专利名称：用于b细胞淋巴瘤的联合疗法的制作方法
用于B细胞淋巴瘤的联合疗法背景大多数人白血病和淋巴瘤，包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)，起源于B细胞。近年来，基于通过使用单克隆抗体(mAb)靶向B细胞限制性表面抗原的B细胞耗尽的治疗方法已经获得了越来越多的关注。具体而言，抗CD20 mAb利妥昔单抗已经在B细胞恶性肿瘤的治疗中显示出有希望的结果。(罗巴克(Robak)等人，癌症治疗评论(Cancer Treatment Reviews), 2007 ；33:710-728.)利妥昔单抗的活性大部分取决于该mAb通过参与活化效应细胞(如巨噬细胞和NK细胞)表面上的Fe Y受体而介导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)的能力。(戴斯杰拉斯(Desjarlais)等人，今日药物发现(Drug Discovery Today), 2007 ；12:898-910.)虽然其他机制，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和细胞凋亡的直接诱导也可以产生作用，但ADCC似乎是利妥昔单抗借以在体内介导恶性的以及正常的B细胞的消除的主导机制。(爱德华兹(Edwards)等人，免疫学自然评论(Nat Rev Immunol), 2006 ；6:394-403.)利妥昔单抗与化学疗法的组合已经在患有滤泡淋巴瘤(FL)和CLL的患者中引起显著的改进，并且可以导致持久的缓解。然而，此疗法不是对所有的患者群体都有效。因此，仍然急需新颖且改进的治疗选项。人分化(⑶)群抗原19是由早期前B细胞从重链重排时所表达的一种B细胞特异性表面抗原。CD19属于跨膜受体的含免疫球蛋白结构域的超家族。当CD19表达被下调时，⑶19在B细胞上从祖B细胞至浆细胞阶段的其整个谱系中受到表达。(纳德勒(Nadler)等人，免疫学杂志(J Immunol.) 1983 ; 131:244-250.)作为一种B细胞特异性蛋白、和B细胞-受体(BCR)复合物的组分，CD19是调控B细胞活化和体液免疫的阈值的B细胞信号传导的一种正调控因子。(佐藤(Sato)等人，国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci), 1995 ；92 =11558-62 ;佐藤等人，免疫学杂志1997 ；158:4662-9.) CD19不在造血干细胞上或在祖B细胞阶段之前的B细胞上表达。(纳德勒(Nadler)等人，免疫学杂志(J Immunol.) 1983 ；131:244-250 ;洛肯(Lok en)等人，血液(Blood)，1987 ；70:1316-1324.)。重要的是，⑶19的表达在B细胞的恶性转化之后得以维持，并且⑶19在大多数B细胞恶性肿瘤(包括ALL、CLL以及NHL)上表达。(Uckun等人，血液，1988 ;71:13-29 ;D’Arena 等人，美国血液学杂志(Am J of Hematology), 2000 ;64:275-281 ;吉乃尔迪(Ginaldi)等人，临床病理学杂志(J Clin Pathol)，1998 ；51:364-369 ;安德森(Anderson)等人，血液，1984 ；63:1424-1433.)⑶19在B细胞恶性肿瘤上的广泛且相对稳定的表达使得此抗原成为基于mAb的疗法的有吸引力的靶标。因此需要利用抗⑶19和抗⑶20抗体的优点的联合疗法来治疗B细胞恶性肿瘤。发明概述在此提供用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，这些方法包括对有需要的患者给予一种联合疗法，该联合疗法包括抗CD19抗体和抗CD20抗体。这类联合疗法相比以相当的给药时程表单独给予的所述抗CD19抗体或所述抗CD20抗体而言，赋予持续更长的持续时间的抗肿瘤活性。还提供了用于利用减少剂量的抗⑶19和/或抗⑶20抗体来治疗B细胞淋巴瘤的方法。具体而言，这类方法包括对有需要的患者给予一种联合疗法，该联合疗法包括抗CD19抗体和抗CD20抗体，其中所述联合疗法的剂量相比剂量是该联合疗法的剂量至少两倍高的所述抗CD19抗体的剂量而言，具有更大的抗肿瘤活性。附图简要说明
图1显示了未岩藻糖基化的抗CD19 mAb 16C4 (16C4_afuc)和抗CD20 mAb(利妥昔单抗)针对多种B细胞白血病和淋巴瘤细胞系的ADCC活性。显示了使用四种细胞系的体外ADCC测定的结果，这些结果是通过一组15种白血病和淋巴瘤细胞系所观察到的活性概况的代表。包括岩藻糖基化的⑶19 mAb 16C4以用于对比。当针对Karpas-1106P细胞进行测试时，16C4_afuc和利妥昔单抗的ADCC活性是相当的(图1A);使用细胞系Farage、Raji以及MeC2获得类似的结果。JVM2(图1B)是在体外针对其利妥昔单抗比16C4_afuc更有效的细胞系的代表；使用细胞系Granta-519、DB、以及JVM-13获得类似的结果。0ci_LY19 (图1C)和Daudi (图1D)是针对其16C4-afuc比利妥昔单抗更具效力的细胞系的代表；使用Toledo、Karpas-422、Nalm-6、RL、以及Namalwa细胞获得类似的结果。在测试的所有细胞系的情况下，16C4-afuc比16C4的岩藻糖基化版本更具效力。显示的结果是三份重复样品的平均值+/_标准差。图1F-H显示了⑶19和⑶20的相对表达(表示为MFI，参见实例2中的表I)，该相对表达 是针对观察到的％最大细胞杀伤(CD19，图1F ；CD20,图1G)并且针对对于16C4-afuc和利妥昔单抗而测定的EC50值(⑶19，图1H KD20，图1I)而绘制的。排除其EC50不能被测定的细胞系/mAb组合(也参见实例2中的表I)。遍及细胞系的这个多样性的组，不能测定到EC50或最大细胞杀伤与抗原表达的显著相关性。图2图解了患者衍生的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞在体外对16C4_afuc介导的ADCC敏感的情况。在图2A中，患者CLL细胞显示了⑶19和⑶20的可变的细胞表面表达。CLL细胞上的CD19和CD20抗原位点的数目如下文在材料和方法中所描述的来测定。在图2B-C中，显示了使用基于FACS的测定、用患者衍生的CLL细胞进行的16C4_afuc和利妥昔单抗的体外ADCC测定结果。使用KC1333NK细胞作为效应细胞，E: T比例是2.5: I。显示了总共测试的六种样品中的三个代表性患者样品的结果。在测试的所有样品的情况下，在耗尽来自患者PBMC样品的CLL B细胞方面，16C4-afuc比利妥昔单抗更有效。所有的ADCC测定重复进行三次，并且呈现平均值(+/_标准差)。显示了抗原表达与16C4-afuc (图2E)和利妥昔单抗(图2F)对于测试的所有六种CLL患者样品的体外ADCC活性的关系。CD19和CD20的抗原位点的数目相比分别使用16C4和利妥昔单抗获得的最大细胞杀伤百分比进行绘制。图3显示，患者衍生的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞对16C4_afuc介导的ADCC敏感。图3A图解了患者ALL细胞上的⑶19和⑶20的表达。对于三种单独的ALL样品，测定CD19和CD20的抗原位点的数目。为了对比，显示来自四位单独供体的正常人外周血B细胞上的抗原位点的数目。如在图3B、3C、3D、以及3E中所示，16C4_afuc具有针对原代ALL细胞的有力的体外ADCC活性。显示了使用来自四位患者的样品的基于FACS的测定的结果。使用KC1333 NK细胞作为效应细胞，E: T比例是2.5: I ;包括利妥昔单抗用于对比。所有的测量重复进行三次，呈现平均值(+/_标准差)。图4显示，16C4-afuc对肿瘤生长的抑制取决于Fe介导的效应子功能。显示了使用16C4-afuc和效应子减少的Fe突变的mAb 16C4-TM在Daudi (图4A)和Raji (图4B)SCID-淋巴瘤异种移植物模型中的体内肿瘤生长抑制。在第O天对SCID小鼠皮下接种淋巴瘤细胞。从第7天开始，动物接受三个每周剂量(2.5mg/kg)的mAb或等体积的媒介物(PBS)。使用人IgGl mAb R347作为同种型对照物。图5显示，16C4-afuc对SCID小鼠中的淋巴瘤生长的抑制是剂量依赖的。当与同种型对照物治疗的动物相比时，使用一系列mAb浓度和给药频率对Raji细胞异种移植物进行的治疗引起显著的肿瘤生长抑制。剂量范围包括0.3、1、3、以及10mg/kg 16C4-afuc。给药时程表变化包括1、3、以及5次剂量。第一次剂量在细胞植入后第5天给予。在图5A中，半周一次给予的16C4-afuc的5次剂量相比每周一次给予的3次剂量(图5B)产生更强的抗肿瘤活性。使用3mg/kg的治疗获得与使用10mg/kg的治疗相当的功效。图6显示，CD19mAb 16C4_afuc在多个SCID淋巴瘤模型中是具有活性的。图6A显示了在三个皮下淋巴瘤异种移植物模型中使用16C4-afuc和利妥昔单抗的肿瘤生长抑制。显示了对于Namalwa (图6A)、Daudi (图6B)、以及Toledo (图6C) B淋巴瘤细胞系的结果。在第O天对SCID小鼠皮下植入肿瘤细胞，然后从第5天开始腹膜内注射16C4-afuc、同种型对照物、媒介物或利妥昔单抗，每周两次，总共5次剂量(3mg/kg)。在图6D和6E中，CD19 mAb16C4-afuc在患有播散性疾病的小鼠模型中具有活性。显示了 16C4-afuc与利妥昔单抗在两个系统性疾病模型中的抗肿瘤活性的对比。显示的结果是针对注射有Namalwa(图6A)和Daudi (图6B)细胞的小鼠。在细胞注射后第7天开始每周两次腹膜内给予16C4_afuc、利妥昔单抗、或同种型对照物(3mg/kg)，并且持续5次剂量。在该播散性肿瘤模型中，使用生存时间或麻痹时间作为终点。图7显示了在SCID淋巴瘤模型中由16C4_afuc和利妥昔单抗的组合产生的延长的肿瘤生长抑制的作用。在SCID-淋巴瘤模型中，根据与16C4-afuc相同的时程表和浓度(3mg/kg,半周一次,总共5次剂量)来给予利妥昔单抗。显示了来自Raji (图7A)、Daudi (图7B)、0c1-LY19(图7C)以及Ramos (图7D)异种移植物模型的结果。16C4_afuc与利妥昔单抗的组合对于Raji和Daudi 模型产生了延长的肿瘤生长抑制。在0ci_LY19模型(其对利妥昔单抗应答不佳)和Ramos模型(其对16C4_afuc应答不佳)中观察到较小的作用。图8显示了单独给予或与利妥昔单抗联合给予的16C4_afuc，在hu⑶19/⑶20转基因小鼠中的药代动力学和药效动力学。考虑了四种分开的给予:16C4-afUc(lmg/kg) +对照物；16C4_afuc (10mg/kg) + 对照物；16C4_afuc (lmg/kg) + 利妥昔单抗；16C4_afuc (lOmg/kg) +利妥昔单抗。不论是单独给予或是联合给予，更高剂量的16C4-afuc(10mg/kg)比更低剂量的16C4-afuc (lmg/kg)在血液中保留的更久。图9显示了在给予联合疗法、单独的利妥昔单抗或单独的16C4_afuc之后，B细胞耗尽实验的结果。结果显示，使用利妥昔单抗(10mg/kg)+16C4-afuc(10mg/kg)的最高剂量的联合疗法导致了持续时间最长的来自血液和脾脏的B细胞耗尽的最大百分比。详细说明A.使用抗⑶19和抗⑶20抗体的联合疗法在此提供用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法，这些方法包括给予抗CD19抗体和抗CD20抗体的组合。该联合疗法与单一抗体疗法(例如，抗CD19或抗CD20单独的给予)相t匕，在减少的剂量下提供了延长的抗肿瘤功效和/或有效的治疗。还提供了用于通过对有需要的受试者(例如，遭受B细胞恶性肿瘤的受试者)给予抗CD19抗体和抗CD20抗体的组合而延长对该受试者中肿瘤生长的抑制的方法。如在此所使用，“进行治疗”或“治疗”是指向受试者给予抗CD19抗体或其抗原结合片段，或向来自受试者的分离组织或细胞系给予抗CD19抗体或其片段，并联合向该受试者、或向来自该受试者的分离组织或细胞系给予抗CD20抗体或其抗原结合片段，其中该受试者具有一种疾病、一种疾病的症状、或对一种疾病的易感性，其中目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、或影响该疾病、该疾病的症状、或对该疾病的易感性。通过“进行治疗”或“治疗”还意指可将这些抗体或其抗原结合片段作为一种单一药用组合物的一部分、或可替代地作为各自包含该抗CD19抗体(或其抗原结合片段)或抗CD20抗体(或其抗原结合片段)的单独药用组合物的一部分而给予该受试者、或来自该受试者的分离组织或细胞系，其中该受试者具有一种疾病、一种疾病的症状、或对一种疾病的易感性，其中目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、或影响该疾病、该疾病的症状、或对该疾病的易感性。多种参数可以指示治疗功效，例如抗肿瘤活性。这些包括但不限于:肿块大小的减小；肿瘤转移性侵袭力的减小；肿瘤生长速率的减小；肿瘤相关后遗症(如恶病质和腹水广生)的严重度或发病率的降低；肿瘤相关并发症(如病理骨折、自身免疫性溶血性贫血、幼淋巴细胞转化、Richter综合征等)的降低和/或预防；肿瘤对化学疗法和其他治疗的敏化作用；增加的患者生存率；观察到的改进的预后如增加的肿瘤浸润淋巴细胞与降低的肿瘤血管化的临床相互关联性的增加；等等。因此，在一些实施例中，给予这两种类型的抗体的组合将导致经受治疗的患者(例如，受试者)中的这些参数中的一个或多个的改进。在其他实施例中，患者中的这些改进关于一些参数是协同性的，而关于其他参数是加和性的。在某些实施例中，使用CD19和CD20抗体的联合疗法的作用可以是加和性的。在其他实施例中，使用CD19和CD20抗体的联合疗法的作用可以是协同性的。术语“协同性”用来描述两种或更多种活性剂的联合作用，该联合作用比每种相应的活性剂的单独作用的总和大。因此，在两种或更多种试剂的这种联合作用导致对活性或过程(例如，肿瘤生长)的“协同抑制”的情况下，意图是对该活性或过程的抑制大于每种相应的活性剂的抑制作用的总和。术语“协同治疗作用”是 指使用两种或更多种疗法的组合所观察到的一种治疗作用，其中该治疗作用(如通过多 种参数中的任一种所测量的)比使用相应的单独疗法所观察到的单独治疗作用的总和大。出于在此的目的，协同作用意思是:在利用以相当的给药时程表或方案给予的CD19抗体和CD20抗体的组合时所观察到的作用，(I)大于在单独地(或单个地)利用这种⑶19抗体或⑶20抗体时所获得的作用；并且(2)大于这种⑶19抗体和CD20抗体的相加总和(加和性)作用。如在此所使用，相当的给药时程表是指这样的给药时程表或方案:它用于评估或比较至少两种不同的治疗的结果并且因而被设计成在正被比较的这些治疗之间是相同的，即，患者正被以相同的方式(例如，天数、给药之间的时间、抗体试剂的浓度)给药，但是使用不同的抗体或联合疗法。该给药时程表的变量将由本领域的技术人员根据正被处理的B细胞恶性肿瘤和治疗选择来确定。这种协同性或协同作用可以通过本领域的技术人员所已知的多种手段来确定。例如，CD19抗体和CD20抗体的协同作用可以使用检验肿瘤细胞数目或肿瘤大小的减少的体外或体内测定形式、或通过肿瘤生长的抑制或肿瘤细胞的耗尽来进行观察。类似地，每个单独组分的协同有效量可以通过测试一系列各个组分的浓度来确定。
如在此所使用，术语“联合”以其最广泛的含义使用并且意思是使用至少两种治疗方案来治疗受试者。因此，“联合抗体疗法”或“联合疗法”旨在意指使用至少两种抗体方案、更具体地说联合使用至少一种抗⑶20抗体(或其抗原结合片段)与至少一种抗⑶19抗体(或其抗原结合片段)来治疗受试者，但给予不同抗体方案的时间安排可以改变，只要获得这些抗体的组合的有益作用。联合使用抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与抗CD19抗体(或其抗原结合片段)的治疗可以是在同一时间(例如，同时地或并存地)、或在不同时间(例如，连续地或依序地)或其组合。出于本披露的目的，在同一时间(例如，同时地)给予是指一起在同一配制品中或在分开配制品中给予这些抗体，其中该给予可以相隔几分钟至几小时，但是不超过一天。如在此所使用，在不同时间(例如，依序地)给予是指相隔几小时至几天、几周并且甚至几个月地给予该联合疗法的抗体。因此，在某些实施例中，经受联合抗体疗法的受试者可以在同一时间(例如，同时地)或在不同时间(例如，在同一天、或在不同天按任一顺序依序地)接受两种抗体，只要在该经受疗法的受试者中产生两种物质的组合的治疗作用。在一些实施例中，将同时给予抗体组合用于一次给药，但其他给药将包括在同一天、或在不同天以任一顺序进行依序给予。依序给予可以在不管受试者是否应答于第一单克隆抗体给予的情况下进行。在这两种抗体被同时给予的情况下，它们可以作为各自包含抗CD20抗体(或其抗原结合片段)或抗⑶19抗体(或其抗原结合片段)的分开药用组合物来给予、或可以作为包含这两种抗体的一种单一药用组合物来给予 。本披露的方法包括使用对需要B细胞疾病治疗的受试者赋予积极治疗应答的联合疗法。关于使用抗CD19和抗CD20抗体的联合治疗而言的积极治疗应答旨在意指与这些抗体或其片段的抗肿瘤活性相关联的在疾病中的改进，和/或在与该疾病相关的症状中的改进。也就是说，可以观察到一种抗增生作用、对进一步肿瘤过度生长的阻止、肿瘤大小的减小、癌细胞数目的减小、和/或由赘生性B细胞介导的一种或多种症状的减少。因此，例如，疾病的改进可被表征为完全应答。通过“完全应答”意指临床上可检测到的疾病的缺乏，伴有任何先前异常的射线照相研究、骨髓、以及脑脊髓液(CSF)的正常化。这样一种应答必须持续在根据本披露的方法治疗之后至少一个月。可替代地，疾病的改进可被归类为部分应答。通过“部分应答”意指在不存在新病变的情况下并且持续至少一个月的所有可测量的肿瘤负荷(例如，受试者中存在的肿瘤细胞的数目)的至少约50%的降低。这样一种应答仅适用于可测量的肿瘤。可以使用筛选技术，如磁共振成像(MRI)扫描、X-射线照相成像、计算机断层照相(CT)扫描、流式细胞计量术或荧光活化细胞分选仪(FACS)分析；生物发光成像，例如荧光素酶成像、骨扫描成像，以及肿瘤活检取样(包括骨髓穿刺(BMA))，针对肿瘤形态学(例如，整体肿瘤负荷、肿瘤大小，等)的变化来评定肿瘤应答。除了这些积极治疗应答之外，正经受疗法的受试者可以经历与疾病相关的症状的改进的有益效果。因此，对于B细胞肿瘤，受试者可以经历所谓的B症状，例如盗汗、发热、重量损失和/或荨麻疹的减少。在此披露的联合疗法以治疗有效剂量来给予。术语“治疗有效剂量”、“治疗有效量”、或“有效量”意指一定量的抗CD19抗体(或其抗原结合片段)，当与一定量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)联合给予时，带来在受试者的包括赘生性B细胞的癌症的治疗方面的积极治疗应答。在一些实施例中，抗CD20抗体(或其抗原结合片段)或抗CD19抗体(或其抗原结合片段)的治疗有效剂量是在从约lmg/kg至约200mg/kg的范围内。应理解，该治疗方法可以包括治疗有效剂量的在本方法的实践中有用的抗体组合的单次给予或治疗有效剂量的该抗体组合的多次给予。在某些实施例中，使用抗⑶19抗体和抗⑶20抗体的联合疗法相对于单独包括抗CD19抗体或单独包括抗CD20抗体的治疗而言,提供了延长的抗肿瘤活性。在某些实施例中，联合疗法可以提供的抗肿瘤活性，与单独使用抗CD19抗体或单独使用抗CD20抗体可获得的抗肿瘤活性相比，持续长至少I周、2周、3周、I个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、I年、或2年。抗肿瘤活性的相对持续时间可以在测试群体的统计分析的基础上进行确定。例如，如果抗CD19抗体在一个测试群体中展现出持续平均6周的一定水平的抗肿瘤活性，并且抗CD20抗体在一个测试群体中展现出持续平均8周的一定水平的抗肿瘤活性，则该组合展现出比单独给予的任一抗体疗法长至少4周的抗肿瘤活性，前提条件是该联合疗法在一个测试群体中展现出持续平均至少12周的与对于单一抗体疗法所见到的至少同等水平的抗 肿瘤活性。抗肿瘤活性的持续时间可以被测量为疗法开始的日期到该疗法不再提供所希望的水平的抗肿瘤活性(例如，通过防止肿瘤体积的增大的能力、耗尽B细胞的能力等所测量的)的时间点。在某些实施例中，如在此所述的抗肿瘤活性是指防止肿瘤大小增大超过1%、2%、5 %、8 %、10 %、12 %、15 %、20 %、25 %或30 %的能力。如在此所使用，肿瘤大小是指直径测量值或估算的肿瘤体积测量值。例如，如果一种联合疗法可以在六个月时间段上防止肿瘤的单维或二维测量值增大超过10%，则它展现出在六个月时间段上的抗肿瘤活性。淋巴瘤肿瘤(例如，存在于周围淋巴结中的肿瘤)的这些二维测量值可以通过使用以上所述的提供了直径或估算的肿瘤体积测量值的仪器进行身体扫描而获得(临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology),2004 ASCO年会论文集(Annual Meeting Proceedings)(会后版).第22卷，第14S号(7月15日增补)，2004:6606)。因此，当在肿瘤的直径测量值方面或在估算的肿瘤体积测量值方面缺乏增长时，目前披露的联合疗法展现出抗肿瘤活性。在另一个实施例中，抗肿瘤活性可以反映在肿瘤大小的实际减小、或者肿瘤在固定大小下在一段时间上的维持中。在另一个实施例中，抗肿瘤活性可以通过相对于治疗前的肿瘤大小，例如直径测量值或估算的肿瘤体积测量值而言，将肿瘤生长抑制超过I %、2 %、5 %、8%、10%、12%、15%、20%、25%或 30%来确定。在某些实施例中，抗肿瘤活性可以通过确定使用一种给定疗法而获得的B细胞耗尽水平来测量。循环B细胞(包括恶性B细胞)最容易通过流式细胞计量术、或以上所述的并且本领域熟知的其他细胞计数装置进行测量，从而产生循环B细胞的计数数目。进一步考虑的是，为大量循环B细胞提供的任何方法可以用于确定在使用该联合疗法的治疗之后B细胞的耗尽。众所周知，循环B细胞耗尽是用于组织B细胞耗尽的替代标志物。因此，这样的B细胞耗尽包括循环B细胞和组织B细胞，这些细胞中的一些可能是恶性的。在某些实施例中，抗肿瘤活性可以通过相对于治疗之前的B细胞水平而言为至少50 %、60 %、70 %、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%的B细胞耗尽水平来确定。例如，如果一种疗法可以在至少六个月时间段上维持90%的B细胞耗尽水平，则该疗法展现出在六个月时间段上的抗肿瘤活性。预测临床功效的一种方法是在一种合适的模型中测量使用这些抗体的联合疗法的作用；例如，抗CD20抗体和抗CD19抗体的组合在鼠类癌症模型中的用途。这些模型包括裸小鼠异种移植肿瘤模型，如使用被称为Namalwa和Daudi的人伯基特淋巴瘤细胞系的那些。在一些实施例中，抗肿瘤活性是在一个分期的裸小鼠异种移植肿瘤模型中使用Daudi人淋巴瘤细胞系进行测定。一个分期的裸小鼠异种移植肿瘤模型细胞系相比未分期的模型而言，在辨别一种给定抗体的治疗功效方面通常更有效，因为在该分期的模型中，抗体给药仅在肿瘤已经达到可测量的大小之后才起始。在该未分期的模型中，抗体给药通常在肿瘤接种约I天内并且在可触知的肿瘤出现之前起始。一种抗体在一个分期的模型中展现出增大的抗肿瘤活性的能力是该抗体将是治疗有效的一个强有力指示。在其他实施例中，抗⑶19抗体和抗⑶20抗体的组合提供了用于使用这些治疗抗体的减少剂量来抑制肿瘤生长或治疗具有B细胞恶性肿瘤的患者的方法。具体而言，在此提供的实例显示，联合疗法(例如，抗CD19抗体和抗CD20抗体的组合)的总剂量比抗CD19抗体的大于该联合疗法的总剂量的剂量更有效。因此，在此披露的方法提供用于增强一种单一抗体疗法的功效，从而允许在更低剂量下的有效治疗并且潜在地避免与该抗体疗法的更高剂量相关联的不希望的副作用。在某些实施例中，联合疗法在至少2倍、3倍、4倍或5倍低于提供相同抗肿瘤活性(例如，应答于单一剂量的相同程度的抗肿瘤活性、或使用相当的给药时程表在限定的时间段上的相同程度的抗肿瘤活性)所需的抗CD19抗体或抗CD20抗体任一者的剂量的总剂量下提供相同或更大的抗肿瘤作用。因此，对于赋予了抗肿瘤活性的抗CD19抗体的任何给定的剂量，该联合疗法将在相比该抗CD19抗体的剂量而言更低的浓度下赋予更大的抗肿瘤活性。该更低的浓度可以是抗CD19抗体的浓度的一半，或者可以小于抗CD19抗体的浓度的一半。在某些实施例中，在此所述的联合疗法可以通过不同的给予手段来完成。例如，该抗⑶19抗体和该抗⑶20抗体可以分开地配制并且给予患者。可替代地，该抗⑶19和抗⑶20抗体可以在单一配制品中被配制在一起。当该抗⑶19和抗⑶20抗体是处于分开配制品中时，这些抗体可以按照相同或不同的给药时程表进行给予。例如，这两种抗体可以在同一时间并且在相同的频率下进行给予(例如，两种抗体一周一次在同一时间进行给予)；它们可以在分开的时间但是以相同的给予频率进行给予(例如，两种抗体一周一次、但是在不同时间进行给予)；或者它们可以使用频率不同的时程表进行给予(例如，一种抗体每周给予一次而另一种抗体每 隔一周进行给予)，等等。在多个示例性实施例中，该抗CD19和抗CD20抗体被配制在一起并且以相同的给药时程表进行给予。B.抗 CD19 抗体在此所述的联合疗法包括抗⑶19抗体。术语“⑶19”或“⑶19抗原”是指例如由HD237或B4抗体鉴别的为约90kDa的抗原(基泽尔(Kiesel)等人，白血病研究II (LeukemiaResearch II)，12:1119 (1987))。CD19被发现在贯穿B谱系细胞从干细胞阶段通过终末分化成为衆细胞的整个分化中的细胞上，这些细胞包括但不限于:前B细胞、B细胞(包括初始B细胞、抗原刺激的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、以及B淋巴细胞)以及滤泡性树突细胞。CD19还被发现在人胎儿组织中的B细胞上。在多个优选实施例中，被在此披露的抗体靶向的⑶19抗原是人⑶19抗原。可以根据在此所述的方法和组合物使用任何合适的抗⑶19抗体。合适的抗⑶19抗体包括，例如，已知的抗CD19抗体、可商购的抗CD19抗体、或使用本领域熟知的方法开发的抗⑶19抗体。如在此所使用，术语“抗体”和“多种抗体”(又称为免疫球蛋白)包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两种不同的表位结合片段形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆骑化抗体、嵌合抗体、单链Fvs (scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab' ) 2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫化物连接的Fvs (dsFv)、以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如对于在此披露的抗体的抗Id抗体)、胞内抗体、以及上述任何各项的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如含有至少一个抗原结合位点的分子。本披露的⑶19抗体可以是单克隆人、人源化或嵌合抗⑶19抗体。在本披露的组合物和方法中使用的抗CD19抗体可以是裸抗体、免疫偶联物或融合蛋白。在某些实施例中，本披露的抗CD19抗体可以介导人抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)、和/或足以耗尽循环B细胞的量的细胞凋亡。在多个示例性实施例中，本披露的抗CD19抗体是已经被工程化成相对亲本抗体而言具有增强的ADCC活性的抗CD19抗体。用于产生具有增强的ADCC活性的抗体变体的方法在下文进行进一步描述。在某些实施例中，本披露的抗CD19抗体是具有增强的ADCC活性的未岩藻糖基化的(afucosylated)抗体。在某些实施例中，在本披露的组合物和方法中使用的抗⑶19抗体可以是具有IgG同种型、特别是IgGU IgG2、IgG3或IgG4人同种型或在人群体中发现的任何IgGUIgG2、IgG3或IgG4等位基因的人、人源化或嵌合抗体。人IgG类别的抗体具有多种功能特征，如在血清中的长半衰期和介导不同的效应子功能的能力(单克隆抗体:原理与应用(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),威利-利斯公司(ffiley-Liss,Inc.)，第I章(1995))。人IgG类别抗体被进一步分成以下4个子类别:IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4。迄今为止，已经针对作为IgG类别抗体的效应子功能的ADCC和⑶C进行了大量的研究，并且据报道，在该人IgG类别的抗体中，IgGl子类别在人中具有最高的ADCC活性和 CDC 活性(化学免疫学(Chemic`al Immunology), 65,88 (1997))。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体是一种已知的抗⑶19抗体，包括但不限于:HD37(IgGl，ΟΦΑΚ0 北美公司(DAK0 North America, Inc.)，加利福尼亚州(Calif.)卡平特提里亚市(Carpinteria)) ;BU12(卡拉尔(Callard)等人，免疫学杂志，148(10):2983-7(1992)) ;4G7 (IgGl)(米克(Meeker)等人，杂交瘤(Hybridoma)，3 (4):305-20 (1984年冬))；J4.119 (贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，德国克雷费尔德市(Krefeld)) ;B43 (PharMingen 公司，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego)) ；SJ25C1 (BDPharMingen公司，加利福尼亚州圣地亚哥)；FMC63 (IgG2a)(左拉(Zola)等人，免疫细胞生物学(Immunol.Cell.Biol.) 69 (PT6):411-22(1991);尼科尔森(Nicholson)等人，分子免疫学(Mol.1mmunol.)，34:1157-1165(1997);彼得斯(Pietersz)等人，癌症免疫学免疫治疗(Cancer Immunol.1mmunotherapy)41:53-60(1995)) ；89B(B4) (IgGl)(贝克曼库尔特公司，佛罗里达州(Fla.)迈阿密(Miami);纳德勒(Nadler)等人，免疫学杂志，131 =244-250(1983));和/或HD237 (IgG2b)(关于人白细胞分化抗原的第四次国际研讨会(Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens),奥地利(Austria)维也纳(Vienna), 1989 ;和皮佐托(Pezzutto)等人,免疫学杂志，138 (9):2793-2799 (1987))。在其他实施例中，本披露的抗CD19抗体是在美国公开号2008/0138336和2009/0142349以及美国专利号7，462，352和7，109, 304中描述的任何抗CD19抗体。在多个示例性实施例中，抗CD19抗体是16C4抗体或其抗原结合片段，如美国公开号2008/0138336和下文所描述的。在某些实施例中，抗⑶19抗体是如以上所述的那些的已知抗⑶19抗体的一种同种型转换变体(如，转换成IgGl或IgG3人同种型)。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体可以免疫特异性地结合至人⑶19，并且可以具有如使用本领域的技术人员所已知的方法(例如，BIAcore测定，ELISA) (BiacoreInternational AB公司，瑞典(Sweden)乌普萨拉(Uppsala))所评定的为小于3000pM、小于2500pM、小于 2000pM、小于 1500pM、小于 ΙΟΟΟρΜ、小于 750pM、小于 500pM、小于 250pM、小于200pM、小于150pM、小于ΙΟΟρΜ、小于75pM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，本披露的抗CD19抗体可以免疫特异性地结合至人CD19抗原，并且可以具有如使用本领域的技术人员所已知的方法(例如，BIAcore测定，ELISA)所评定的在25至3400pM、25至3000pM、25至2500pM、25 至 2000pM、25 至 1500pM、25 至 1000pM、25 至 750pM、25 至 500pM、25 至 250pM、25至100pM、25至75pM、25至50pM之间的解离常数(Kd)。在某些实施例中，本披露的抗CD19抗体可以免疫特异性地结合至人CD19，并且可以具有如使用本领域的技术人员所已知的方法(例如，BIAcore测定，ELISA)所评定的为500pM、100pM、75pM或50pM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，用于在本披露的组合物和方法中使用的抗CD19抗体可能能够减少或耗尽用其治疗的 人中的B细胞。B细胞的耗尽可以是在循环B细胞中、或在特定的组织中，这些组织如但不限于骨髓、脾脏、肠相关淋巴样组织、和/或淋巴结。在一个实施例中，本披露的抗⑶19抗体可耗尽循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。在一个实施例中，本披露的抗CD19抗体可以完成以下细胞的耗尽:祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟的B细胞、成熟的B细胞、抗原刺激的B细胞、和/或浆细胞。这种耗尽可通过以下不同机制来完成:如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、和/或通过阻断CD19与其预期配体的相互作用、和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、B细胞增生的抑制和/或B细胞死亡的诱导(例如，通过细胞凋亡)。通过B细胞的“耗尽”，是指循环B细胞和/或一种或多种特定组织中的B细胞减少了至少约25%、40%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在多个具体实施例中，几乎所有可检测到的B细胞从循环和/或一种或多种特定组织中耗尽。在某些实施例中，由本披露的抗⑶19抗体导致的B细胞耗尽可以持续至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、或至少30天。在另一个实施例中，由本披露的抗⑶19抗体导致的B细胞耗尽可以持续至少I周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、或至少10周。在一个进一步的实施例中，由本披露的抗⑶19抗体导致的B细胞耗尽可以持续至少I个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。
B细胞恶性肿瘤的特征是特异性B细胞亚群的病理性扩张，例如，前体B细胞急性淋巴母细胞白血病的特征是对应于祖B细胞/前B细胞发育阶段的B细胞异常扩张。这些恶性B细胞维持正常B细胞标志物如⑶19的细胞表面表达。抗⑶19抗体因此可以耗尽人受试者中的恶性B细胞。在一个具体的实施例中，本披露的抗CD 19抗体可以实现至少20 %、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的人受试者中的恶性B细胞的耗尽。工程化效应子功能在一些实施例中，关于效应子功能对抗CD19抗体进行修饰，例如以便增强该抗体在治疗B细胞恶性肿瘤中的有效性。一种示例性效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC，它是这样一种细胞介导的反应:其中非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞溶解。这些细胞毒性细胞或效应细胞可以是表达一种或多种FcR的白细胞。效应细胞在小鼠中至少表达Fe Y R1、FC Y RH、Fe Y RIII和/或Fe Y RIV。介导ADCC的一些人白细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。这些细胞中，用于介导ADCC的的原代细胞是NK细胞，NK细胞表达FcyRIII。单核细胞表达Fe Y R1、Fe Y RH、Fe Y RIII和/或Fe Y RIV。造血细胞上的FcR表达概述在拉瓦克(Ravetch)和基内特(Kinet),免疫学年度评论(Annu.Rev.1mmunol.)，9:457-92(1991)中。用于增强抗体的效应子功能的一种方法是通过产生工程化的糖型。工程化的糖型可以通过本领域的技术人员已知的任何方法来产生:例如，通过使用工程化的或变体的表达菌株、通过与一种或多种酶(例如，DI N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIll))进行共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fe区的分子，或通过在该包含Fe区的分子已经被表达之后修饰一种或多种碳水化合物。用于产生工程化的糖型的方法在本领域 中是已知的，并且包括但不限于在以下文献中描述的那些:乌马纳(Umana)等人，1999,自然生物技术(Nat.Biotechnol) 17:176-180;戴维斯(Davies)等人，20017 生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng) 74 =288-294 ;希尔兹(Shields)等人，2002，生物化学杂志(J Biol Chem) 277:26733-26740 ;新川(Shinkawa)等人，2003，生物化学杂志278 =3466-3473)美国专利号6，602，684 ;美国序列号10/277, 370 ;美国序列号 10/113, 929 ；PCT W000/61739A1 ；PCT W001/292246A1 ；PCT W002/311140A1 ；PCTW002/30954A1 ;Potillegent 技术(Biowa 公司，新泽西州普林斯顿(Princeton, N.J.))；GlycoMAb 糖基化工程化技术(GLYCART生物技术AG公司，苏黎世(Zurich)，瑞士 )。参见，例如 W000061739 ；EA01229125 ;US20030115614 ;冈崎(Okazaki)等人，2004，JMB, 336:1239-49。还可以进行一个或多个氨基酸置换，氨基酸置换导致存在于Fe区中的糖基化位点(例如，IgG的天冬酰胺297)消除。另外，未糖基化的抗体可以在缺乏必要的糖基化体系的细菌细胞中产生。还可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减小量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化的抗体或具有增加的等分GIcNAc结构的抗体。已证明，这类改变的糖基化模式增大了抗体的ADCC能力。这类碳水化合物修饰可以通过，例如在具有改变的糖基化体系的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化体系的细胞已经在本领域中予以描述并且可被用作宿主细胞，在那里以表达本披露的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见，例如希尔兹.R.L(Shields，R.L.)等人(2002)生物化学杂志277:26733-26740 ;乌马纳等人(1999)自然生物技术17:176-1,以及美国专利号6，946，292 ;欧洲专利号EPl, 176，195 ;PCT公开W003/035835 ;W099/54342，这些文献各自通过引用以其全文结合于此。在一个实施例中，本披露的抗CD19抗体包含一个变体Fe区，该区介导增强的抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。在一个实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含具有连接至Asn297的多个复杂的N-糖苷连接的糖链的一个Fe区，其中岩藻糖未结合至还原端中的N-乙酰葡糖胺，其中所述Fe区介导增强的抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。在某些实施例中，本披露的抗CD19抗体包含一个Fe变体，其中所述变体Fe结构域具有的对Fe Y受体IIB的亲和力是相当的非变体Fe结构域对该受体的亲和力的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在其他实施例中，效应子功能可以通过在抗体的Fe区中引入一个或多个半胱氨酸残基、从而允许在此区中形成链间二硫键来改变。由此产生的同型二聚体抗体可以具有改进的内在化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性的细胞毒性(ADCC) ο 参见，卡洛(Caron)等人，实验医学杂志(J.Exp Med.) 176:1191-1195 (1992)和肖彭斯.B.J (Shopes, B.，J.)，免疫学杂志，148 =2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体 抗体还可以使用如在沃尔夫(Wolff)等人,癌症研究(Cancer Research),53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。具有双重Fe区的一种抗体也可以被工程化并且因此可以具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见，史蒂文森(Stevenson)等人，抗癌药物设计(Ant1-Cancer Drug Design)，3:219-230 (1989)。其他工程化抗体的Fe区以便改变效应子功能的方法是本领域中已知的(例如，科尼格(Koenig)等人的美国专利公开号20040185045和PCT公开号W02004/016750，它们描述了改变Fe区以相比对于FC Y RIIA的结合亲和力增强对于Fe Y RIIB的结合亲和力；还参见，阿莫(Armour)等人的PCT公开号W099/58572、依度斯基(Idusogie)等人的W099/51642、以及迪欧(Deo)等人的美国专利号6，395，272 ;这些文献的披露内容以其全文结合在此)。修饰Fe区以降低对Fe Y RIIB的结合亲和力的方法也是本领域中已知的(例如，拉万科(Ravetch)等人的美国专利公开号20010036459和PCT公开号W001/79299，这些公开的披露内容以其全文结合在此)。还已经描述了具有多种变体Fe区的修饰的抗体，这些区与野生型Fe区相比具有对于Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIA的增强的结合亲和力(例如，斯塔文哈根(Stavenhagen等人)的PCT公开号TO2004/063351，其披露内容以其全文结合在此)。本领域已知的体外测定可以用于确定在本披露的组合物和方法中使用的抗CD19抗体是否能够介导ADCC。示例性测定描述在美国专利号5，500, 362或5，821，337中。特别地，用于这类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，相关分子的ADCC活性可以在体内，例如在如克莱因斯(Clynes)等人(国家科学院院刊(美国)，95 =652-656(1998))中披露的那种的动物模型中进行评定。该测定还可以使用一种可商购的试剂盒，例如CytoTox96 (普洛麦格公司(Promega))来进行。
示例性抗CD 19抗体在某些实施例中，在此所述的方法和组合物利用抗⑶19抗体16C4(参见，例如美国公开号2008/0138336)、或其抗原结合片段。16C4是一种⑶19 mAb，它显示具有有力的ADCC效应子功能。16C4是⑶19 mAb抗⑶19_2的一种未岩藻糖基化的形式，该抗⑶19-2是通过HB12b mAb的人源化和亲和力优化而发展的(堪萨斯.GS (Kansas GS)和泰德.TF(Tedder TF).免疫学杂志，1991 ；147 =4094-4102 ;矢沢(Yazawa)等人，国家科学院院刊，2005 ； 102 (42):15178-15183 ;赫布斯特(Herbst)等人，药理学与实验治疗学杂志(JPharmacol Exp Ther),2010,335(I):213-222)。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含这样一种重链:它包含含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2 ;以及含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的⑶R3。在其他实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含这样一种重链:它包含含有具有与 SEQ ID NO:2 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99%—致性的氨基酸序列的CDRl ;含有具有与SEQ ID NO:3至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的⑶R2 ;以及含有具有与SEQ ID NO:4至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列的⑶R3。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含这样一种重链:它包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一个可变区。在其他实施例中，本披露的抗CD19抗体包含这样一种重链:它包含一个可变区，该可变区含有具有与 SEQ ID NO:1 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含这样一种轻链:它包含含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在其他实施例中，本披露的抗CD19抗体包含这样一种轻链:它包含含有具有与 SEQ ID NO:6 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99%—致性的氨基酸序列的CDRl ;含有具 有与SEQ ID NO:7至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的⑶R2 ;以及含有具有与SEQ ID NO:8至少75%、80%、85 %、90 %、95 %、97 %、98 %、或99 % —致性的氨基酸序列的⑶R3。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含这样一种轻链:它包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一个可变区。在其他实施例中，一种抗⑶19抗体包含这样一种轻链:它包含一个可变区，该可变区含有具有与 SEQ ID NO:5 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含:含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR2 ;含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR3 ;含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链⑶R2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链⑶R3。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含:含有具有与SEQ ID NO:2至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列的重链⑶Rl ;含有具有与SEQ ID NO:3 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99% —致性的氨基酸序列的重链 CDR2 ;含有具有与 SEQ ID NO:4 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99%一致性的氨基酸序列的重链⑶R3 ;含有具有与SEQ ID NO:6至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列的轻链⑶Rl ;含有具有与SEQ ID NO:7至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的轻链CDR2 ;以及含有具有与 SEQ ID NO:8 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的轻链⑶R3。在某些实施例中，本披露的抗⑶19抗体包含:包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的重链和包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的轻链。在其他实施例中，本披露的抗CD19抗体包含:一个重链，该重链包含一个可变区，该可变区含有具有与SEQ ID NO:1 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99% —致性的氨基酸序列；和一个轻链，该轻链包含一个可变区，该可变区含有具有与SEQ ID从):5至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列。本披露涵盖是结合至人⑶19的抗体16C4的衍生物的多种抗体。本领域的普通技术人员所已知的标准技术可以用于在编码一种抗体的核苷酸序列中引入突变(例如，添力口、缺失和/或置换)，包括例如通常用于产生氨基酸置换的定点诱变和PCR介导的诱变。在一个实施例中，相对于16C4抗⑶19抗体的原始VH和/或VK⑶R，这些VH和/或VK⑶R的衍生物可以包括小于25个氨基酸置换、小于20个氨基酸置换、小于15个氨基酸置换、小于10个氨基酸置换、小于5个氨基酸置换、小于4个氨基酸置换、小于3个氨基酸置换、小于2个氨基酸置换、或小于I个氨基酸置换。在另一个实施例中，这些VH和/或VK⑶R衍生物可以具有在一个或多个预测的非必需的氨基酸残基(例如，对抗体特异性结合至人CD19不重要的氨基酸残基)上进行的保守性氨基酸置换。突变还可以例如通过饱和诱变，沿着所有或部分VH和/或VK⑶R编码 序列来随机引入，并且可以针对生物活性筛选生成的突变体以鉴别保留活性的突变体。诱变之后，可以表达编码的抗体并且可以测定该抗体的活性。两种氨基酸序列的百分比一致性可以通过本领域普通技术人员所已知的任何方法(包括但不限于BLAST蛋白质搜索)来测定。C.抗 CD20 抗体在此所述的联合疗法进一步包括抗⑶20抗体。⑶20抗原(又叫做人B淋巴细胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前B和成熟B淋巴细胞上的具有的分子量为约35kD的一种疏水性跨膜蛋白(瓦伦丁 (Valentine)等人生物化学杂志264(19):11282-11287(1989)；爱因菲尔德(Einfeld)等人EMBO杂志7(3):711-717(1988);克拉克(Clark)和莱德贝特(Ledbetter),癌症研究进展(Adv.Can.Res.) 52:81-149 (1989)；以及瓦伦丁等人生物化学杂志264(19):11282-11287(1989))。CD20在早期前B细胞发育的过程中表达并且保持到浆细胞分化为止；它未被发现在人干细胞、淋巴样祖细胞或正常浆细胞上。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞，例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的细胞上，其中⑶20在多于90%的NHL上表达(安德森等人，血液，63(6): 1424-1433 (1984))。CD20未被发现在造血干细胞、祖B细胞、正常浆细胞或其他正常组织上(泰德等人，免疫学杂志135(2):973-979(1985))。CD20调控用于细胞周期起始和分化的活化过程中的一个或多个早期步骤(泰德等人，上文)，并且可能用作钙离子通道(泰德等人细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)14D:195(1990))。可以根据在此所述的方法和组合物使用任何合适的抗⑶20抗体。合适的抗⑶20抗体包括，例如，已知的抗CD20抗体、可商购的抗CD20抗体、或使用本领域熟知的方法开发的抗⑶20抗体。本披露的⑶20抗体可以是单克隆人、人源化或嵌合抗⑶20抗体。在本披露的组合物和方法中使用的抗CD20抗体可以是裸抗体、免疫偶联物或融合蛋白。在某些实施例中，本披露的抗CD20抗体可以介导人抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)、和/或足以耗尽循环B细胞的量的细胞凋亡。在多个示例性实施例中，本披露的抗CD20抗体是已经被工程化成相对亲本抗体而言具有增强的ADCC活性的抗CD20抗体。用于产生具有增强的ADCC活性的抗体变体的方法在上文予以描述。在某些实施例中，本披露的抗CD20抗体是具有增强的ADCC活性的非岩藻糖基化的抗体。在某些实施例中，在本披露的组合物和方法中使用的抗⑶20抗体可以是具有IgG同种型、特别是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4人同种型或在人群体中发现的任何IgGl、IgG2、IgG3或IgG4等位基因的人、人源化或嵌合抗体。结合⑶20抗原的抗体的实例包括:“C2B8”，现在叫做“利妥昔单抗” (“RITUXAN ，，)；钇-[90]标记的2B8鼠类抗体，命名为“Y2B8”或“替伊莫单抗”(ZEVALIN )(美国专利号5，736，137，通过引用明确结合在此);鼠类IgG2a “BI”，又叫做“托西莫单抗”(贝克曼库尔特公司)，任选地用mI标记，以生成抗体(碘Im托西莫单抗，BEXXAR )(美国专利号5，595，721，通过引用明确结合在此);鼠类单克隆抗体“1F5”(普莱斯(Press)等人，血液69(2):584-591(1987))及其变体，包括“框架修补的(framework patched) ” 或人源化的 1F5 (W003/002607,梁.S (Leung, S.))；ATCC保藏物HB-96450 ;鼠类2H7和嵌合2H7抗体(美国专利号5，677，180，通过引用明确结合在此)；人源化的2H7 ;huMax-CD20 (Genmab公司，丹麦)；AME_133 (应用分子进化(Applied Molecular Evolution)) ;A20抗体或其变体,如嵌合或人源化A20抗体(分别为cA20、hA20) (US2003/0219433，免疫医学(Immunomedics));以及单克隆抗体 L27、G28-2、93-1B3、B-CI或NU-B2,它们可获得自国际白细胞分型研讨会(International LeukocyteTyping Workshop)(瓦伦 丁等人,见:白细胞分型 III (Leukocyte Typing 111)(麦克迈克尔(McMichael)编，第440页，牛津大学出版社(1987))。在一个示例性实施例中，本披露的方法和组合物中联合利用利妥昔单抗或其抗原结合片段与抗CD19抗体或其片段。利妥昔单抗(RITUXAN )是在1998年4月7日授权的美国专利号5，736，137 (安德森等人)中称为“C2B8”的抗体。RITUXAN 被指出用于治疗患有复发性或难治性低级或滤泡性、⑶20阳性、B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者。体外作用机制研究已经表明，RITUXAN 结合人补体并且通过补体依赖性细胞毒性(OTC)溶解淋巴样B细胞系(雷夫(RefT)等人，血液83(2):435-445 (1994))。此外，它在用于抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)的测定中具有显著的活性。最近，RITUXAN 显示在氚标记的胸苷掺入测定中具有抗增生作用并且直接诱导细胞凋亡(马隆尼(Maloney)等人，血液88 (10):637a (1996))。体内临床前研究已经显示，RITUXAN 可能是通过补体和细胞介导的过程，而耗尽来自食蟹猴的外周血、淋巴结以及骨髓的B细胞(雷夫等人，血液83 (2):435-445 (1994))。利妥昔单抗于1997年11月在美国被批准用于以每周375mg/m2的剂量、用四次剂量治疗患有复发性或难治性低级或滤泡性⑶20+B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者。术语“利妥昔单抗”或“RITUXAN ”在此是指基因工程化的嵌合鼠类/人单克隆抗体，它是针对⑶20抗原并且在美国专利号5，736，137中命名为“C2B8”，该专利通过引用明确结合在此。用于利妥昔单抗的轻链可变区和重链可变区的完整核酸和氨基酸序列披露在美国专利号5，736，137中。具体而言，用于利妥昔单抗的轻链可变区的核酸和氨基酸序列披露在美国专利号5，736，137的图4和SEQ ID NO:6中。用于利妥昔单抗的重链可变区的核酸和氨基酸序列披露在美国专利号5，736，137的图5和SEQ ID N0:9中。美国专利号5，736，137的SEQ ID NO:6和9以及图4和5的核酸和氨基酸序列通过引用明确结合在此。利妥昔单抗还可以由包含存在于大肠杆菌宿主细胞中的载体DNA的CHO细胞转染瘤制成，该转染瘤存放于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为69119。利妥昔单抗还可以从杂交瘤2B8中产生，该杂交瘤存放于ATCC，登录号为HB11388。D.B细胞恶性肿瘤在此所述的包括抗⑶19抗体和抗⑶20抗体的联合疗法可以用于治疗B细胞疾病，包括B细胞恶性肿瘤。术语“B细胞恶性肿瘤”包括从B细胞谱系的细胞衍生的任何恶性肿瘤。示例性的B细胞恶性肿瘤包括但不限于:B细胞亚型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL、小淋巴细胞(SL) NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小无裂细胞NHL、套细胞淋巴瘤、以及大块疾病NHL ;伯基特淋巴瘤；多发性骨髓瘤；前B急性淋巴母细胞白血病以及从早期B细胞前体衍生的其他恶性肿瘤；常见的急性淋巴细胞性白血病(ALL);慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL ;毛细胞白血病；Null型急性淋巴母细胞白血病；瓦氏巨球蛋白血症；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化的B细胞样(ABC)DLBCL、以及3型DLBCL ;幼淋巴细胞白血病(pro-lymphocyticleukemia);轻链病；浆细胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；浆细胞白血病；意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS);焖燃性多发性骨髓瘤(SMM);惰性多发性骨髓瘤(IMM);霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节性淋巴细胞主导型；淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL);以及边缘区淋巴瘤，包括胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。
还涵盖对这些癌症的复发的治疗。LPHD是霍奇金病的一个类型，不管是放射治疗还是化学疗法治疗它都趋于频繁复发并且其特征是CD20阳性恶性细胞。CLL是白血病的四种主要类型中的一种。一种成熟B细胞(叫做淋巴细胞)的癌症-CLL体现为血液、骨髓以及淋巴组织中的细胞的渐进性累积。惰性淋巴瘤是一种生长缓慢的、不可治愈的疾病，其中患者在多个周期的缓解和复发之后平均生存6与10年之间。B细胞耗尽的所希望的水平将取决于疾病。为了治疗B细胞恶性肿瘤，可能希望的是最大化B细胞的耗尽，这些B细胞是本披露的抗⑶19和抗⑶20抗体的靶标。因此，为了治疗B细胞瘤，希望的是B细胞耗尽足以至少阻止疾病的进展，这可以由本领域中熟练的医师，例如通过监测具体癌症的肿瘤生长(大小)、癌细胞类型的增生、转移、其他病征和症状来评定。优选地，B细胞耗尽足以阻止疾病进展，持续至少2个月、更优选3个月、甚至更优选4个月、更优选5个月、甚至更优选6或更多个月。在多个甚至更优选的实施例中，B细胞耗尽足以将缓解时间增加至少6个月、更优选9个月、更优选1、更优选2年、更优选3年、甚至更优选5或更多年。在一个最优选的实施例中，B细胞耗尽足以治愈该疾病。在多个优选实施例中，癌症患者的B细胞耗尽是治疗前基线水平的至少约75%并且更优选是80%、85%、90%、95%、99% 并且甚至是 100%。如果与治疗前相比，在给予本披露的组合物之后在症状或其他适用指标中存在可测量的改进，则本披露的这些方法减轻或成功治疗了患者的B细胞瘤。治疗作用可能在给予本披露的组合物之后3-10周内是明显的。每种疾病的适用指标是适当领域中熟练的医师所熟知的。例如，该医师可以监测所治疗的患者的疾病的临床或血清学证据，如疾病的血清学标志物、全血计数(包括B细胞计数)、以及血清免疫球蛋白水平。患者可以表现出在以下各项中的一种或多种方面的可观察的和/或可测量的减少或不存在:癌细胞数目的减小或癌细胞的不存在；肿瘤大小的减小；对癌细胞侵润到器官中的抑制(例如，某种程度的减缓并且优选停止)；对肿瘤转移的抑制(例如，某种程度的减缓并且优选停止)；对肿瘤生长某种程度的抑制；和/或对与具体癌症相关的一种或多种症状的某种程度的减轻；减小的发病率和死亡率、以及活组织质量的改进。优选地，在给予本披露的组合物之后，相比在通过本披露的方法进行治疗之前所取得的具体症状或指标的基线而言，改进是至少20%、更优选25% -30%、甚至更优选30% -35%、最优选40%及以上。用于评定对瘤的治疗的功效或成功的参数将是适当疾病中熟练的医师所已知的。总体而言，熟练的医师将寻求具体疾病的病征和症状的减少。参数可以包括疾病进展的中位时间、缓解时间以及稳定疾病时间。对于B细胞瘤，可测量的指标可以包括，例如疾病进展的时间、总体和/或无进展生存期的持续时间的增加。在白血病的情况下，可以进行骨髓活检以确定缓解的程度。完全缓解可被定义为，在治疗之后30天，白细胞组成了在患者骨髓中发现的所有细胞的不到5%。以下参考文献描述了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗以及用于测量治疗功效的标准医学程序。卡内罗斯.G.P(Canellos G P),李斯特.T.A(Lister, T A),斯克拉.J.L (Sklar J L):淋巴瘤(The Lymphomas).ff.B.桑德斯公司(W.B.SaundersCompany),费城(Philadelphia), 1998 ;范蒋思.K(van Besien K)和卡布尼拉期1.F (Cabani I las, F):临床表现(Clinical Manifestations),非霍奇金淋巴瘤的分期和治疗(Staging and Treatment of Non-Hodgkin，s Lymphoma),第 70 章，第 1293-1338 页，见:血液学，基本原理和实践(Hematology, Basic Principles and Practice),第 3 版.霍夫曼(Hoffman)等人(编辑).丘吉尔利文斯通出版社(Churchill Livingstone),费城，2000 ;以及拉埃.K(Rai, K)和 帕特尔.D(Patel, D):慢性淋巴细胞性白血病(ChronicLymphocytic Leukemia),第72章，第1350-1362页，见:血液学，基本原理和实践，第3版.霍夫曼等人(编辑).丘吉尔利文斯通出版社，费城，2000。E.药用配制品在某些方面，本发明提供了包含抗⑶19抗体、抗⑶20抗体、或其组合以及一种药学上可接受的赋形剂的药用组合物。在某些实施例中，本披露的药用组合物被用作药物。在某些实施例中，抗⑶19抗体、抗⑶20抗体、或其组合可以与一种药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂一起配制作为药用(治疗)组合物，并且可以通过本领域已知的多种方法来给予。如将为熟练的业内人士所理解，给予途经和/或方式将随所希望的结果而改变。术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒性材料。这类制剂通常可含有盐、缓冲剂、防腐剂、兼容的载体、以及任选地其他治疗齐U。这类药学上可接受的制剂通常还可含有适合给予人的兼容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。可在在此所述的配制品中利用的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括:例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质类、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)，等等。适合在在此所述的配制品中使用的这些和另外已知的药用载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如在“雷氏:药学的理论与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy) ”,第 21 版，利平科特.威廉斯&威尔金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins), (2005),并且在“医师案头参考(Physician，s Desk Reference) ”,第 60 版，医学经济学(Medical Economics),新泽西州蒙特威尔(Montvale) (2005)中所列举的。通常可以选择如本领域技术人员所熟知的或者如在此所述的适合于该联合疗法的抗体的给予方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。在此所述的配制品包含处于产生适用于所希望的剂量的w/v的浓度的抗⑶19抗体、抗⑶20抗体、或其组合。在某些实施例中，抗⑶19抗体或抗⑶20抗体在配制品中以约lmg/ml 至约 200mg/ml、约 lmg/ml 至约 100mg/ml、约 lmg/ml 至约 50mg/ml、或 lmg/ml 与约25mg/ml的浓度存在。在某些实施例中，配制品中抗CD19或抗CD20抗体的浓度可以从约0.1至约100重量％变化。在某些实施例中，抗⑶19或抗⑶20抗体的浓度的范围是0.003至1.0摩尔浓度。在某些实施例中，抗⑶19抗体和抗⑶20抗体被配制在一起，并且每种抗体在配置品中以约 lmg/ml 至约 200mg/ml、约 lmg/ml 至约 100mg/ml、约 lmg/ml 至约 50mg/ml、或 Img/ml与约25mg/ml的浓度存在。在某些实施例中，配制品中每种抗体的浓度可以从约0.1至约100重量％变化。在某些 实施例中，每种抗体的浓度的范围是0.003至1.0摩尔浓度。在某些实施例中，抗⑶19抗体是根据W02010102276中的任何配制品来配制。在一个实施例中，本披露的配制品是基本上不含有内毒素和/或相关热原物质的无热原配制品。内毒素包括被局限在微生物内部并且只有当微生物分解或死亡时才被释放的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物的外膜的诱导发热的、热稳定性物质(糖蛋白)。如果给予人类，这些物质均可以引起发热、低血压以及休克。由于潜在的毒性作用，即使是小量的内毒素也必须从静脉内给予的药用药物溶液中去除。食品与药物管理局(“FDA”)已经为静脉内药物应用设置了为在单个一小时时间段内每千克体重每剂量5个内毒素单位(EU)的上限(美国药典公约(The United States Pharmacopeial Convention),药典论坛(Pharmacopeial Forum) 26 (I):223(2000))。在某些具体实施例中，组合物中的内毒性和热原水平是小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于lEU/mg、或小于0.lEU/mg、或小于 0.01EU/mg、或小于 0.00 lEU/mg ο当用于体内给予时，本披露的配制品应是无菌的。本披露的配制品可以通过各种杀菌方法，包括无菌过滤、放射等进行杀菌。在一个实施例中，该配制品是用预先杀菌的0.22微米的过滤器进行过滤杀菌。用于注射的无菌组合物可以根据如在“雷氏:药学的理论与实践”，第21版，利平科特.威廉斯&威尔金斯出版公司，(2005)中所述的常规药学实践来配制。本披露的治疗组合物可以配制以用于特定的给予途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给药。如在此所使用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外给予的”是指非肠内和局部给药的、通常是通过注射的给予方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。本披露的适合于局部或经皮给药的配制品包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。这种或这些抗体可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合、并且与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂混合(美国专利号7，378，110 ;7，258，873 ;7，135，180 ;美国公开号2004-0042972 ;以及 2004-0042971)。这些配制品可以按照单位剂型呈现并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。本披露的药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得针对具体患者、组合物、以及给予方式而有效达到所希望的治疗应答，而不对该患者产生毒性的活性成分量(例如，“治疗有效量”)。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的本披露的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗的持续时间、与所采用的具体组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。合适剂量的范围可以是从约0.0001至约100mg/kg体重或更大，例如约0.1、1、10、或50mg/kg体重,其中约I至约10mg/kg体重是优选的。在某些实施例中，该方法包括联合给予多剂量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与多剂量的抗CD19抗体(或其抗原结合片段)。该方法可以包括给予1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个治疗上有效剂量的一种药用组合物，该组合物包含抗CD20抗体(或其抗原结合片段)或抗CD19抗体(或其抗原结合片段)中的一者、或两者。给予多剂量的药用组合物的频率和持续时间可以由本领域的技术人员容易地确定而无需过多的实验。此外，使用治疗有效量的抗体组合对受试者进行的治疗可以包括一种单一治疗、或优选地可以包括一系列治疗。例如，受试者可以使用抗CD20抗体(或其抗原结合片段)和抗CD19抗体(或其抗原结合片段)的组合来治疗，其中两种抗体被给予的剂量范围是在约I至约100mg/kg体重之间，一周一次，持续在约I至约10周之间、优选在约2至约8周之间、更优选在约3至约7周之间、并且甚至更优选持续约4、5、或6周。可以每年进行治疗以预防复发，或在出现复发迹象时进行治疗。还将理解的是为用于治疗所使用的抗体或其抗原结合片段的有效剂量可以在具体治疗的过程中增大或减小。剂量`改变可以是由如在此所述的诊断测定的结果所引起并且因其变得明显。因此，在一个实施例中，给药方案包括联合给予治疗有效剂量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与治疗有效剂量的抗CD19抗体(或其抗原结合片段)，其中该组合在一个治疗期的第1、8、15以及22天进行给予。在另一个实施例中，该给药方案包括联合给予治疗有效剂量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与治疗有效剂量的抗CD19抗体(或其抗原结合片段)，其中该组合在一个治疗期中的一周的第1、2、3、4、5、6以及7天进行给予。多个进一步的实施例包括:一个给药方案，其中治疗有效剂量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与治疗有效剂量的抗CD19抗体(或其抗原结合片段)联合给予，其中该组合在一个治疗期中的一周的第1、3、5、以及7天进行给予；一个给药方案，该方案包括联合给予治疗有效剂量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与治疗有效剂量的抗CD19抗体(或其抗原结合片段)，其中抗体组合在一个治疗期中的一周的第I和3天进行给予；以及一个优选给药方案，该方案包括在一个治疗期中的任一给定周的第I天联合给予治疗有效剂量的抗CD20抗体(或其抗原结合片段)与抗CD19抗体(或其抗原结合片段)。该治疗期可以包括I周、2周、3周、一个月、3个月、6个月、或一年。多个治疗期可以彼此相继或相隔I天、一周、2周、一个月、3个月、6个月、或一年。使用抗CD19抗体(或其抗原结合片段)和抗CD20抗体(或其抗原结合片段)的组合的治疗可以包括同时或并存地给予一种或两种抗体，只要该治疗在治疗过程中的某一点包括抗CD20抗体(或其抗原结合片段)和抗CD19抗体(或其抗原结合片段)的组合。该联合疗法的作用还可以通过改变给予抗CD20抗体和/或抗CD19抗体治疗的时间安排进行优化。联合使用抗CD20抗体或其抗原结合片段与抗CD19抗体或其抗原结合片段的治疗可以是同时的(并存的)、连续的(依序的)、或其组合。因此，经受联合抗体疗法的受试者可以在同一时间(例如，同时地)或在不同时间(例如，在同一天、或在不同天按任一顺序依序地)接受抗CD20抗体(或其抗原结合片段)和抗CD19(或其抗原结合片段)。因此，在一些实施例中，将抗CD20抗体(如利妥昔单抗)(或其抗原结合片段)与抗CD19抗体(如16C4)(或其抗原结合片段)同时给予。在其他实施例中，首先给予抗CD20抗体(如利妥昔单抗)(或其抗原结合片段)，并且然后给予抗CD19抗体(如16C4)(或其抗原结合片段)。在仍然其他实施例中，首先给予抗CD19抗体(如16C4)(或其抗原结合片段)，并且然后给予抗CD20抗体(如利妥昔单抗)(或其抗原结合片段)。在一些实施例中，并存地给予抗CD20抗体和抗CD19抗体(如利妥昔单抗和16C4)的组合用于一次给药，但其他给药包括在同一天、或在不同天按任一顺序进行依序给予。在该抗CD20抗体(如利妥昔单抗)和该抗CD19抗体(如16C4)被同时给予的情况下，它们可以作为各自包含抗CD20抗体(或其抗原结合片段)或抗CD19抗体(或其抗原结合片段)的分开的药用组合物来给予、或可以作为包含这两种抗癌剂的一种单一药用组合物来给予。实例虽然现在大体上描述了本发明，通过参考以下实例将会更容易理解，这些实例仅出于说明某些实施例和本披露的实施例的目的而包括在内，并且不旨在限制本发明。实例1:抗⑶19 mAb 16C4_afuc具有针对多种B白血病和淋巴瘤细胞系的有力的体外ADCC活性
16C4_afuc是mAb 16C4的未岩藻糖基化的形式，该抗体是通过小鼠IgGl mAbHB12B的人源化和亲和力成熟而产生的。(堪萨斯GS和泰德TF.免疫学杂志，1991 ; 147:4094-4102 ;矢沢等人，国家科学院院刊，2005 ； 102 (42):15178-15183 ;赫布斯特等人，药理学与实验治疗学杂志，2010，335 (I) =213-222) ο相比于岩藻糖基化的16C4 mAb, 16C4-afuc具有约9倍增大的对于活化的人Fe YRIIIA和小鼠Fe y RIV的亲和力以及增强的ADCC效应子功能。相比于利妥昔单抗，16C4不介导CDC。(赫布斯特等人，药理学与实验治疗学杂志，2010，335 (I):213-222.)在一大组B白血病和淋巴瘤细胞系中，将16C4_afuc的ADCC活性与岩藻糖基化的前体mAb 16C4的ADCC活性进行对比。将CD20 mAb利妥昔单抗包括在所有测定中作为阳性对照。在测试的所有细胞系下，16C4-afuc在介导ADCC方面显著比亲本mAb抗⑶19 mAb更具效力(图1A-1E)。当对比16C4-afuc与利妥昔单抗针对全组15种恶性B细胞系的活性时，观察到三种不同的活性概况:一、16C4-afuc和利妥昔单抗针对其的能力是大约均等的细胞系，由Karpas-1106P细胞示例(图1A)，它们表达中度至高度量的⑶19 (表I) ;二、针对其利妥昔单抗比16C4-afuc更有效的细胞系，如CLL细胞系JVM2 (图1B);三、针对其16C4-afuc比利妥昔单抗更有效的细胞系，如0c1-LY19细胞(图1C)和Daudi细胞(图1D和表I)。还分别分析这些细胞系对⑶19和⑶20的相对表达以确定这两种抗原的表面水平是否决定了它们对CD19和CD20 mAb的体外敏感性(表I)。在图1B中，使用16C4_afuc和利妥昔单抗所观察到的ADCC活性(细胞毒性最大百分比，图1E针对CD19 mAb并且图1F针对⑶20 mAb ；EC50值，图1G针对⑶19 mAb并且图1H针对⑶20 mAb)针对⑶19和⑶20的相对表面表达而进行绘制，如通过流式细胞计量术使用mAb 16C4-afuc和利妥昔单抗作为初级抗体用于检测而测定的。对某些细胞系而言，对抗CD19和抗CD20 mAb的敏感性似乎匹配它们的相对抗原表达。例如，0c1-LY19细胞具有对⑶20的低水平但对⑶19的高表达，并且只应答于16C4治疗(表I)。对于Granta-519细胞，观察到相反的情况，这些细胞高水平表达⑶20并且被利妥昔单抗而不被16C4-afuc有效杀伤。然而，对所有细胞系的一个对比并没有显示出抗原表达与对由任一 mAb介导的ADCC的敏感性的显著相关性。这一相关性的缺乏由Karpas-422细胞展示，这些细胞表达低水平的CD19和CD20，并且被16C4_afuc而不被利妥昔单抗有效杀伤。总之，这些结果证明16C4_afuc具有针对多种细胞系的有力的体外ADCC活性。在测试的15种细胞系中的11种的情况下，16C4-afuc的ADCC活性比⑶20mAb优越。然而，使用这不同组的恶性B细胞系，不存在抗原表达与对⑶19或⑶20 mAb介导的ADCC的敏感性
的显著相关性。实例2: 16C4-afuc有效针对患者衍生的体外CLL和ALL细胞给定16C4_afuc针对B细胞系的活性，还检验了⑶19 mAb针对原代白血病细胞的作用。从诊断患有CLL的患者中获得六种PBMC样品，并且测定对于⑶19和⑶20的表面抗原密度。如图2A所示，这些样品中的B细胞不同程度地表达CD19和CD20。在这些样品的一些样品中，CD20抗原位点的数目比CD19位点的数目大。使用体外基于FACS的细胞毒性测定来评估16C4-afuc杀伤这些CLL样品中的B细胞的能力，使用利妥昔单抗作为阳性对照。图2B-2D显示了对16C4-afuc和利妥昔单抗进行的针对三种代表性CLL样品的ADCC测定的结果(CLL#106,图 2B ；CLL#104,图 2C ；CLL#107,图 2D)。16C4_afuc 的 EC5tl 值的范围是从0.007nM至0.063nM。相比之下，利妥昔单抗的EC50值的范围是从0.639nM至0.682nM。分别将CLL细胞对由16C4-afuc和利妥昔单抗介导的ADCC的敏感性与它们对⑶19和⑶20的表面表达进行对比(分别是图2E和2F)。此分析的结果显示出一个明显的趋势:对于CD19和⑶20，随着抗原密度增加，细胞杀伤更有效。使用这些原代CLL样品的结果还显示，与利妥昔单抗相比，16C4-afuc在相对低水平的表面抗原表达下在介导体外耗尽方面更有效。还在基于FACS的ADCC测定中使用来自四位患有ALL的患者的PBMC样品测试了16C4-afuc的活性。对于这些测定中的三个，相比于来自四位健康供体的B细胞，存在足够的细胞数目来测定⑶19和⑶20的抗原密度(图3A)。对于正常的外周血B细胞，⑶19和⑶20的平均密度经测定分别是每细胞约20，000和约200，000个抗原位点。相比于正常的B细胞，⑶19表达稍微少一半，而在第三ALL样品中增大到约两倍(图3A)。然而，⑶20抗原位点的数目变化更广泛。在对于来自患有ALL的供体的样品的ADCC B细胞耗尽测定中(图3B-3E)，使用16C4-afuc的EC50值的范围是从0.002nM至0.131nM。这些值是使用利妥昔单抗获得的EC5tl值的1/6至小于1/1 00。总之，这些结果显示16C4_afuc有效地介导针对来自患有CLL和ALL的患者的原代白血病细胞的ADCC。在这些体外测定中，⑶19 mAb比⑶20 mAb利妥昔单抗更有效。在其中⑶20表达水平显著高于细胞表面⑶19的水平的样品中，情况也是如此。以上实验的结果概述在表I中:
权利要求
1.一种用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括对有需要的患者给予一种联合疗法，该联合疗法包括抗CD19抗体和抗CD20抗体，其中所述联合疗法相比以相当的给药时程表单独给予的所述抗CD19抗体或所述抗CD20抗体而言，提供了持续更长的持续时间的抗肿瘤活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是选自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
3.如权利要求1所述的方法，其中该联合疗法提供协同治疗作用。
4.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD19抗体和该抗CD20抗体被同时地给予。
5.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD19抗体和该抗CD20抗体被依序地给予。
6.如权利要求1所述的方法，其中该抗肿瘤活性是肿瘤生长的抑制。
7.如权利要求1所述的方法，其中该抗肿瘤活性是恶性B细胞的耗尽。
8.如权利要求1所述的方法，其中该联合疗法相比以相当的给药时程表单独给予的所述抗CD19抗体或所述抗CD20抗体而言，赋予持续长了至少一个月的抗肿瘤活性。
9.如权利要求1所述的方法，其中该联合疗法相比以相当的给药时程表单独给予的所述抗CD19抗体或所述抗CD20抗体而言，赋予持续长了至少六个月的抗肿瘤活性。
10.如权利要求1所述的方法，其中该联合疗法赋予持续至少六个月的抗肿瘤活性。
11.如权利要求1所述的方法，其中该患者的肿瘤体积在使用该联合疗法的六个月时间段的治疗过程中增大了小于10%。
12.如权利要求1所 述的方法，其中该抗CD19抗体具有如在体外所测量的增强的抗体依赖性的、细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
13.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD19抗体是未岩藻糖基化的。
14.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD19抗体是人或人源化抗体。
15.如权利要求1所述的方法，其中该抗⑶19抗体包含:含有SEQID NO:2的氨基酸序列的重链CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR2 ;含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR3 ;含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链⑶R2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链⑶R3。
16.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD19抗体包含一个VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
17.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD19抗体包含一个VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
18.如权利要求1所述的方法,其中该抗⑶19抗体包含一个VH结构域和一个VL结构域，该VH结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该VL结构域包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
19.如权利要求1所述的方法，其中该抗CD20抗体是利妥昔单抗。
20.一种用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括对有需要的患者给予一种联合疗法，该联合疗法包括抗CD19抗体和抗CD20抗体，其中所述联合疗法的剂量相比是该联合疗法的该剂量至少两倍高的所述抗CD19抗体的剂量而言，具有更大的抗肿瘤活性。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是选自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
22.如权利要求20所述的方法，其中该联合疗法提供协同治疗作用。
23.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体和该抗CD20抗体被同时地给予。
24.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体和该抗CD20抗体被依序地给予。
25.如权利要求20所述的方法，其中该抗肿瘤活性是肿瘤生长的抑制。
26.如权利要求20所述的方法，其中该抗肿瘤活性是恶性B细胞的耗尽。
27.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体具有如在体外所测量的增强的抗体依赖性的、细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
28.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体是未岩藻糖基化的。
29.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体是人或人源化抗体。
30.如权利要求20所述的方法，其中该抗⑶19抗体包含:含有SEQID NO:2的氨基酸序列的重链CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR2 ;含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR3 ;含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链⑶R2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链⑶R3。
31.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体包含一个VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
32.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD19抗体包含一个VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。`
33.如权利要求20所述的方法，其中该抗⑶19抗体包含一个VH结构域和一个VL结构域，该VH结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该VL结构域包含SEQID NO:5的氨基酸序列。
34.如权利要求20所述的方法，其中该抗CD20抗体是利妥昔单抗。
全文摘要
本披露提供了用于使用抗CD19和抗CD20抗体的组合来治疗B细胞淋巴瘤的方法。这类方法相比单一抗体疗法提供了治疗优点，包括延长的抗肿瘤活性和/或减少的剂量。
文档编号A61K39/00GK103228291SQ201180054813
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月14日 优先权日2010年11月15日
发明者R·赫伯斯特, E·K·沃德, K·P·麦基弗 申请人:米迪缪尼有限公司