淫羊藿素在制备抗nk/t细胞淋巴瘤药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属中药领域，涉及中药有效成分淫羊藿素新的药用用途，具体涉及淫羊藿 素在制备抗NK/T细胞淋巴瘤药物中的用途。
【背景技术】
[0002] NK/T细胞淋巴瘤是一种高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤，主要发生于淋巴结外的组 织。该疾患早期临床表现不典型，病程进展迅速，预后较差，目前临床无特效化疗药物。研 究显示，NK/T细胞淋巴瘤其发病与EB病毒（EBV)感染关系密切，EBV在肿瘤细胞中是潜伏 感染，因此，为抗病毒治疗带来困难。有研究将EBV诱导进入裂解感染（活化）再联合抗病 毒药物更昔洛韦（GCV)靶向抗病毒治疗EBV相关肿瘤。为相关领域提供从天然药物中筛选 活性成分诱导EBV激活NK/T细胞淋巴瘤靶向治疗的新方向。
[0003] 淫羊藿素是淫羊藿属植物提取物淫羊藿苷的水解衍生产物，其化学结构式如下：
[0004]
[0005]淫羊藿素（Icaritin)
[0006]目前关于淫羊藿素在制备抗NK/T细胞淋巴瘤药物方面的用途尚未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供淫羊藿素的新的药用用途，具体涉及淫羊藿素在制备抗 NK/T细胞淋巴瘤药物中的应用。
[0008] 本发明的又一目的在于提供淫羊藿素在制备治疗NK/T细胞淋巴瘤曾敏药物中的 应用。
[0009] 本发明所述的淫羊藿素是淫羊藿属植物提取物淫羊藿苷的水解衍生产物，其化学 结构式如下：
[0010]
[0011] 淫羊藿素（Icaritin)
[0012] 本发明的目的通过以下技术方案实现，
[0013]采用淫羊藿素干预人NK/T细胞淋巴瘤细胞株（SNK-10、SNT-8)，结果显示：1.淫羊 藿素体外可显著抑制SNK-10和SNT-8细胞的增殖，明显促进其凋亡，增加内源性Caspase 蛋白和促凋亡蛋白Bax表达，抑制Bcl-2、pBad表达；2.淫羊藿素可诱导SNK-10细胞内EB 病毒（EBV)活化，进而增加肿瘤细胞对抗病毒药物更昔洛韦（GCV)的敏感性。
[0014] 本发明经实验证实单独应用淫羊藿素可抑制NK/T细胞淋巴瘤，而作为病毒激活 剂的淫羊藿素联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV)对NK/T细胞淋巴瘤具有更强的抗肿瘤作用。
[0015] 本发明的淫羊藿素可作为药物有效成分制备抗NK/T细胞淋巴瘤药物；或，所述的 的淫羊藿素可作为药物有效成分与药物学上可接受的载体制备抗NK/T细胞淋巴瘤的药物 组合物；
[0016] 更进一步的，本发明淫羊藿素与抗病毒药物制备抗NK/T细胞淋巴瘤增敏药物，本 发明的实施例中，优选淫羊藿素作为药物有效成分与抗病毒药物更昔洛韦（GCV)制备抗 NK/T细胞淋巴瘤增敏药物；所述的淫羊藿素可通过激活NK/T细胞淋巴瘤内潜伏感染的EB 病毒，增加NK/T细胞淋巴瘤对抗病毒药物的敏感性。
【附图说明】
[0017] 图1:淫羊藿素对两种NK/T细胞淋巴瘤细胞株细胞增殖的影响，
[0018] 其中：MFI为平均荧光强度；图IA为CCK-8法检测各浓度淫羊藿素对SNK-10和 SNT-8细胞活力的影响；图IB为CFDASE染色法检测淫羊藿素处理两株细胞48h对细胞增 殖的影响，细胞MFI值越高细胞增殖速度越慢；与对照组相比，*P〈0. 05, #P〈0. 01;各组实验 重复3遍以上。
[0019] 图2:淫羊藿素对SNK-10和SNT-8细胞凋亡的影响，
[0020] 其中：图2A为AnnexinV/PI双染法流式检测细胞凋亡率，淫羊藿素干预时间为 48h，与对照组相比，*P〈0. 05/P〈0. 01;图2B为Hoechst33258染色法示细胞凋亡形态改变， 药物处理组细胞核出现核固缩、核断裂和浓染白色荧光等典型凋亡形态改变，淫羊藿素干 预时间为48h。
[0021] 图3 :淫羊藿素对NK/T细胞淋巴瘤细胞株CaspaSe、Bcl-2家族蛋白表达的影响，
[0022] 其中：检测方法为Westernblot，淫羊藿素干预时间为48h。
[0023] 图4:淫羊藿素对SNK-10细胞内EBV相关基因表达的影响，
[0024] 其中：检测方法为Real-timePCR，淫羊藿素干预时间为48h，与对照组相比， *P〈0. 05, #P〈0. 01;实验重复3遍以上。
[0025] 图5:淫羊藿素对Zta蛋白表达的影响，
[0026] 其中：检测方法为Westernblot，淫羊藿素干预时间为48h。
[0027] 图6 :淫羊藿素增加SNK-10细胞对GCV的敏感性，
[0028] 其中：AnnexinV/PI双染法流式检测细胞凋亡率，淫羊藿素干预时间为48h，与对 照组相比，*P〈0.05，#P〈0.01。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1:淫羊藿素抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡试验
[0030] 一、材料与方法
[0031] 1.细胞株，采用研究NK/T细胞淋巴瘤常用的细胞系：本实施例的人NK/T细胞淋 巴瘤细胞株SNK-10和SNT-8购自日本东京医科齿科大学，均为EB病毒阳性，所述细胞株用 含有10%灭活人血清及7001]/1111几-2的？1?頂-1640培养基在371：、体积分数为5%〇) 2、完 全饱和湿度条件下常规培养，2~3天传代1次，实验选用对数生长期细胞；
[0032] 2?细胞活力的检测
[0033]分别调整SNK-10和SNT-8细胞株细胞悬液浓度为IXIO5Ail，加入96孔培养板 内，每孔100ill，分别加入等体积不同浓度淫羊藿素（SNK-10细胞所用药物浓度为50ilM， 30iiM，20iiM，10iiM;SNT-8 细胞所用药物浓度为 3211]?、1611]\1、811]\1、411]\1)，设空白对照组 和调零组，每组均设3复孔，分别培养24h、48h、72h。每孔加入10iiLCCK-8溶液，置37°C、 5 %CO2孵箱培养4h，在490nm处检测各孔的吸光值；细胞活力=(加药组OD平均值-调 零孔OD平均值）八空白对照组00平均值-调零孔00平均值）乂100%。实验重复3遍以 上；
[0034] 2.细胞增殖的检测
[0035] 取SNK-10细胞4XIO6个（或SNT-8细胞5XIO6个），用ImlCFDASE细胞标记液 重悬细胞，置于15ml离心管内。加入ImlCFDASE储存液（2X)，轻轻混匀，37°C孵育10分钟， 加入约IOml完全细胞培养基洗涤2次，再加入8ml完全细胞培养液，37°C孵育5分钟，以促 进CFDASE在细胞内的驻留及未反应的CFDASE进入完全细胞培养液；1000 rpmX5min离心 去上清，完成最后一次洗涤，用IOml完全培养基重悬细胞，混匀，将细胞接种于6孔板，每孔 2ml，SNK-10细胞密度为4XIO5Ail，SNT-8细胞密度为5XIO5Ail;细胞培养孔中分别加入等 体积不同浓度淫羊藿素，SNK-10细胞培养孔中淫羊藿素终浓度分别为0iiM、10iiM、20iiM、 30iiM、50iiM，SNT-8细胞培养孔内淫羊藿素终浓度分别为0iiM、4iiM、8iiM、16iiM、32iiM， 置于CO2孵育箱培养48h，PBS洗涤一次后用流式细胞仪检测CFSE荧光，每组实验重复3次， 计算均数土标准差；
[0036] 3.细胞凋亡检测
[0037] 调整SNK-10细胞悬液浓度为4XIO5Ail(SNT-8细胞浓度为5XIO5Ail)，将细胞 接种于6孔板，每孔2ml，分别加入等体积不同浓度淫羊藿素（药物浓度同上），置于37°C、 5%CO2孵育箱中培养48h后，收集细胞300gX5min、4°C离心去上清，用冷PBS洗涤细胞两 次（300gX5min、4°C离心收集细胞沉淀），用400iiLIXAnnexinV结合液悬浮细胞，调整细 胞浓度约为IXIOfVml，在细胞悬液中加入2. 5iiLAnnexinV染色液，轻轻混匀后4°C避光孵 育15min，再加入5iiLPI染色液，轻轻混匀后于4°C避光孵育5min，立即用流式细胞仪检测 细胞凋亡率；
[0038] 4?细胞凋亡形态检测
[0039]调整SNK-10细胞悬液浓度为4XIO5Ail(SNT-8细胞浓度为5XIO5Ail)，将细胞 接种于6孔板，每孔2ml，分别加入等体积不同浓度淫羊藿素（药物浓度同前），置于37°C、 5%CO2孵育箱中培养48h后，收集细胞1000 rpmX5min离心去上清，加入0. 5ml固定液，置 于4°C冰箱固定lOmin，1000 rpmX5min离心去固定液,用PBS洗两遍，1000 rpmX5min离心 后吸去大部分液体保留约50iiL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布 均匀，稍晾干后均匀滴上〇. 5mlHoechst33258染色液,染色5分钟,微晾干后去染色液,用 PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖 玻片，用荧光显微镜检测细胞核形态；
[0040] 4.Caspase、Bc