专利名称：含有gkn1的抗癌用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有GKNl (Gastrokinel,胃动蛋白I)的抗癌用组合物，尤其涉及能够抑制胃癌的产生、抑制癌细胞转移的活性优秀的GKNl基因的新用途。
背景技术：
胃癌(Stomach cancer)作为在全世界范围内在韩国、日本等地多发的癌症，虽然在美国、欧洲等西方癌症的发病率较低，但是在韩国，癌症发病率排在第一位的为胃癌，死亡率紧随肺癌排在第二位。察看胃癌的分类，整个胃癌的95%为在胃壁黏膜的腺细胞中产生的腺癌，之外还有在淋巴系统产生的淋巴瘤、在间质组织中产生的胃肠道间质瘤。在引起胃癌的多种发病原因中，尤其食物成了最重要的发病原因，在加工的肉类中大量含有的硝酸盐、亚硝酸盐被认为是最有力的致癌物质，烧焦的食物、又辣又咸的食物被认为会成为导致胃癌的原因。除此之外，最近备受瞩目的幽门螺旋杆菌作为胃炎和胃溃疡的病原菌，被查明与胃癌的产生有相关性。并且，察看癌症发病的原因，由于诱发癌症的致癌基因的不正常的活性化，导致细胞增殖或与之相反地抑制细胞的不正常增殖，或者启动细胞凋亡程序来杀死特定细胞，从而在阻断癌细胞生成的癌症抑制基因出现异常而产生癌症，即使是具有被不正常活性化的癌基因的细胞，只要癌症抑制基因表现出正常的活性，则该细胞就不能形成癌症而凋亡。因而，为了成为癌细胞则不仅要有致癌基因的活性化，而且在一个细胞中应同时出现癌症抑制基因的非活性化。对此，最近在全世界范围内正就通过对与癌症的生成及治疗相关的基因的功能进行研究来发掘治疗用靶，并将这些用于诊断及治疗剂的开发而展开着激烈的竞争。随着与基因组研究的活跃相伴，对人类基因DNA芯片或蛋白质组学分析研究活跃，并大量发掘与癌症相关的基因，从而构 建了很多基因的目录和相关数据库，但是对于这些基因的在细胞内的具体生物学功能及癌症相关性大部分还没有被研究或不确定，因而与实际与癌症的相关性或诊断及作为靶基因来使用一同，进而在发掘能够有效治疗癌症的基因方面存在相当大的困难。因此，实际情况是，除了到目前为止被查明的与癌症相关的基因之外，还需要发掘新的基因。另一方面，在目前治疗癌症的方法中3种主要的治疗方法为外科治疗方法、药物疗法、放射疗法，其中药物疗法在治疗过程中伴随的痛苦较少，比起外科治疗或放射治疗，在治疗后癌症的复发相对较少，因而受到期待。因此，开发了很多能够满足这种期待的抗癌剂并被使用，其中大部分的抗癌剂主要针对癌症的异常增殖，通过使分裂活跃的细胞选择性地凋亡来表现出抗癌效果。这种抗癌剂伴有会一同杀死作为通常在人体内分裂活跃的细胞的免疫细胞、毛根细胞等的正常细胞的严重的副作用，因而具有不能长时间使用的问题。并且，作为用于治疗胃癌的方法，使用淋巴结切除术、内镜下黏膜切除术、腹腔镜下胃切除术等的方法，内镜下黏膜切除术作为对黏膜内的早期胃癌，在存在癌症病变的胃黏膜周围注入生理盐水来使得病变部位鼓起后切除存在病变的黏膜的方法，虽然具有能够通过简单的内镜下手术来避免胃切除手术的痛苦的优点，但在局限于黏膜的早期胃癌中淋巴结转移可能性低的情况下使用时会受到限制。因而，实际情况是，需要发掘用于与癌症的发病相关联来起到主要功能并能够利用该功能在癌症的早期进行预防和治疗的新的抗癌剂的开发的靶基因。
发明内容
技术问题为此，本发明者鉴于GKNl基因在正常的胃黏膜细胞上表达而在胃癌组织中其表达下降的问题，对上述基因的功能进行研究的结果，最先查明了 GKNl基因具有能够抑制胃癌细胞的增殖及活性，并阻碍癌症转移的功能，确认了能够将上述基因用作癌症治疗剂的事实，进而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供包含GKNI蛋白质或对GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸的抗癌用组合物。本发明的再一目的在于，提供一种抗癌剂筛选方法，该抗癌剂筛选方法包括如下步骤:培养GKNl蛋白质或表达上述蛋白质的重组细胞和候选物质(candidate substance)的步骤；以及测定GKNl蛋白质的活性或对细胞内表达水平的增加所产生的效果的步骤。解决问题的手段为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供包含GKNl蛋白质或对GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸的抗癌用组合物。在本发明的一实施例中，上述GKNl蛋白质可以包含序列第I位的氨基酸序列。在本发明的一实施例中，对上述GK`Nl蛋白质进行编码的多核苷酸可以是包含序列第2位的碱基序列多核苷酸。在本发明的一实施例中，上述多核苷酸可以是包含于表达载体内的多核苷酸。在本发明的一实施例中，上述表达载体可以是具有图12的酶切图(cleavagemap)的 pcDNA3.1-GKNl0在本发明的一实施例中，上述癌症可以是胃癌。并且，本发明提供一种抗癌剂筛选方法，其特征在于，包括如下步骤:培养GKNl蛋白质或表达上述蛋白质的重组细胞和候选物质的步骤；以及测定GKNl蛋白质的活性或对细胞内表达水平的增加所产生的效果的步骤。在本发明的一实施例中，还可包括如下步骤:在上述候选物质增加GKNl蛋白质的活性或在细胞中增加GKNl基因的表达水平的情况下，将上述候选物质判断为具有抗癌活性的抗癌剂的步骤。在本发明的一实施例中，上述GKNl蛋白质的活性或细胞内表达水平可以通过选自由免疫共沉淀法(coimmunoprecipitation)、放射免疫分析法(RIA, Radioimmunoassay) >酶联免疫分析法(ELISA, enzyme-linked immuno sorbent assay)、免疫组织化学、蛋白质印迹法(Western Blotting)以及突光激活细胞分拣术(FACS, fluorescence-activatedcell sorting)组成的组中的某一种方法来执行。在本发明的一实施例中，上述抗癌剂能够预防或治疗胃癌。发明的效果
由于本发明的GKNl蛋白质具有不仅抑制癌细胞产生的活性优秀，而且在过度表达时抑制癌细胞转移的活性也优秀的特征，因而具有能够有效用作抗癌治疗用组合物的效
果O
图1表示胃癌组织的GKNl蛋白质免疫染色结果，图1的(A)部分表示在陷窝细胞和浅表性胃上皮细胞中的免疫活性，图1的(B)部分表示在胃腺瘤中的免疫阳性，图1的(C)表示在管状腺瘤中的阴性免疫染色结果，图1的(D)部分表示在胃癌中的免疫阳性，图1的(E)部分和(F)部分表示在肠型胃癌和扩散型胃癌中的阴性免疫染色结果。图2表示GKNl蛋白质的甲基化状态，图2的⑷部分表示在胃癌组织⑴和正常的胃黏膜(N)中对GKNl基因甲基化的DNA(M)和非甲基化的DNA⑶，图2的⑶表示在胃癌细胞株中对GKNl蛋白质基因甲基化的(M)DNA和非甲基化的(U)DNA。图3为表示在胃癌中与对照组相比较的(A)GKNl蛋白质DNA复制数量和⑶GKNl蛋白质mRNA表达的倍数变化的图表。图4分别表示在肠型⑴、扩散型⑶及混合型(M)胃癌组织⑴和正常胃黏膜(N)中的GKNl蛋白质的表达。图5的(A)部分表示利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)分析法，在转染GKNl蛋白质的胃癌细胞中随着时间经过而发生的细胞的生存能力，图5的(B)部分为表示利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)分析法，在转染GKNl蛋白质的胃癌细胞中随着时间经过而发生的细胞增殖的图表。图6表示通过 膜联蛋白V结合分析法来测定的在转染GKNl蛋白质后随着时间而发生的细胞凋亡。图7表示通过膜联蛋白V结合分析法来测定的在转染GKNl蛋白质24小时后经含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3 (caspase-3)抑制剂(Z_DEVD-fmk)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)抑制剂(Z_IETD-fmk)处理的细胞凋亡。图8的(A)部分表示通过执行蛋白印迹分析的与转染GKNl蛋白质24小时后的凋亡相关的蛋白质的活性，图8的(B)部分经过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抑制剂(Z-DEVD-fmk)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8抑制剂(Ζ-1ETD-fmk)的处理，由此通过执行蛋白印迹分析来表示对于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性抑制的结果。图9表示通过伤口 -治愈方法的GKNl蛋白质对细胞移动的效果,虚线表示缺损缺陷的界限。图10表示GKNl蛋白质在胃癌细胞株AGS中对transwell移动的效果，图10的(A)部分表示用Diff-Quik染色法对薄膜进行染色的结果，图10的(B)为在光学显微镜(lightmicroscopy)下计算细胞数量来表示的图表。图11为通过执行基质胶(matrigel)分析法来表示GKNl蛋白质对细胞扩散的效果，图11的(A)部分为拍摄转染24小时后通过基质被浸润的细胞的结果，图11的(B)部分为计算细胞数量来表示的图表。图12表示插入本发明的GKNl基因来制备的重组载体pcDNA3.1-GKNl载体的酶切图。
具体实施例方式本发明的特征在于，提供一种将GKNl蛋白质作为有效成分来含有的抗癌用组合物，更为具体地，本发明的特征在于，提供包含GKNl蛋白质或对GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸的抗癌用组合物。本发明者在为了开发能够抑制癌症产生的新的癌症治疗剂而进行研究的过程中，关注到作为最近从哺乳动物的胃黏膜细胞中分离的新的蛋白质的GKNl蛋白质。经发现，GKNl蛋白质又被称为胃窦黏膜蛋白-18 (AMP-18，antrum mucosalprotein-18)或胃癌相关分泌蛋白(CAll)，在胃窦进行表达，具有通过使受损后的恢复和增殖变得容易来促进治愈的活性(Toback.F.G.et al.,Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol, 285:G344-353, 2003)。但到目前为止，对于GKNl蛋白质所具有的其他功能几乎无从得知。为此，本发明者通过确认与正常细胞不同，在癌细胞中GKNl基因的表达被减少的事实，推测GKNl基因参与癌症的发病机理，并最初实质性地查明GKNl蛋白质具有抗癌活性的事实。首先，通过本发明的一实施例，确认了 GKNl基因的表达在癌细胞中减少或消失的事实，即，根据本发明的一实施例，通过免疫组织化学方法来调查了在胃癌组织中GKNl蛋白质的表达，在固定胃癌组织来制作切片之后，利用GKNl蛋白质抗体、生物素标记的羊抗小鼠(biotinylated goat ant1-mouse)抗体来进行了检测，并与连接有过氧化物酶的亲和素-生物素复合体进行培养后，将二氨基联苯胺用作色原体，载玻片利用迈耶苏木精溶液进行对比染色来分析表达的结果，在胃窦(antrum)和胃体(corpus)的正常胃黏膜细胞细胞质中表现出免疫阳性，并观察到在胃腺瘤(adenomas)和癌(carcinomas)组织中GKNl蛋白质的表达减少或消失(参照图1及表I)。并且，根据本发明的 再一实施例，对从冰冻胃癌试样提取的GKNl基因组DNA和mRNA定量化,并在Stratagene Mx 3000P突光定量核酸扩增检测系统(QPCR, QuantitativePCR Detecting System)中执行了 real time SYBR Green QPCR 的结果，GKNl 蛋白质的复制数量与正常胃黏膜组织DNA相比，在胃癌DNA中减少了 50 %以上，GKNl蛋白质mRNA表达数值在正常胃黏膜组织中表达GKNl基因转录体，相反，在所有的胃癌组织，表达减少或消失(参照图3)。基于这种结果，本发明者在本发明的GKNl基因可具有抗癌活性的推测下，在癌细胞中对GKNl基因进行过度表达的情况下，调查了对癌细胞的细胞增殖和细胞凋亡产生的影响，即，根据本发明的一实施例，随着时间的经过对转染到癌细胞株AGS的GKNl蛋白质执行3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴盐(MTT)分析和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)结合分析的结果，在转染的细胞中，细胞的生存能力和细胞增殖明显被抑制(参照图5),对异硫氰酸突光素(FITC, Fluorescein Isothiocyanate)-标记的膜联蛋白(annexin)V细胞进行染色的结果，在转染GKNl蛋白质的细胞中，凋亡细胞随着时间的经过而增加(参照图6)。因此，本发明的GKNl蛋白质具有抑制癌细胞的增殖、诱发癌细胞凋亡的特征。并且，根据本发明的再一实施例，在试管中(in vitro)执行伤口-治愈、transwell趋化性试验(chemotaxis)、浸润检测的结果,与转染GKNl蛋白质的表达载体的AGS细胞相比，没有插入GKNl基因的对照组表达载体和转染到GKNl蛋白质siRNA的细胞在转染后明显向伤口部位移动(参照图9)，转染GKNl蛋白质的AGS细胞的移动减少(参照图10)，在GKNl蛋白质被过度表达的AGS细胞中，浸润明显被抑制(参照图11)。因此，通过上述结果，本发明者能够得知GKNl蛋白质通过阻止癌细胞的移动来抑制上皮细胞转换为间质细胞，在过度表达时，也能够在胃癌细胞株中抑制浸润的事实。因而，本发明能够提供包含GKNl蛋白质或对GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸的抗癌用组合物。优选地，上述GKNl蛋白质可以是具有以序列第I位记载的氨基酸序列的蛋白质，对上述GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸可以是具有以序列第2位记载的碱基序列的多核苷酸。并且，优选地，本发明的上述GKNl蛋白质可以是对于具有序列第I位的氨基酸序列的多肽的功能性对等物。所谓上述“功能性对等物”是指，附加、取代或缺失氨基酸的结果，具有与以序列第I位来表示的氨 基酸序列至少60%的序列相同性，优选地具有70%的序列相同性，更为优选地具有80%以上的序列相同性，并实质上表现出与本发明的GKNl蛋白质同种类活性的多肽。在这里，“实质上同种类的活性”意味着上述中所记载的GKNl蛋白质的活性。上述功能性对等物，例如可包括，在本发明的GKNl蛋白质的氨基酸序列的氨基酸中，一部分被置换或缺失，或者添加的氨基酸序列变形体。优选地，氨基酸的置换可以是保存性置换，自然中存在的氨基酸的保存性置换的例如下:脂肪族氨基酸(甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro)、疏水氨基酸(异亮氨酸lie、亮氨酸Leu、缬氨酸Val)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr、色氨酸Trp)、酸性氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)、碱性氨基酸(组氨酸His、赖氨酸Lys、精氨酸Arg、谷氨酰胺Gin、天冬酰胺Asn)以及含硫氨基酸(胱氨酸Cys、蛋氨酸Met)。优选地，氨基酸的缺失可位于不直接干预本发明的GKNl蛋白质的活性的部分。并且，上述功能性对等物的范围里还可包括在维持GKNl蛋白质的基本骨架及其生理活性的同时，多肽的一部分化学结构变形的多肽衍生物。例如，可包括在维持用于改变本发明的多肽的稳定性、储存性、挥发性或溶解度等的结构变形及生理活性的同时，通过与其他蛋白质融合来制成的融合蛋白质等。并且，可通过公知的方法向质粒或病毒载体等的表达载体内导入对上述GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸后，以本领域公知的多种方法，通过转导(transduction)或转染(transfection)以表达型向祀细胞导入上述表达载体。质粒表达载体为能够用于人体的得到食品和药物管理局(FDA)的认可的基因传递方法，并且作为直接向人体细胞传递质粒DNA的方法(诺贝尔，如等人，科学，249:1285-1288,1990, Nabel, E.G.et al.，Science, 249:1285-1288，1990)，质粒 DNA 与病毒载体不同，具有能够被均匀纯化的优点。作为能够在本发明中使用的质粒表达载体可以使用在本领域公知的哺乳动物表达质粒，在本发明的一实施例中，通过使用pcDNA3.1(美国英杰生命技术有限公司=Invitrogen)质粒来制备了作为插入有GKNl基因的具有如图12的酶切图的重组表达载体的pcDNA3.1-GKNl蛋白质。虽然并不限定于此,但能够通过本领域公知的方法,例如，瞬时转染(transienttransfection)、微量注射、转导(transduction)、细胞融合、磷酸|丐沉淀法、脂质体介导转染(liposome-mediated transfection)、DEAE 葡聚糖介导转染(DEAE Dextran-mediatedtransfection)、聚凝胺介导转染(polybrene-mediated transfection)、电穿孔法(electropora tion)、基因枪(gene gun)以及用于使DNA向细胞内流入的其他公知的方法来向肿瘤细胞内导入包含本发明的核酸的质粒表达载体(plasmid expression vector)(ffu.et al.，J.Bi0.Chem.，267:963-967,1992 ；ffu.et al.，Bi0.Chem.，263: 14621-14624，1988)。优选地，能够使用瞬时转染方法。并且，能够表达上述GKNl蛋白质的载体可通过公知的方法来向细胞、组织或体内给药，例如，局部性地，通过非口服、口服、鼻腔、静脉、肌肉内、皮下内或其他适当的方法来给药。尤其，上述载体能够以用于治疗靶组织的肿瘤细胞的有效量来直接向癌或肿瘤细胞内注射。尤其，对于存在于眼睛、胃肠管、泌尿生殖器官、肺以及支气管系统等的体腔(bodycavity)内的癌或肿瘤，能够利用针、导管(catheter)或其他种类的输送管能够向受癌或肿瘤的影响的中空器官(hollow organ)直接注射本发明的药学组合物。另一方面，由于本发明的GKNl蛋白质具有抑制癌细胞的增殖、促进细胞凋亡的同时抑制癌细胞的转移及浸润的活性，因而本发明能够提供利用上述基因的抗癌剂筛选方法。即，本发 明的抗癌剂筛选方法可包括如下步骤:步骤(a)，培养GKNl蛋白质或表达上述蛋白质的重组细胞和候选物质；以及步骤(b)，测定GKNl蛋白质的活性或对细胞内表达水平的增加所产生的效果。在上述中，GKNl蛋白质的细胞内水平增加意味着通过GKNl基因的表达增加或GKNl蛋白质的分解被抑制，从而使得GKNl蛋白质的浓度增加。上述GKNl基因表达包括GKNl基因的转录及向蛋白质的翻译过程。因此，当上述候选物质在细胞内使GKNl基因的表达及蛋白质的水平增加时，可将上述候选物质判断为具有抗癌活性的物质。并且，测定GKNl蛋白质的蛋白质活性及细胞内的水平的方法可使用在本领域公知的多种方法，例如，虽然并不限定于此，但可包括免疫共沉淀法(coimmunoprecipitation)、酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbentassay)、放射免疫分析法(RIA)、免疫组织化学、蛋白质印迹法(Western Blotting)以及荧光激活细胞分拣术(FACS)。并且，以本发明的GKNl作为靶的筛选方法可以适用高通量筛选方法(highthroughput screening ;HTS)。高通量筛选方法是通过同时对多个候选物质进行试验来对多个候选物质的生物学活性同时或几乎同时进行筛选的方法。作为特定实施方式，在96-孔微滴定板或192-孔微滴定板中培养细胞株，并从中处理多个候选物质之后能够通过免疫化学方法来测定GKNl的表达程度。上述孔典型地需要达到50 μ I至500 μ I的检测容积，除了微滴定板之外，为了使96孔的形式符合广泛的均相及非均相检测，从商业上可利用多个仪器、器具、移液器、机器人、平皿清洁器以及平皿阅读器。并且，本发明的抗癌组合物可用作能够预防及治疗癌症的药学组合物，上述药学组合物还可包含在药学上接受的担体。在上述中“药学上接受”是指在生理学上接受的，并在给药到人体时，通常不会引起胃肠障碍、眩晕等的过敏反应或与此类似的反应的组合物。作为药学上接受的载体，例如有乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等的口服给药用担体以及水、适当的油、生理盐水、水溶性葡萄糖及乙二醇等的非口服给药用担体等，还可包含稳定剂及保存剂。适当的稳定剂有亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸等的抗氧化齐U。适当的保存剂有苯扎氯铵、甲基-或羟苯丙酯以及氯丁醇。除此之外的作为在药学上接受的载体，可参考以下文献(Remington, s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., MackPublishing Company,Easton,PA, 1995)。本发明的药学组合物能够与如上所述的在药学上接受的担体一同根据本领域公知的方法来以适当的形态进行剂型化。即，本发明的药学组合物能够根掘公知的方法来制备成多种非口服或口服给药用形态，具有代表性的非口服给药用剂型是注射用剂型，优选为等渗性水溶液或悬浮液。注射用剂型可通过使用适当的分散剂或润湿剂以及悬浮剂，并根据本领域公知的技术制备而成。例如，将各成分溶解于生理盐水或缓冲液来剂型化为注射用剂型。并且，口服给药用剂型虽然不限定于此，但有粉末、颗粒、片剂、丸药以及胶囊等。用如上所述的方法来剂型化的药学组合物能够以有效量通过包括口服、经皮肤、皮下、静脉或肌肉等的多种途径来给药。上述中的“有效量”为，向患者给药时能够表现出预防或治疗效果的量。本发明的药学组合物的给药量可根据给药路径、给药对象、年龄、性别、体重、个体差异及病态来适当选择。优选地，本发明的药学组合物可根据疾病的程度来使有效成分的含量不同，优选地，以I 10000 μ g/体重kg/day的有效量、更为优选地，以10 IOOOmg/体重kg/day的有效量一天多次反复给药。并且,本发明的抗癌用组合物也能够与具有预防、改善或治疗癌症的效果的公知的化合物一同进行给药。以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅仅用于更具体地说明本发明，本发明的范围并不受限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。实施例1插入有GKNl的重组载体的制备及向胃癌细胞的转化为了向作为胃癌细胞株的AGS转染GKNl，首先将胃癌细胞株AGS与被热惰性化的10%的胎牛血清一同在37°C下，在5%的CO2的RPM1-1640培养基进行培养，由此进行准备。随后，利用聚合酶链式反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)对GKNl的cDNA进行扩增，并利用限制酶位点(使用EcoR I和BamH `I)来制备在pcDNA3.1 (英杰公司，卡尔斯巴德，力口利福尼亚州，美国:Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)具有图12的酶切图的pcDNA3.1-GKNl重组载体后，在大肠杆菌(Escherchia coli)DH5a水溶性细胞(competent cell)进行了转化。转化的细胞在包含有氨苄西林的LB琼脂(LB agar)固体培养基进行培养后，从细胞群中制作要培养的种子(culture seed)进行大量培养，并且从培养液中收集细胞来纯化DNA，并制备了 pcDNA3.1-GKNl载体。而且，在直径为60mm的培养皿中利用脂质体加转染试剂(Lipofectamine Plus Transfection Reagent,英杰公司，Invitrogen)来将表达载体(共5 μ g的DNA)转染到所培养的AGS细胞。实施例2通过免疫组织化学的GKNl的表达模式分析为了进行免疫组织化学性分析，用甲醛水溶液进行固定后，以含有经石蜡处理的169个胃癌组织试样的方式设计了组织微阵列受体块。从各癌中以直径为2mm取3个组织核，利用市场上销售的微阵列仪器(Beecher Instruments公司，微阵列技术,银泉,马里兰州，美国，Beecher Instruments, Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD, USA)向新的受体石蜡块移动，也将一个位于各肿瘤附近的正常胃黏膜的腔体移动至受体块。所有试样均在使用前一天切割为2 μ m的切片，并按照标准实验方案来进行保管。并且为了将免疫组织化学信号最大化，均使用了在柠檬酸盐缓冲液中抗原修复的方法和利用生物素标记的酪胺(biotinylated tyramide)来扩增信号的方法,具体地，由热诱发的表位(epitope)修复方法为，在装满lOmmol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的玻片染色缸(Coplin)容器中浸泡载玻片，在700W微波的压力锅(北欧洁具，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国，NordicWare, MinneapoI is, MN, USA)中煮沸30分钟缓冲液后，经20分钟使玻片染色缸变凉。而且，使用了含有链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)和生物素标记的酪胺(biotinylated tyramide)的 Renaissance TSA 间接试剂盒(Indirect Kit)(新生命科学，波士顿，美国，NEN Life Science, Boston, A, USA)，首先用磷酸盐缓冲液(PBS,phosphate-buffered saline)冲洗载玻片之后，为了去除内源性过氧化物酶(endogenousperoxidase)活性，浸泡于用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的I %的H2O2并在常温下进行15分钟处理。之后，用三硝基甲苯(TNT,Trinitrotoluene)缓冲液(0.lmol/L的三轻甲基氨基甲烧盐酸盐(Tris-HCl)、pH 为 7.4、0.15mol/L 的氯化钠(NaCl)、0.05% 的吐温 20 (Tween20))清洗20分钟载玻片后,进行了三硝基苯(TNB, Trinitrobenzene)缓冲液(0.lmol/L的三轻甲基氨基甲烧盐酸盐、pH为7.4、0.15mol/L的氯化钠、0.5%的阻断剂(blocking reagent))处理。之后将切片与GKNl抗体(1/100;西格玛奥德里奇有限公司，圣路易斯，密苏里州，美国，Sigma-Aldrich Co，St.Louis, MO, USA) 一同在4°C下整夜进行培养，并利用生物素标记的羊抗小鼠(biotinylated goat ant1-mouse)抗体(Sigma公司，圣路易斯,密苏里州，美国，Sigma, St.Louis, MO, USA)进行检测后，与连接有过氧化物酶的亲和素-生物素复合体一同进行培养。将二氨基联苯用作色原体，用迈耶苏木精对载玻片进行对比染色。抗原染色结果分析中，将细胞质的30%以上染色为阳性时视作阳性，并由两名病理学家独立完成了检查。将用非免疫血清代替一级抗体的作为阴性对照组。表I
权利要求
1.一种抗癌用组合物，其特征在于，包含GKNl蛋白质或对GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的抗癌用组合物，其特征在于，上述GKNl蛋白质包含序列第I位的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗癌用组合物，其特征在于，对上述GKNl蛋白质进行编码的多核苷酸包含序列第2位的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的抗癌用组合物，其特征在于，上述多核苷酸包含于表达载体内。
5.根据权利要求4所述的抗癌用组合物，其特征在于，上述表达载体为具有图12的酶切图的 pcDNA3.1-GKNl。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗癌用组合物，其特征在于，上述癌为胃癌。
7.一种抗癌剂筛选方法，其特征在于，包括如下步骤: 培养GKNl蛋白质或表达上述GKNl蛋白质的重组细胞和候选物质的步骤；以及 测定GKNl蛋白质的活性或对细胞内表达水平的增加所产生的效果的步骤。
8.根据权利要求7所述的抗癌剂筛选方法，其特征在于，还包括如下步骤:在上述候选物质增加GKNl蛋白质的活性或在细胞中增加GKNl基因的表达水平的情况下，将优选物质判断为具有抗癌活性的抗癌剂的步骤。
9.根据权利要求8所 述的抗癌剂筛选方法，其特征在于，上述GKNl蛋白质的活性或细胞内表达水平通过选自由免疫共沉淀法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法、免疫组织化学、蛋白质印迹法以及荧光激活细胞分拣法组成的组中的某一种方法来执行。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的抗癌剂筛选方法，其特征在于，上述抗癌剂能够预防或治疗胃癌。
全文摘要
本发明涉及将GKN1作为有效成分来含有的抗癌用组合物，更为具体地涉及包含抗癌活性优秀的GKN1基因的表达载体或将GKN1蛋白质作为有效成分来含有的抗癌用组合物。由于本发明的GKN1具有不仅抑制癌细胞产生的活性优秀，而且在过度表达时抑制癌细胞转移的活性也优秀的特征，因而具有能够有效用作抗癌治疗用组合物的效果。
文档编号A61K38/16GK103209702SQ201180054619
公开日2013年7月17日 申请日期2011年11月11日 优先权日2010年11月12日
发明者朴元相, 尹晶桓 申请人:加图立大学校产学协力团