶质瘤模型中检测了所述治疗方法。^MM 6 在两种神经胶质瘤樽型φ测丨试？台疗^^乍用Jj^串首先在体外表征所述重组VSV载体，并随后在动物模型中研究其效力。为此，使用了两种特别有意义的大鼠模型。将同系的9L大鼠神经胶质瘤模型用于免疫学方面的检测或免疫治疗方法的实施。为此，将神经胶质瘤细胞系植入Fisher大鼠的脑中，所述Fisher大鼠于是在几天后产生肿瘤。分离自Fisher大鼠的9L神经胶质肉瘤细胞在此作为肿瘤细胞系。然后将各种载体或细胞系立体地注射到所诱导的肿瘤中。此大鼠模型具有下列特征(i)其表现为具有低的个体间变化的可良好重复的系统。(ii)肿瘤具有与人神经胶质瘤类似的特性，例如入侵性的和侵略性的生长行为以及产生TGFii 2作为免疫抑制因子。(iii)与SCID/裸鼠模型或大鼠异种移植模型相反，所述系统允许免疫学方面的检测或免疫治疗方法的测试。裸大鼠中的人神经胶质瘤模型被用于测试根据本发明的载体和细胞针对人神经胶质瘤细胞的溶瘤活性。大鼠异种移植模型模仿人神经胶质瘤的各种生长特性。在此，不使用确定的胶质母细胞瘤细胞系而是使用来自患者的原发性肿瘤材料用于建立肿瘤，从而允许模仿人神经胶质瘤内的异质性(Sakariassen等人，2006)。通过人神经胶质瘤在裸大鼠中的连续传代，可展现恶性肿瘤发展的不同时期并检测治疗成果。人神经胶质瘤模型特别适于研究治疗性方法，因为其具有下列特征(i)肿瘤具有与人神经胶质瘤相似的特征，例如入侵性的和侵略性的生长行为。不是使用神经胶质瘤细胞系而是使用原发的患者材料来建立肿瘤。(ii)通过肿瘤的连续传代，可展现恶性肿瘤发展的不同时期并检验治疗成果。第一代的肿瘤生长缓慢，是高度入侵性的并具有低度的神经血管生成。通过传代产生了具有强的增殖和减少的入侵的高度血管生成性表型。(iii)高度入侵、非血管生成的神经胶质瘤的细胞表型与肿瘤干细胞相似。因此， 此动物模型使得能够在人GBM的干细胞组份上测试我们的概念的治疗效果。可区分两类肿瘤(i)具有慢的、高度侵略性生长行为的早期肿瘤。这些肿瘤仅具有低度的血管生成。(ii)高度供血且快速生长的晚期肿瘤。此表型表现低的入侵性。人神经胶质瘤模型非常适于研究自杀基因疗法以及病毒的溶瘤作用。然而，目前为止，不存在可用于分析基因治疗方法的免疫治疗效力的人胶质母细胞瘤的动物模型。介由成像方法并最终用组织学技术分析和评估了治疗成果。首先，通过在大鼠神经胶质瘤模型中肿瘤内注射浓缩的载体上清检测了互补复制性VSV(LCMV-GP)假型的作用方式。几天后，借助对冷冻切片的荧光显微分析检测了编码gfp的载体在肿瘤内的转导效率和分布。此外，以免疫组织化学的方式判断了免疫细胞的溶瘤作用和迁入。作为补充，也在人胶质母细胞瘤的动物模型中检测了所述效力。在相同的模型中，检测了 BM-TIC生产细胞的迁移能力和所产生的VSV载体的感染性。为此，使细胞负载绿色染料，而所释放的载体编码rfp。前述方法允许基于荧光简单地区分BM-TIC和经转导的肿瘤细胞。最后，比较了编码单个转基因的假型的治疗效率。为此，应将包装细胞以及同时将浓缩的载体上清注射到已建立的9L肿瘤中。载体应包含与TK相组合的免疫刺激性基因。 立体施用所述载体或包装细胞后几天，开始施用更昔洛韦。一些实验动物包含仅有TK的载体，并用于评估载体中免疫调节组份的治疗效率。处理完成后，基于肿瘤的大小用成像方法 (MRI ；PET)评估单个治疗概念的效力。经免疫治疗的大鼠的脑的一部分被用于表征免疫状态。介由免疫组织化学方法在冷冻切片上检测MHC分子的表达和T细胞、粒细胞、巨噬细胞和小神经胶质细胞的分布。此外，通过流式细胞术分析了皮内浸润性细胞的数量和表型组成。针对人神经胶质瘤的治疗，调适具有最佳治疗效果的制剂。此种原型可被直接转移到临床前的安全性研究中，并且在建立了用于GMP生产的相应方法后，可被转移到临床测试中。参考文献1. 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1.VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，所述载体包含编码淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因且不包含编码VSV的包膜蛋白G的功能性基因。
2.根据权利要求1的VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，所述VSV的包膜蛋白G被 LCMV的GP代替。
3.根据权利要求1或2的VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，VSV的M蛋白包含降低 VSV的致细胞病变性的突变。
4.根据权利要求1-3中任一项的VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，所述假型载体包含至少一个转基因。
5.根据权利要求4的VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，所述转基因编码自杀蛋白、 免疫刺激性蛋白或标记蛋白。
6.根据权利要求5的VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，所述自杀蛋白是单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、细胞因子脱氨酶、FKBP-FAS或FKBP-胱天蛋白酶9。
7.根据权利要求5的VSV-LCMV-GP假型载体，其特征在于，所述免疫刺激性蛋白是 IL-2、IL-4、IL-12、中和性抗 TGF β 或 Flt3L。
8.VSV-LCMV-GP假型载体系统，其特征在于，所述系统包含至少两种互补复制性VSV载体，其中所述系统包含编码VSV的N、L、P和M蛋白的基因n、l、p和m，编码LCMV-GP的基因 gp，且不包含功能性的、编码VSV的G蛋白的基因，并且其中所述系统的各载体缺少基因η、 1、P、m和gp之一，并且其中所缺少的基因存在于所述系统的其它载体上。
9.根据权利要求8的VSV-LCMV-GP假型载体系统，其特征在于，VSV的M蛋白包含至少一个降低VSV的致细胞病变性的突变。
10.根据权利要求8或9的VSV-LCMV-GP假型载体系统，其特征在于，所述系统包含至少一个转基因。
11.假型化VSV病毒粒子，其特征在于，所述病毒粒子包含LCMV的GP蛋白作为包膜蛋白。
12.病毒生产细胞，其特征在于，所述细胞产生根据权利要求11的假型化VSV病毒粒子。
13.根据权利要求12的病毒生产细胞，其特征在于，所述细胞是成人干细胞。
14.根据权利要求12或13的病毒生产细胞，其特征在于，所述成人干细胞是成人多能祖细胞(MAPC)、神经干细胞(NSC)，间质干细胞(MSC)或BM-TIC(源自骨髓的肿瘤浸润性细胞)。
15.根据权利要求12-14中任一项的病毒生产细胞，其特征在于，所述细胞包含用于表达选自下组的基因中的至少一个的一个或多个表达盒编码VSV的N、L、P和M蛋白的基因 η、1、ρ和m，和编码LCMV-GP糖蛋白的基因gp。
16.根据权利要求12-15中任一项的病毒生产细胞，其特征在于，所述细胞包含用于包装为以LCMV-GP假型化的VSV病毒粒子的基因转移载体，其中所述基因转移载体包含转基因。
17.根据权利要求16的病毒生产细胞，其特征在于，所述转基因是编码自杀蛋白、免疫刺激性蛋白和/或标记蛋白的基因。
18.用于在体外将转基因转移到细胞中的方法，其特征在于，用根据权利要求11的假型化VSV病毒粒子转导所述细胞，其中所述病毒粒子包含转基因。
19.用于在体外将转基因转移到细胞中的方法，其特征在于，使所述细胞与根据权利要求16或17的病毒生产细胞相接触。
20.根据权利要求18或19的方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。
21.根据权利要求1-7中任一项的VSV-LCMV-GP假型载体、根据权利要求8_10中任一项的VSV-LCMV-GP假型载体系统、根据权利要求11的假型化VSV病毒粒子、或根据权利要求12-17中任一项的病毒生产细胞用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于实体肿瘤的治疗。
22.根据权利要求21的用途，其特征在于，所述肿瘤为脑瘤。
23.根据权利要求22的用途，其特征在于，所述肿瘤为恶性脑瘤。
24.药物组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求1-7中任一项的 VSV-LCMV-GP假型载体、根据权利要求8-10中任一项的VSV-LCMV-GP假型载体系统、根据权利要求11的假型化VSV病毒粒子、或根据权利要求12-17中任一项的病毒生产细胞。
全文摘要
本发明涉及包含淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP以代替VSV的G蛋白的重组VSV病毒和病毒载体，涉及产生LCMV-GP-假型化VSV病毒粒子的病毒生产细胞，并且涉及所述载体和细胞用于治疗实体肿瘤、特别是脑瘤的用途。
文档编号A61K35/76GK102224248SQ200980146679
公开日2011年10月19日 申请日期2009年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者多萝特·冯·莱尔, 萨南·黑曼 申请人:多萝特·冯·莱尔