专利名称：Cd5的制作方法
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末梢B细胞瘤慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤代表了最常见的淋巴细胞性白血病。顾名思义，其可以表示为白血病或淋巴瘤。然而，关于该瘤的两种表现慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)在形态学上、显型上以及遗传型上很难区分，唯一差别在于外周血液淋巴细胞的程度。
CLL是西方国家成年人最常见的白血病。在CLL中，外周血液包含缺乏细胞质的小而圆的淋巴细胞。在所有采取小淋巴细胞的空隙渗透形式或非类结核(nonparatubular)聚集形式的CLL和多数SLL的情形中，都已经观察到骨髓紊乱。CLL和SLL中的肿瘤细胞表达pan B细胞标记物CD29和CD20。此外，CD5，一种仅仅在在正常B细胞的小亚型上表达的T细胞标记物，存在于该肿瘤细胞上。CLL细胞的免疫显型是唯一的。CLL细胞共同表达B淋巴细胞谱系标记物CD19和T淋巴细胞标记物CD5。CLL细胞还显示出特征水平的免疫球蛋白受体的表达。通常，肿瘤细胞还具有对带有κ或λ轻链的Ig重链的低水平的表面表达。
CLL为B淋巴细胞的无性系恶性肿瘤。该疾病通常无痛，并带有长命的小淋巴细胞(其对抗原刺激缺乏免疫竞争和应答)缓慢的逐渐累积。CLL不能用常规的细胞毒素化学疗法来治愈(Cheson等，Blood1996；874990-4997；和Keating等，Blood 1993；812878-2884)。CLL的标志是孤立的淋巴细胞增多。白血球量通常大于20,000/μL并可能显著地升高到几十万。CLL的诊断要求淋巴细胞绝对量大于4000/mm3。CLL临床表现为淋巴细胞的免疫抑制、骨髓衰竭和器官浸透。免疫缺陷还涉及由异常B细胞产生的不充分的抗体。随着疾病的发展，CLL可以通过直接组织渗透而造成损伤。
在某些情况下，患者可以产生皮肤淋巴瘤沉淀-皮肤上的红斑损伤。该损伤可以包括小而圆的B细胞的非典型淋巴表皮渗透。
概述已经发现某些小分子免疫应答调节剂(IRMs)具有提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面分子表达的用途。因此，某些IRMs可以用于治疗CD5+B细胞淋巴瘤，例如，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤或具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤。
因此，本发明提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤的方法。通常，该方法包括对患者给服能有效改善CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种症状或临床信号的量的IRM化合物。在一些具体实例中，服用IRM化合物可以导致在两个月内外周血淋巴细胞、淋巴结病或脾肿大减少至少50％。在另外的具体实例中，给药IRM化合物可以抑制以至预防进行性疾病的发展，其中进行性疾病(表现)为淋巴细胞循环至少提高50％或发展至更显著的阶段。在又一个具体实例中，给服IRM化合物可以解决与CD5+B细胞淋巴瘤相关的结节状的红斑损伤。
另一方面，本发明提供一种提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子表达的方法。通常，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与至少一种可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子表达的IRM接触。在一些具体实例中，该细胞表面分子可以是共同刺激的分子。
另一方面，本发明还提供一种刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以产生细胞因子的方法，其通过将CD5+B细胞淋巴瘤细胞与能够有效诱导产生比由未接触IRM的CD5+B细胞淋巴瘤细胞所产生的水平更高水平细胞因子的IRM接触。在一些具体实例中，细胞因子可以是IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、GM-CSF或其组合。
另一方面，本发明提供一种提高CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞增殖的方法。通常，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面的至少一种共刺激分子的表达的IRM接触，随后将CD8+T细胞与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，从而活化CD8+T细胞；其中该活化的T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞，且与CD5+B细胞淋巴瘤细胞(没有和IRM接触)接触的T细胞相比，证明可以提高增殖。
在一些具体实例中，CD8+T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异性的。在其他具体实例中，CD8+T细胞为幼稚细胞。
在一些具体实例中，IRM化合物对被诊断为具有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给药，因此活化的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞为自体同源性的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞。
在一些具体实例中，可以用一种或多种其他的免疫调节剂(例如IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明还提供一种通过细胞毒性T细胞提高杀灭CD5+B细胞淋巴瘤细胞的方法。通常，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与能够有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面的至少一种共刺激分子表达的IRM接触，随后将CD8+T细胞与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，从而活化CD8+T细胞；其中该活化的T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞，且和未与IRM接触的CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触的T细胞相比，显示出提高了的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的杀灭。
在一些具体实例中，CD8+T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异性的。在其他具体实例中，CD8+T细胞为幼稚细胞。
在一些具体实例中，IRM化合物对被诊断为具有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给药，从而活化的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞为自体同源的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞。
在一些具体实例中，可以用一种或多种其他的免疫调节剂(例如IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明还提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤患者的方法，包括对患者给服可以有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子表达的IRM。
另一方面，本发明还提供一种疫苗，其包含分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞或其免疫活性部分，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经与可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子表达的IRM接触。在某些具体实例中，可以用一种或多种其他的免疫调节剂(例如IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞剂。
另一方面，本发明还提供一种制备疫苗的方法，包括用IRM接触分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞，以有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子的表达。一些具体实例可以包括用一种或多种其他的免疫调节剂(例如IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞。在另外的具体实例中，该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞可以来源于被诊断为CLL或SLL的患者。
在一些具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤细胞可以是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)细胞、套细胞淋巴瘤细胞、具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤或其组合。
在一些具体实例中，IRM是TLR7激动剂。在一些具体实例中，IRM是TLR8激动剂。在一些具体实例中，IRM是TLR7和TLR8两者的激动剂。
在一些具体实例中，IRM可以是咪唑并喹啉胺、四氢咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、1，2-桥接咪唑并喹啉胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并萘啶胺、四氢咪唑并萘啶胺、噁唑喹啉胺、噻唑喹啉胺、噁唑吡啶胺、噻唑吡啶胺、噁唑萘啶胺或噻唑萘啶胺。在某些具体实例中，IRM为咪唑并喹啉胺，例如1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺基。在另外的具体实例中，IRM为四氢咪唑并喹啉胺，例如4-胺基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇水合物。在另外的具体实例中，IRM为磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺，例如N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲烷磺酰胺。
在一些具体实例中，表达提高的至少一种细胞表面分子可以是CD20、CD22或CD23，且该方法进一步包括用治疗剂(其具有提高表达的细胞表面分子的靶点)对患者给药。在一些具体实例中，可以提高超过一种细胞表面分子的表达。
在一些具体实例中，表达提高的至少一种共刺激分子可以是CD40、CD54、CD80、CD83、CD86、CD25或CD38。在一些具体实例中，可以提高超过一种共刺激分子的表达。
在一些具体实例中，IRM可以在体外与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触。在另外的具体实例中，IRM可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，例如在患者的器官、组织或血液。
比照以下详细说明、实施例、权利要求和附图将很容易明白本发明的其它多种特性和优点。在整个详细说明的多处由实施例的列表提供引导。在每个实例中，所列举的列表仅作为代表性的组，并不作为唯一的列表。
图1A-B通过IRM化合物提高CLL细胞上共刺激分子的表达。
图2A-CIRM1化合物(有或者没有IL-2)在由CLL细胞表达的共刺激分子上的效果。
图3A-BIRM化合物在CLL细胞刺激细胞毒性T细胞增殖效率上的效果。
图4A-C在CLL细胞表达的共刺激分子上IRM化合物、IL-2和PKC激动剂的效果。
图5A-B通过PKC激动剂、IL-2和IRM诱导T细胞细胞毒性抵抗自体同源的CLL细胞。
图6A-B淋巴瘤的皮肤沉淀在治疗前(图6a)和用IRM治疗后(图6b)的照片。
图7IRM1在由CLL细胞表达的共刺激分子上的效果。
图8A-BIRM3对于由CLL细胞表达的CD80和CD83上的效果。
图9在CLL细胞表面分子表达中，IRM3介导的改变。
图10IRM3+IL-2提高在CLL细胞上CD20的表达。
实施方式本发明提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤的方法，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。尽管大量临床观察表明CD5+B细胞淋巴瘤细胞可以受到T细胞介导的调节免疫识别的影响(参见例如Ribera等BloodCells 1987；12471-483；Ziegler-Heitbrock等Blood 1989；731426-1430；Wierda等Blood 2000；962917-2924；Gitelson等Clin Cancer Res.2003；991656-1665；和Pavletic等Bone Marrow Transplant 2000；25717-722)，CD5+B细胞淋巴瘤细胞的弱免疫原性已经限制了基于免疫治疗方法的发展，并因此促进了疾病发展。
本发明第一次证明将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与免疫应答调节剂(IRM)化合物接触可以用于治疗CD5+B细胞淋巴瘤。IRM化合物似乎由基础免疫系统机制(通称Toll状受体(TLRs))引起某些细胞因子、趋化因子和共刺激分子选择的生物合成。因此，某些IRM化合物可以选择性地诱导免疫系统的某些方面或一致免疫系统的其它方面。特别是，IRM化合物可以提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面分子表达、增强CD5+B细胞淋巴瘤的细胞免疫原性，并提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤的新的免疫治疗方法。在某些情况下，该提高表达的细胞表面分子可以是共刺激分子。提高共刺激分子的细胞表面的表达可以使CD5+B细胞淋巴瘤细胞变成有效的抗原递呈细胞(APCs)，并能引发和/或保持瘤反应性的T细胞活性。
在此使用的以下术语具有下列意义“改善”是指表示具体病症的程度、严重性、发生频度和/或症状或临床征象可能性的任何减少。
“CD5+B细胞淋巴瘤细胞”是指具有独特免疫显型的赘生性细胞，包括CD19和CD5的共同表达。除表达B淋巴细胞谱系标记物CD19之外，CD5+B细胞淋巴瘤细胞还表达T淋巴细胞标记物CD5，其通常仅表达正常B细胞的一个小亚类。CD5+B细胞淋巴瘤细胞包括例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)细胞、套细胞淋巴瘤细胞和具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤。在一些具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤细胞是CLL细胞或SLL细胞。在某些特定的具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤细胞是CLL细胞。
“细胞表面分子”是指一种分子，其在细胞表面上表达并可以用来测定该细胞的谱系或用来区别细胞或与其它细胞的类型。
“病者”或“患者”包括例如动物，例如但不限于人类、非人类灵长类、啮齿类、犬、猫、马、猪、绵羊、山羊或牛。
“病征”或“临床征象”是指与能够被除该患者外的个体发现的特定状况相关的客观物理发现。
“症状”是指疾病或患者状况的任何主观证据。
除非另作说明、“一种”、“一个”、“该”和“至少一个”可交替使用并且意思是一个或更多个。
某些IRM化合物(例如TLR7和/或TLR8的激动剂)可以提高提高CD5+B细胞淋巴瘤的大量细胞表面分子(包括例如，共刺激分子)的表达，这能导致更有效提高抗CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫反应。因此，提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面分子的表达可以用于治疗减缓或终止该疾病的发展。在某些具体实例中，治疗可以逆转该疾病的病程，在某些情形中甚至达到完全解决的程度，即治愈该疾病。
除具有治疗效用外，已提高一种或多种共刺激分子和/或其它细胞表面分子的表达的CD5+B细胞淋巴瘤细胞可以具有诊断或研究的效用。
在幼稚T细胞中诱导细胞增殖和产生细胞因子需要两个信号。第一信号是外来抗原，其通过存在于抗原递呈细胞(APC)的表面的自身主要组织相容性复合体(MHC)。抗原肽-MHC复合体在幼稚T细胞表面与T细胞受体(TCR)相互作用，从而对免疫反应提供特异性抗原。第二信号是“共同刺激”信号。共同刺激信号是抗原非依赖性的，并通过促进例如T细胞存活、无性系膨胀、细胞因子分泌和效应物功能的特异性受体-配体相互作用由APC提供给幼稚T细胞细胞因子。
在两个信号的共同存在下，可以产生一个适合的免疫应答。然而，在缺乏共同刺激信号的情况下，淋巴细胞可能无法对抗原刺激有效应答。免疫系统的这种无应答可以导致免疫耐受性。
因此，此处使用的“共刺激分子”是指细胞表面分子亚类的一员，(除介绍的MHCI分子外)，以产生生产性的免疫反应，但其表达不足以独立地产生生产性的免疫反应。共刺激分子的实例包括但不局限于B7族成员(包括例如，B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS-L(B7RP1)和PDL-1)、Ig超级族的其它分子(包括例如，CD2和OX2)、缺乏死亡域的TNF:TNFR亚族分子(包括例如，CD40、OX40、CD27、4-1BB和CD30)和一些整联蛋白(包括例如，VLA-4、ICAM-1和ICAM-3)。
可以使用很多已知的方法提高一种或多种细胞表面分子的表达，包括在此描述的任何方法。例如，该方法包括但不局限于，流式细胞术、免疫组织相容、逆录酶聚合酶连锁反应(RT-PCR)包括连续变异RT-PCR、和RNA印迹分析。
在一些具体实例中，可以刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以提高CD20、CD22、CD23、CD25、CD38、CD40、CD54、CD80、CD83或CD86中一种或多种的表达。
在某些的具体实例中，可以刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以提高治疗剂靶点的细胞表面分子的表达，治疗剂例如为与细胞表面分子特异性结合的单克隆抗体。这样，提高细胞表面分子的表达可以用于靶点是细胞表面分子的治疗。例如，Rituximab(美罗华)是一种以单CD20为靶点的单克隆抗体，并已经证明有效治疗非霍奇金淋巴瘤。Rituximab结合表达CD20的B细胞，从而表记那些用于通过免疫系统消除的Rituximab标记的细胞。因此，一种治疗包括，例如(a)提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞上的CD20的表达，以及随后(b)给服Rituximab可使得Rituximab与CD5+B细胞淋巴瘤细胞粘合，从而对用于通过免疫系统消除的CD5+B细胞淋巴瘤进行标记，并从而使得Rituximab能够有效治疗CD5+B细胞淋巴瘤。其它在CD5+B细胞淋巴瘤细胞中提高表达且可以作为治疗剂靶点的细胞表面分子包括例如CD22和CD23。
在一些具体实例中，可以通过将CD5+B细胞淋巴瘤细胞与能够有效产生大于没有接触IRM的CD5+B细胞淋巴瘤细胞所产生的细因子的IRM接触，刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以产生细胞因子。在一些具体实例中，IRM化合物可以是一种或多种TLRs激动剂，例如TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR7和TLR8激动剂。产生的细胞因子可以包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、GM-CSF和其组合。
在一些具体实例中，IRM化合物可以在体外与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，例如在细胞培养中。在另外的具体实例中，IRM化合物可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，即CD5+B细胞淋巴瘤细胞和IRM化合物在器官、组织或血液里接触。在此情况下，可以通过例如给对被诊断为CD5+B细胞淋巴瘤的患者给服IRM化合物，可以使CD5+B细胞淋巴瘤的细胞在患者体内与IRM化合物接触。直接给患者给服IRM使得CD5+B细胞淋巴瘤细胞在与IRM接触之后，活化自体同源的T细胞(即患者自身的T细胞)，从而产生对抗CD5+B细胞淋巴瘤的细胞的T细胞依赖性的免疫反应。通过使用患者自身T细胞群产生对CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫反应，也许可以减少甚至消除与涉及给服异源的生物试样治疗相关的某些风险(例如炎症、排异等)。
IRM化合物可以经由任何合适的方法给药，包括例如，非肠道给药、皮下给药、鼻内给药和口服。下面详细描述了IRM化合物给药的合适的制剂。
在一些具体实例中，可以给患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给服临床有效量的、可有效提高在CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面上的至少一种共刺激分子表达的IRM。此处使用的“临床有效量”是显示出一种或多种临床迹象有效改善的量。该临床改善迹象可以包括任何用于医疗实践或实验室研究的度量。参考，例如Cheson等，National CancerInstitute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocyticleukemiarevised guidelines for diagnosis and treatment.Blood.1996；874990-4997。例如，临床有效量可以是得到部分反应(PR)的有效量。此处使用的“部分反应”是至少两个月，外周血淋巴细胞、淋巴结病和/或脾肿大减少至少约50％。临床有效量可以是得到完全反应(CR)的有效量。此处使用的“完全反应”指没有检查出白血病或淋巴瘤细胞。临床有效量可以是预防进行性疾病(PD)的有效量。此处使用的“进行性疾病”指通过已知的病理标准测定的淋巴细胞循环至少提高约50％或组织发展为更加严重性的。临床有效量可以是提高长期生存可能性或程度的有效量。可选择地，临床有效量可以是减少或改善至少一种与CD5+B细胞淋巴瘤相关的症状或临床征象的量。例如，临床有效量可以是足以减少严重性、程度或皮肤淋巴瘤沉淀的数量的量。
在一些具体实例中，用CD5+B细胞淋巴瘤细胞接触一种或多种IRMs的效果可以通过用一种或多种另外的免疫调节剂进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞来增强。在这种具体实例中，IRM与一种或多种另外的免疫调节剂可以是一种组合，例如一种治疗的组合。如果该成分以这样的形式提供允许CD5+B细胞淋巴瘤细胞与一个成分接触的生物效应持续不变至少直到该CD5+B细胞淋巴瘤细胞与另一个成分接触，则该组合的成分据信可以彼此“组合”的方式递送。因此，即使该成分以单独的制剂提供、经由不同的给药途径传递和/或不同时期给药，它们也可以彼此结合递送。
适合的免疫调节药剂可以包括，例如白介素-2(“IL-2”)。IL-2是一种抗原刺激T淋巴细胞的生长因子，并在抗原识别后导致T细胞无性系膨胀。IL-2可以从许多已知的来源获得。例如，临床级IL-2可以商业购买，例如从ChironCorporation，San Francisco，CA购买。
在一些具体实例中，IL-2可以在体外与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，例如在细胞培养中。在另外的具体实例中，IL-2可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，即CD5+B细胞淋巴瘤细胞和IL-2在器官、组织或血液里接触。在此情况下，例如用IL-2对患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给药，可以使IL-2在患者体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触。IL-2可以经由任何合适的方法给药，包括例如，非肠道、皮下、鼻内和口服。下面详细描写给药了IL-2的合适的制剂。
用于任何具体实例的IL-2的精确量可以根据该领域已知的因素来改变，包括但不限于，IL-2的物理和化学性质、与IL-2组合提供的IRM或IRMs的物理和化学性质、预期的剂量服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、PKC激动剂给药方法、是否有任何其它免疫调节药剂与PKC激动剂联合给药、以及所给药的物种。因此，指定PKC激动剂所有可能的有效量通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适用量。例如，IL-2可以根据类似与这样的(Rosenberg等通过给服IL-2以治疗黑素瘤和肾细胞恶性肿瘤)步骤对患者给药。Rosenberg等，JAMA，1994；271907-913。
另一个适合的免疫调节药剂可以包括，例如蛋白激酶C(PKC)激动剂。PKC激动剂的实例包括但不限于佛波醇酯(Totterman等，Nature，1980；288176-178)和苔藓虫素(bryostatin)-1(Drexler等，Blood，1989；741747-1757)。淋巴瘤细胞表面分子的生理性配体通过由细胞表面分子的诱导信号转导还可以作为PKC激动剂，并导致蛋白质的PKC族成员的活化。例如，抗淋巴瘤细胞表面某些分子的抗体还可以作为PKC激动剂。该抗体包括，例如抗MHC I级分子的抗体和表面Ig抗体。
在一些具体实例中，PKC激动剂可以在体外与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，例如在细胞培养中。在另外的具体实例中，PKC激动剂可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，即CD5+B细胞淋巴瘤细胞和PKC激动剂在器官、组织或血液里接触。在此情况下，例如给患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给服PKC激动剂，可使PKC激动剂与患者的CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触。PKC激动剂可以经由任何合适的方法给药，包括例如，非肠道给药、皮下给药、鼻内给药和口服。下面详细描述了PKC激动剂给药的合适的制剂。
用于任何一个具体实例的PKC激动剂的精确量可以根据该领域已知的因素来改变，包括但不限于，PKC激动剂的物理和化学性质、与PKC激动剂组合提供的IRM或IRMs的物理和化学性质、预期的剂量服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、PKC激动剂的给药方法、是否有任何其它免疫调节药剂正在结合PKC激动剂给药、以及所给药的制剂种类。因此，指定PKC激动剂所有可能的有效量通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适用量。
在某些具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤的细胞可以与(a)一种或多种IRMs接触，以有效提高至少一个共同刺激分子的表达，(b)IL-2和(c)PKC激动剂接触。当CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与IRM、IL-2和PKC激动剂的组合接触时，可以以包含该成分的单个制剂提供该组合的每个成分。可选则地，由两种或多种制剂提供该组合，其每个可以单独包含(或连同其它一个或其它两个)该组合的成分。如果用多种制剂提供该组合，该多种制剂可以为相似的或不同的组合物。此外，每个制剂可以为相似或不同的形式(例如气雾剂、凝胶剂、霜剂、溶液等)并可以经由相似或不同的给药途径(例如注射、皮下、静脉内)。同时，如果用多种制剂提供该组合的成分，CD5+B细胞淋巴瘤的细胞可以以任何次序接触该多种成分。
在一些具体实例中，提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面的至少一种共刺激分子的表达的结果可以包括提高增殖(即膨胀)CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异性(下文“淋巴瘤细胞特异性”)细胞毒性T细胞(CTLs)。用已经提高共刺激分子的表面表达的CD5+B细胞淋巴瘤细胞接触淋巴瘤细胞特异性CD8+T细胞得到淋巴瘤细胞特异性CTLs的增殖。可以通过任何适合的方法(包括例如一种或多种以上描述的方法)提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面的共刺激分子的表达。
在一些具体实例中，CD8+T细胞是CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异性的，即，CD5+B细胞淋巴瘤细胞对CD8+T细胞或CD8+T细胞后代特异性抗原已经预先存在。在其他具体实例中，CD8+T细胞是幼稚的，即，对CD8+T细胞或CD8+T细胞后代没有预先的抗原(CD5+B细胞淋巴瘤特异性或相反的)。
与用CD5+B细胞淋巴瘤细胞(其不显示提高一种或多种共刺激分子的表达)接触的活化淋巴瘤细胞特异性CTLs相比，用CD5+B细胞淋巴瘤细胞(已经提高至少一种共刺激分子的表达)接触的活化淋巴瘤细胞特异性CTLs可以显示例如更大的增殖。
另一方面，本发明还提供疫苗、制备疫苗的方法和通过疫苗给药对患者进行治疗的方法。该疫苗包括分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞或其免疫活性部分，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经与可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子的表达的IRM接触。分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞也可以和IL-2、PKC激动剂或IL-2与PKC激动剂的组合接触。CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分可以包括但不局限于，来自分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的蛋白质标本和/或细胞膜制剂。因此，例如膜制剂可以包括来自CD5+B细胞淋巴瘤细胞和例如蛋白质嵌入其中的细胞膜部分。可以根据制备基于细胞免疫的多种方法来制备疫苗。例如，可以使用类似于用于制备基于细胞疫苗抗黑素瘤(参考例如Wu等，J Interferon Cytokine Res.2001 Dec；21(12)1117-27)、肾癌细胞(参考例如Vieweg等，Urol.Clin.North Am.2003 Aug；30(3)633-43)或脑肿瘤(参考例如Fecci等，J.Neurooncol.2003 Aug-Sep；64(1-2)161-76)的方法。
IRMs包括具有有效的免疫调制活性(包括但不限于抗病毒和抗癌活性)的化合物。某些IRMs调节细胞因子的产生和分泌。例如某些IRM化合物诱导细胞因子的产生和分泌，例如，I类干扰素、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、MIP-1和/或MCP-1。作为另一个实例，某些IRM化合物可以抑制某些TH2细胞因子的产生和分泌，例如IL-4、IL-5。此外，据报道一些IRM化合物抑制IL-1和TNF(美国专利US6,518,265)。
某些IRMs为小的有机分子(相对于大的生物分子例如蛋白质、肽等的例如分子量小于约1000道尔顿，优选小于约500道尔顿)例如公布于美国专利US 4,689,338；4,929,624；4,988,815；5,037,986；5,175,296；5,238,944；5,266,575；5,268,376；5,346,905；5,352,784；5,367,076；5,389,640；5,395,937；5,446,153；5,482,936；5,693,811；5,741,908；5,756,747；5,939,090；6,039,969；6,083,505；6,110,929；6,194,425；6,245,776；6,331,539；6,376,669；6,451,810；6,525,064；6,541,485；6,545,016；6,545,017；6,558,951；6,573,273；6,656,938；6,660,735；6,660,747；6,664,260；6,664,264；6,664,265；6,667,312；6,670,372；6,677,347；6,677,348；6,677,349；6,683,088；6,756,382；欧洲专利EP 0 394 026；美国专利申请公开文本US 2002/0016332；2002/0055517；2002/0110840；2003/0133913；2003/0199538和2004/0014779；和国际专利公开文本WO 01/74343；WO 02/46749；WO02/102377；WO 03/020889；WO 03/043572；WO 03/045391；WO03/103584和WO 04/058759。
小分子IRMs的其他的实例包括某些嘌呤衍生物(例如美国专利6,376,501和6,028,076中描述的)、某些咪唑并喹啉酰胺衍生物(例如美国专利6,069,149中描述的)、某些咪唑并并吡啶衍生物(例如美国专利6,518,265中描述的)、某些苯并咪唑并衍生物(例如美国专利6,387,938中描述的)、某些4-胺基嘧啶稠合五元含氮杂环的衍生物(例如在美国专利6,376,501；6,028,076和6,329,381和国际专利公开文本WO 02/08905中描述的腺嘌呤衍生物)和某些3-β-D-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶衍生物(例如美国公开2003/0199461中描述的)。
其它IRMs包括大的生物分子，例如低聚核苷酸序列。例如在美国专利6,194,388；6,207,646；6,239,116；6,339,068和6,406,705中描述的一些IRM低聚核苷酸序列包括胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。例如美国专利6,426,334和6,476,000中描述的一些含低聚核苷酸的CpG可以包括合成的免疫调节剂构造图式。例如国际专利公开文本WO00/75304中描述的其它缺乏CpG的IRM核苷酸序列序列。
例如美国专利6,113,918；6,303,347；6,525,028和6,649,172中描述的其它IRMs包括生物分子，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸(AGPs)。
可以用任何合适的IRM化合物实施本发明。除非另有说明，所涉及的化合物可以包括该化合物任何药物可接受的形式，包括任何异构体(例如非对映体或对映体)、盐、溶剂化物、多晶型物等。特别是，如果化合物是旋光性的，该化合物所涉及的可以包括每个该化合物的对映体以及该对映体的外消旋混合物。
在一些具体实例中，适合的IRM化合物可以是，例如上述之一的小分子IRM化合物。适合的小分子IRM化合物包括含有2-胺基吡啶稠合到五元含氮杂环的化合物，例如咪唑并喹啉胺包括但不限于酰胺取代的咪唑并喹啉胺、磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺、脲取代的咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、杂环基醚取代的咪唑并喹啉胺、酰胺基醚取代的咪唑并喹啉胺、砜酰胺基醚取代的咪唑并喹啉胺、脲取代咪唑并喹啉醚、硫醚取代咪唑并喹啉胺和6-、7-、8-、或9-芳基或杂芳基取代的咪唑并喹啉胺；四氢咪唑并喹啉胺包括但不限于酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、脲取代的四氢咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、杂环基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、胺基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、氨磺酰基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、脲取代的四氢咪唑并喹啉醚和硫醚的取代四氢咪唑并喹啉胺；咪唑并并吡啶胺包括但不限于酰胺取代的咪唑并并吡啶胺、氨磺酰基取代的咪唑并并吡啶胺、脲取代的咪唑并并吡啶胺、芳基醚取代的咪唑并并吡啶胺、杂环基醚取代的咪唑并并吡啶胺、酰胺基醚取代的咪唑并并吡啶胺、氨磺酰基醚取代的咪唑并并吡啶胺、脲取代的咪唑并并吡啶醚和硫醚取代的咪唑并并吡啶胺；1，2-桥接咪唑并喹啉胺；6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶吡啶胺；四氢咪唑并萘啶吡啶胺；噁唑喹啉胺；噻唑喹啉胺；噁唑吡啶胺；噻唑吡啶胺；噁唑萘啶吡啶胺；噻唑萘啶吡啶胺；和1H-咪唑并并二聚体稠合吡啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺或四氢萘啶胺。
在某些具体实例中，IRM化合物可以是四氢咪唑并喹啉胺，例如4-胺基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇。在另外的具体实例中，IRM化合物可以是咪唑并喹啉胺。在某些特定具体实例中，IRM可以是1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺基。在另外的具体实例中，IRM化合物可以是氨磺酰取代的咪唑并喹啉胺，例如N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲烷磺酰胺。如果需要可以使用多种IRMs的组合。
IRM化合物或组合(例如IRM与IL-2和/或PKC激动剂)的每个成分可以以任何适合的制剂对患者给药。适合的制剂种类描述在，例如美国专利US 5,736,553；美国专利5,238,944；美国专利5,939,090；美国专利6,365,166；美国专利6,245,776；美国专利6,486,186；欧洲专利EP号EP 0394026和美国专利申请公开文本2003/0199538。该化合物(IRM化合物、IL-2或PKC激动剂)可以是任何适合的形态包括但不限于溶液、悬浮液、乳剂或任何混合物形态。该化合物可以与任何药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物为制剂给药。例如该化合物可以是适用于局部给药的制剂。某些局部给药的IRM化合物制剂的合适的种类表述，例如在国际专利公开文本WO 03/045391。该制剂可以以任何常规的剂型(包括但不限于霜剂、膏剂、气雾剂、非气溶胶喷射、凝胶、洗液、片剂、锭剂、酏剂等)给药。该制剂还可以包括一种或多种添加剂，包括但不限于辅助剂、皮肤渗透增强剂、着色剂、香料、湿润剂、增稠剂等。
用于实施本发明的制剂组合物可以根据该领域已知的因素来改变，包括但不限于IRM化合物的物理和化学性质、载体性质、预期的剂量服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、IRM化合物的给药方法、是否有一种或多种其它药剂正在结合IRM化合物给药、和给药的物种。因此，对所有可能的应用和本发明所有可能具体实例指定组合物的有效制剂通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适制剂。
在一些具体实例中，本发明的方法包括以IRM化合物制剂对患者给药，例如约0.0001％～约10％(除非另有说明，所有在此提到的百分数是重量/总制剂的重量)对患者给药，尽管在一些具体实例中，可以使用IRM化合物制剂(提供该范围以外浓度的IRM化合物)对患者给药。在某些具体实例中，该方法包括以约0.01％～约5％IRM的化合物制剂对患者给药，例如，一种包括约5％IRM化合物的制剂。
用于实施本发明的IRM化合物的有效量可根据该领域已知的因素来改变，包括但不限于IRM化合物的物理和化学性质、载体性质、预期的剂量服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、IRM化合物的给药方法、是否有一种或多种其它药剂正在结合IRM化合物给药、和正在给药的制剂种类。因此，对所有可能的应用和本发明所有可能具体实例制定IRM化合物的有效量通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适用量。
在一些具体实例中，本发明的方法包括以足够的IRM化合物剂量对患者给药，例如约100ng/kg～约50mg/kg对患者给药，尽管在一些具体实例中，该方法可以使用该范围以外剂量的IRM化合物对患者给药。在一些该具体实例中，该方法包括以约10μg/kg～约5mg/kg足够剂量的IRM化合物对患者给药，例如约100μg/kg～约1mg/kg的剂量。
该剂量服法至少可能依赖该领域已知的许多部分因素，包括但不限于IRM化合物的物理和化学性质、载体性质、IRM的给药量、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、IRM化合物的给药方法、是否有一种或多种其它药剂结合IRM化合物给药、和给药的物种。因此，对所有可能的应用和本发明所有可能具体实例制定有效的剂量服法通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适的剂量服法。
在本发明的一些具体实例中，IRM化合物可以例如每天从单一剂量到多剂量给药。在某些具体实例中，IRM化合物可以从大约每周三次到大约每天一次给药。在特殊实例中，IRM化合物每天一次给药。
实施例下列选取的实施例仅进一步说明本发明的特征、优点和其它细节。然而，当实施例是该目的时很清楚的知道其特殊材料和用量以及其它条件和细节不能理解为非正常限制本发明范围的理由。
用于实施例的化合物列在表格1中。
表1
材料和方法血液标本收集同意的CLL患者的肝素化血液(30-40mL)(通过CD19+CD5+IgMIO囊依赖性淋巴细胞继续升高来诊断(Rozman和Montserrat，New Engl.J Med.1995；3331052-1057))。在分析时所有的患者之前不曾治疗。方案由有关制度审查委员会(Institutional ReviwBoard)批准。
表2
抗体藻红蛋白或FITC标记的CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD54(ICAM-1)、CD83、4-1BB配体(4-1BBL)、CD5和CD19抗体，其可以从BD Pharmingen购买(San Francisco，CA)。藻红蛋白标记的ICOS-L和PDL-1(B7-H1)抗体，其可以从eBioscience(San Diego，CA)购得。
材料的制备和方法在DMSO中制备PDB(5mg/mL)储液。在DMSO中制备SB203580(25mg/mL)储液，选择性的应力-活化蛋白激酶抑制剂(SAPK)(p38)(Lee等，Pharmacol Ther.1999；82389-397)。由3M药剂(St.Paul，MN)提供IRM1和负对照(Neg.)化合物。该化合物溶入1.3mg/mL的AIM-V培养基(GibcoBRL，GrandIsaland，NY)(用33％DMSO)并于4℃存储。同样由3M药剂提供5％的IRM2乳膏(在市场上购买ALDARA)。
细胞纯化如Gitelson等(Gitelson等Clin.CancerRes.2003；991656-1665)所述，通过负选择(RosetteSep，StemCell Technologies，Vancouver，BC)从新鲜血液中分离CLL和T细胞。
CLL细胞的活化纯化的CLL细胞(1.5×106细胞/mL)在6或24孔平皿(Becton-Dickinson Labware，Franklin Lake，NJ)中在无血清AIM-V培养基加2-巯基乙醇(2-ME，5×10-5M)(Sigma Chemical Co.)里在37℃5％CO2中培养3-4天。通过加入负对照化合物(1μg/mL)、IRM1(1μg/mL)、IL-2(5000U/mL)、PDB(100ng/mL)或bryostatin(20nmol)酌情活化CLL细胞。该负对照组化合物对CLL细胞不具备可测量的影响，因此单独使用AIM-V培养基作为大多数实验的对照组。
混合淋巴细胞应答(MLRs)从CLL患者分离出T细胞并在AIM-V培养基中调整至5×105细胞/mL。活化的CLL细胞洗涤至少4次以除去剩余的免疫调节剂，照射(2500cGy)并以5×105细胞/mL(或更低浓度)悬浮于AIM-V培养基中。应答剂和刺激物以1∶1(体积比)混合且无需另外的细胞因子或血清在96孔圆底平皿(Becton DickinsonLabware，Franklin Lake，NJ)中培养。4～6天后用比色定量(Gitelson等，Clin CancerRes.2003；991656-1665；和Ahmed等，J.Immunol.Methods.1994；170211-224)测量增殖。
流式细胞计数法按照如Gitelson(Gitelson等，Clin.Cancer Res.2003；991656-1665)等所述的方法进行细胞的染色。
细胞因子测量通过多重分析荧光珠测定系统(可从Luminex公司、Atin、TX以商品名LUMINEX-100系统购得)得出在上层清液(来自48小时后活化的CLL细胞)中培养的细胞因子水平。根据制造商的指导(R & D系统，Minneapolis，MN)使用测量IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的5-plex人类细胞因子的工具。利用软件(购自BioRad、Mississauga、Ontario以商品名BIO-PLEX 2.0)从标准曲线得到各种细胞因子浓度。
统计分析Student t检验用于测定样本平均值之间差额的p值。通过最小二乘回归法得到最佳拟合曲线。
实施例1IRM1对于由CLL细胞表达的共刺激分子上的效果。
将来自标值患者的CLL细胞在IRM1(1μg/mL)中培养3～4天，然后用于测定在图1的x轴上所标记的共刺激分子的表达的测试(强度大于第一个对数荧光的十倍)。通过流式细胞计数器测定表达各个共刺激分子的细胞百分比与表达的平均荧光强度(MFI)。然后由该这些测定的比率到百分比以及未使用活化剂培养的对照细胞培养计算得出“成倍提高”。共刺激分子表达的相对提高的平均值和标准误差如图1A所示。
在IRM1提高CD54、CD80和CD86在CLL细胞(来自所有研究患者n＝31)的表达中，IRM1对于CD80、CD86和CD54表达具有特别强的影响。对于CD80的影响大于CD86(比较图1和2)。IRM1还提高CD83、4-1BBL和PDL-1的表达，但对于ICOS-L的表达几乎没有影响(图1A)。
来自标值患者的CLL细胞在IRM1、LPS(100μg/mL)、聚(I:C)(100μg/mL)和IFN-γ2B(500U/mL)中培养48小时。如图1A所述计算得出CD80和CD86表达的相对提高，并在图1B中显示。
通过其它TLR激动剂以同样的方式，对CLL细胞没有影响。TLR2和TLR4由细菌LPSs活化，而TLR3通过病毒双链RNA和聚(I:C)活化(Gordon，Cell.2002；111927-930)。然而LPS或聚(I:C)很少影响由CLL细胞表达的共刺激分子(图1B)。虽然IRM1是IRMs类之一(已知其促进DCs或单核细胞分泌IFN-α(Gibson等，CellImmunol.2002；21874-86))，但是既然用IFN-γ2B直接刺激后，由CLL细胞表达的共刺激分子没有重要的变化，IRM1的效果不可能由该细胞因子间接地介导(图1B)。
实施例2IL-2和IRM1在由CLL细胞表达的共刺激分子上的效果。
分离CLL细胞并单独或与IL-2(5000U/mL)、IRM1(1μg/mL)或IL-2与IRM1共同的培养3～4天。然后通过流式细胞计数器测定CD80、CD86、CD54和CD83的表达。图2A显示了一个特征实例。在上下行的点图中的数字是分别是CD80+和CD86+CLL细胞的百分比。图2B是表达图中所示数量患者的不同的共刺激分子(通过使用染色强度高于上述第一个十个对数荧光的细胞的百分数测定的)的CLL细胞百分比的图解表示。图中显示了每次测量的平均和标准误差。双箭头的数字表示样本平均值之间差额的p值。图2C是表达图中所示数量患者的不同的共刺激分子(用于CLL细胞测定)的平均荧光指数(MFI)的图解表示。图中显示了每次测量的平均和标准误差。因为基本上所有的CLL细胞表达该分子，(所以)仅仅显示了CD54表达(除以10)的MFI。双箭头的数字表示样本平均值之间差额的p值。
IL-2和IRM1都能够提高CLL细胞(其表达CD80和CD86)的百分比，同时能够提高这些分子表达的平均荧光强度(MFI)(图2)。作为单一药剂，IRM1似乎比IL-2在这方面更有效。IL-2和IRM1在添加剂表达的共刺激分子上的效果(图2A、右边点图和图2B、C)，这表明其通过不同的机制介导。图2C中显示的共刺激分子CD80、CD86、CD54和CD83的MFI表明IRM1提高所有这四种共刺激分子在CLL细胞的表达。IRM1结合IL-2尤其提高了CD80表达的数量。
IL-2和IRM1稍微提高了4-1BBL和PDL-1的表达，但不如CD80、CD86和CD54多(图1A)。ICOS-L基于许多CLL细胞但其表达似乎相对独立于IL-2和介导的IRM1信号。
实施例3PKC在对IL-2和IRM1活化的CLL细胞的共同刺激显型上和T细胞刺激能力的活化效果。
从个体患者提纯的CLL细胞并单独或与IL-2、IRM1、IL-2和IRM1、PDB、PDB和IL-2、PDB和IRM1、或者PDB和IL-2和IRM1培养。3～4天后获得这些细胞，完全洗涤，照射(2500cGy)并用于刺激CLL患者5～6天培养后的异源的或自体同源的T细胞(在CLL细胞的同时获得并放置培养直到加入到混合淋巴细胞应答(MLR)试验)，加入Alamar Blue并在波长540(对比态)和595(氧化态)的光密度比色微板读数器中测量增殖。该读数之间的差异用于测量培养的活细胞数量。结果如图3A所示。从各个个体试验显示出最大刺激(在减去未活化的CLL细胞刺激物引起的增殖之后)的T细胞所得到的结果被用来产生平均增殖且来自患者数量的标准误差显示在X轴上。
图3B是CD83表达与T细胞刺激素效率相关的图解表示。CLL细胞用IL-2和IRM1处理4～5天。然后通过流式细胞计数器测定表达CD83的细胞百分比和CD83表达的MFI。然后照射该活化的CLL细胞并在MLRs中用于刺激自体同源的或异源的T细胞。来自19个不同患者的CD83+CLL细胞的初始百分比(左边图形)和CD83表达的MFI(右边图形)在MLRs中与标准的增殖关联起来。最佳直线截距为10.692且斜率为0.0598；其关联的p值为0.0153。
图4A显示来自典型患者的CLL细胞单独(左边图形)或与IRM1、IL-2和PDB(右边图形)培养3天。然后通过流式细胞计数器测定CD80、CD83、CD54和CD86表达。在点图中的百分比涉及CD80(上象限的左右之和)(上方图片)和CD86(上下象限的右部之和)(下方图片)。图4B是表达CD80、CD83、CD54和CD86(和MFI的表达)的CLL细胞(来自图例中标值患者，单独或与PDB、PDB和IL-2、PDB和IRM1、或者PDB和IL-2和IRM1培养后)的流动血细胞计数器的测定结果的摘要。并显示其平均和标准误差。因为基本上所有的CLL细胞表达该分子，所以仅仅显示了CD54表达的MFI。图4C是ICOS-L、4-1BBL和PDL-1表达的类似流动血细胞计数器的测定的摘要。双箭头的数字表示样本平均值之间差额的p值。
单独用佛波醇二磷酸钠(PDB)治疗，导致90％的CLL细胞表达CD83(图4B，无色条)。PDB还提高CD80+和CD86+CLL细胞的数量(后者超过前者)，而且还提高4-1BBL和PDL-1的表达(图4C，无色条)。通过PDB没有对CD54和ICOS-L的表达产生明显的影响(图4B和图4C)。
用PDB活化CLL细胞期间加入IL-2主要提高CD80+细胞数量和CD80的MFI和CD54表达(图4B；水平条)。当用PDB和IRM1一起活化CLL细胞时得到CD80+细胞稍微提高的百分比(图4B；竖条)。向IRM1和PDB加入IL-2显著提高CD80(尤其与CD86相比(图4B))和CD54的表达，并引起基本上全部的CLL细胞带来一种CD83hiCD80hiCD86hiCD54hi细胞表面显型(图4A和图4B，斜纹条)。
图4中的结果指出PDB和IRM1的组合引起CLL细胞对CD80、CD86和CD83几乎100％的表达。加入IL-2主要影响CD80和CD54表达的数量。PDB(有或没有IL-2)和/或IRM1提高4-1BBL和PDL-1的表达，但与CD80、CD86、CD54和CD83的程度不同。
通过CLL细胞活化(用PDB、IL-2和IRM1)的共刺激分子的强烈表达反应了这些细胞对刺激T细胞增殖的效率(图3A)。用PDB(没有IL-2)刺激的CLL细胞是T细胞增殖的弱刺激物(图3A)。
实施例4在IRM1的存在下通过自体同源的T细胞消除CLL细胞。
从CLL患者离析出CLL细胞和T细胞，悬浮于106细胞/mL的浓度并以1∶1比率混合。该细胞混合物单独或在IL-2、IL-2和IRM1、bryostatin、bryostatin和IL-2、bryostatin和IRM1、或者bryostatin和IL-2和IRM1的存在下培养。在图5A中，5天后，通过流式细胞计数器测定CD5+CD19+肿瘤细胞(显示在点图中的右边上象限的数字)和CD5+CD19-T细胞的百分比。在图5B中，这些百分比和活细胞总数(在血球计中通过手工计数测定)用于计算培养的CLL细胞剩余的绝对数。
IRM1(单独，或与IL-2和/或bryostatin结合)引起自体同源的T细胞在体外杀灭CLL细胞。IRM1、IL-2和bryostatin的组合使得自体同源的T细胞能够在5天内100％清除CLL细胞。
实施例5对慢性淋巴细胞性白血病有关的淋巴瘤皮肤沉淀以IRM化合物给药的临床效果一个71岁的白人男性，通过流式细胞计数器测定其循环单克隆CD19+CD5+IgMIO淋巴细胞的量持续升高，据此诊断为Rai阶段0CLL。通过45％循环CLL细胞表达CD38。在一开始和用IRM2治疗结束后的白血球量分别是36×106细胞/mL和45×106细胞/mL。没有预先使用其它全身性的化学疗法、类固醇或辐射。
此外，患者报告其手和手臂上大约8年有反复发生的结节状的红斑损伤。通常用液氮治疗消除该损伤。但是他被诊断为CLL，其上背和手臂上有几个这样的损伤(图8A)。检测到一个损伤并发现其包含扩散非典型的含许多小而圆的淋巴细胞的淋巴表皮渗透，且没有嗜表皮性。在石蜡免疫过氧化物酶染色上，淋巴滤液具有主要的CD20+显型。在嵌入组织的石蜡的分子类型分析证明了单克隆的B细胞群与B细胞淋巴瘤一致。
在受影响区域使用IRM2的5％霜剂每周三次。八周后，治疗损伤的尺寸没有明显的变化，但形成了色素沉着不足的面积，这使人想起一个晕轮痣环绕着退还的黑素瘤沉淀。
使用IRM2的5％霜剂提高到每天一次。六周的治疗后该损伤消失(图6B)且停止治疗3个月后没有复发。该治疗过程既没有未治疗的淋巴瘤损伤，也没有循环白血球量的明显变化。
在Gitelson等Clin.Can.Res.，91656-1665(2003)中描述了通过负选择(RosetteSep，StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC)从新鲜血液中分离CLL细胞。纯化的CLL细胞(1.5×106细胞/mL)在自由血清AIM-V培养基(GibcoBRL)中培养3天。在最终浓度为1μg/mL时使用IRM1和负对照化合物。
细胞用之前用优化量的CD80-PE和CD83-FITC或CD54-PE和CD86-FITC抗体培养20分钟，洗涤，然后用流式细胞计数器分析。负对照与不相干的抗体同型匹配。通过开启前向和侧面的散射特性来对有核细胞染色。用FAC扫描流动血细胞计数器使用CELLQUEST软件(BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA)分析一万个活菌计数。该流动血细胞计数器用spheroparticles使之标准化(Spherotech，Inc.，Chicago，IL)。通过比较同型标记对照细胞计算得出CD80+、CD86+和CD83+细胞的百分比。结果如图7所示。
实施例6对CLL细胞标记的共同刺激标记物有影响的IRM3的剂量反应。
来自8位不同患者的CLL细胞纯化并与0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL或1.0μg/mL的IRM3培养3天。通过如上所述的流式细胞计数器测定CD80和CD83的表达。通过从没有加入IRM3的对照CLL培养中分别减去CD80和CD83的表达，得到CD80和CD83表达的提高。结果如图8所示。
实施例7介导的IRM3在CLL细胞表面分子的改变。
从患者收集的CLL细胞用IRM3(1μg/mL)培养2～3天且没有(对照)。通过流式细胞计数器测定表达CD80、CD83、CD86和CD38的细胞的百分比。由于几乎所有CLL细胞表达这些分子，测定CD54和CD25的表达的MFI。表达特殊细胞表面分子的细胞百分比的表达MFI的改变是通过用IRM3的细胞培养中得到的值减去对照组培养中得到的值而得到。结果如图9所示。
实施例8IRM3介导的CLL细胞表达的CD20的提高纯化CLL细胞或者没有(对照)或者与IRM3(1μg/mL)和IL-2(5000U/mL)一起培养。48小时后，通过流式细胞计数器测定CD20表达的MFI。结果如图10所示。
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权利要求
1.一种提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞的至少一种细胞表面分子表达的方法，该方法包括用至少一种能够有效提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞的至少一种细胞表面分子表达的IRM化合物接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中CD5+B细胞淋巴瘤细胞选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)细胞、套细胞淋巴瘤细胞、具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤或其组合。
3.根据权利要求1的方法，其中IRM是TLR7激动剂。
4.根据权利要求1的方法，其中IRM是TLR8激动剂。
5.根据权利要求1的方法，其中IRM是四氢咪唑并喹啉胺。
6.根据权利要求1的方法，其中IRM是磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺。
7.根据权利要求1的方法，其中细胞表面分子是一种共刺激分子。
8.根据权利要求7的方法，其中至少一种共刺激分子是CD25、CD38、CD40、CD54、CD80、CD83或CD86。
9.根据权利要求1的方法，其中细胞表面分子是CD20、CD22或CD23。
10.根据权利要求1的方法，其中使用IRM和CD5+B细胞淋巴瘤细胞在体内发生接触。
11.根据权利要求1的方法，其中IRM和CD5+B细胞淋巴瘤细胞的接触发生在器官、组织或血液内。
12.根据权利要求1的方法，其中IRM与CD5+B细胞淋巴瘤细胞的接触发生在患者体内。
13.一种刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以产生细胞因子的方法，该方法包括使IRM接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞，其中该IRM能够有效产生至少一种高于未接触IRM的CD5+B细胞淋巴瘤细胞所产生水平的细胞因子，。其中至少一种细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、GM-CSF或其组合。
14.根据权利要求13的方法，其中在体外接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
15.根据权利要求13的方法，其中在器官、组织或血液内接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
16.根据权利要求13的方法，其中在患者体内接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
17.一种提高T细胞增殖的方法，该方法包使能够有效提高在CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面上的至少一种共刺激分子表达的IRM接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞，使T细胞接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞，从而活化T细胞；其中与接触没有接触过IRM的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的T细胞相比，活化的T细胞显示出增加了的增殖。
18.根据权利要求17的方法，进一步包括用至少一种其他的免疫调节剂接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
19.根据权利要求18的方法，其中该其他的免疫调节剂包括IL-2。
20.根据权利要求18的方法，其中该其他的免疫调节剂包括一种蛋白激酶C激动剂。
21.根据权利要求18的方法，其中T细胞与CD5+B细胞淋巴瘤细胞在体内接触。
22.一种通过CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异性细胞毒性T细胞增强杀灭CD5+B细胞淋巴瘤细胞的方法，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与能够有效提高在CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面上至少一种共刺激分子表达的IRM接触；将CD8+T细胞与CD5+B淋巴瘤的细胞接触，从而活化CD8+T细胞；其中该活化的CD8+T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异性细胞毒性T细胞，且与和未经IRM接触的CD5+B细胞淋巴瘤细胞接触的CD8+T细胞相比，显示出提高了的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的杀灭。
23.根据权利要求22的方法，进一步包括用至少一种其他的免疫调节剂接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
24.根据权利要求23的方法，其中该其他的免疫调节剂包括IL-2。
25.根据权利要求23的方法，其中该其他的免疫调节剂包括一种蛋白激酶C激动剂。
26.根据权利要求22的方法，其中IRM与CD5+B细胞淋巴瘤细胞在体内接触。
27.一种在患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者内通过自体同源的T细胞提高杀灭CD5+B细胞淋巴瘤细胞的方法，该方法包括给患者给服为TLR7和/或TLR8的激动剂的IRM。
28.根据权利要求27的方法，进一步包括给服IL-2。
29.根据权利要求27的方法，进一步包括给服蛋白激酶C激动剂。
30.根据权利要求27的方法，进一步包括给服IL-2及蛋白激酶C激动剂。
31.一种治疗患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者的方法，该方法包括对患者给服有效提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞的至少一种细胞表面分子的表达的IRM，给服IRM的量有效提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞的至少一种细胞表面分子的表达。
32.根据权利要求31的方法，其中IRM是一种TLR7和/或TLR8的激动剂。
33.根据权利要求31的方法，进一步包括给服IL-2。
34.根据权利要求31的方法，进一步包括给服种蛋白激酶C激动剂。
35.根据权利要求31的方法，进一步包括给服IL-2及蛋白激酶C激动剂。
36.根据权利要求31的方法，其中至少一种表达提高的细胞表面分子是治疗剂的靶点，且该方法进一步包括给患者给服治疗有效量的该治疗剂。
37.根据权利要求26的方法，其中细胞表面分子是CD20、CD22或CD23。
38.根据权利要求31的方法，其中细胞表面分子是一种共刺激分子。
39.一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括给需要这种治疗的患者给服能够以有效改善CD5+B细胞淋巴瘤特征的至少一种症状或临床征象的IRM。
40.根据权利要求39的方法，其中给服能够有效显示出减少至少50％末梢血淋巴细胞、淋巴结病或脾肿大至少两个月的量的IRM。
41.根据权利要求39的方法，其中给服能够有效防止进行性疾病的发展的量的IRM，其中该进行性疾病为淋巴细胞循环提高至少50％或发展到更严重的阶段。
42.根据权利要求39的方法，其中给服能够有效缓解结节状红斑损伤的量的IRM。
43.一种包括分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞或其免疫活性部分的疫苗，其中分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经与能够有效提高在CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面上的至少一种共刺激分子表达的IRM接触。
44.一种根据权利要求43的疫苗，其中IRM是TLR7和/或TLR8的激动剂。
45.一种根据权利要求43的疫苗，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经进一步与IL-2接触。
46.一种根据权利要求43的疫苗，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经进一步与蛋白激酶C激动剂接触。
47.一种根据权利要求43的疫苗，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经进一步与IL-2及蛋白激酶C激动剂接触。
48.一种疫苗的制备方法，其中该疫苗包括分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞，所述分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞用能够有效提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面的至少一种分子表达的IRM接触。
49.根据权利要求48的方法，进一步包括用IL-2接触所述的分离的细胞。
50.根据权利要求48的方法，进一步包括用一种蛋白激酶C激动剂接触所述的分离的细胞。
51.根据权利要求48的方法，进一步包括用IL-2及蛋白激酶C激动剂接触所述的分离的细胞。
52.一种治疗患有CD5+B淋巴瘤的患者的方法，该方法包括以分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分对患者给药，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经与IRM接触以有效提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面的至少一种共刺激分子的表达。
53.根据权利要求52的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞还已经与IL-2接触。
54.根据权利要求52的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞还已经与一种蛋白激酶C激动剂接触。
55.根据权利要求52的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞还已经与IL-2和蛋白激酶C激动剂接触。
56.根据权利要求52的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞来自于患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者。
57.根据权利要求52的方法，其中分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分包括整个细胞。
58.根据权利要求52的方法，其中分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分包括来自于分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的细胞膜制剂或蛋白质制剂。
59.根据权利要求52的方法，其中表达提高的至少一种细胞表面分子是治疗剂的靶点，且该方法进一步包括给患者给服治疗有效量的该治疗剂。
60.一种在被诊断为CD5+B细胞淋巴瘤的患者体内，引发CD5+B细胞活性淋巴瘤T细胞应答的方法，该方法包括给患者给服包含分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分的组合物，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经与能够有效提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面的至少一种共刺激分子表达的IRM接触。
61.根据权利要求60的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞还已经与IL-2接触。
62.根据权利要求60的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞还已经与一种蛋白激酶C激动剂接触。
63.根据权利要求60的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞还已经与IL-2及蛋白激酶C激动剂接触。
64.根据权利要求60的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞来自于患有CD5+B淋巴瘤的患者。
65.根据权利要求60的方法，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞来自于患有CLL或SLL的患者。
66.根据权利要求60的方法，其中CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分包括整个细胞。
67.根据权利要求60的方法，其中分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分包括来自于分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的细胞膜制剂或蛋白质制剂。
全文摘要
本发明提供了一种通过将细胞与免疫应答调节剂接触来提高CD文档编号A61K38/20GK1863531SQ200480029093
公开日2006年11月15日 申请日期2004年9月3日 优先权日2003年9月5日
发明者大卫·E·斯潘内, 理查德·L·米勒 申请人:3M创新有限公司