一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，属于细胞遗传及分子生物技术领域。
【背景技术】
[0002]胞质阻断基因组损伤分析(cytokinesis-blockgenomic damage assay，CBGD)是一种可同时评价基因组损伤、细胞周期停滞、细胞死亡的综合试验体系，包括染色体断裂、DNA错配修复、染色体丢失、染色体不分离、细胞坏死、凋亡以及细胞淤积，它比单纯的微核分析更加全面、系统。其原理是利用细胞松弛素B(cytochalasin B，CB)进入细胞后在不影响细胞核分裂(karyokinesis)的同时阻断胞质分裂(cytokinesis)，从而形成双核细胞(binucleated cell，BNC)(见图1 CB⑶分析中各指标显微图，A)。CB⑶分析评价基因组损伤的优点在于单次分裂后的细胞被CB诱导成BNC，从而可同时检测出染色体数量以及结构的变异。因此，细胞核内未被修复的遗传损伤被完整地保留在了 BNC中，表现为三类不同的遗传损伤端点:微核(MN)(图LB)、核质桥(NPB)(图LD)和核芽(NBud)(图1，C);另外，在基因组损伤严重的细胞中会同时存在多个端点，如单个BNC同时含有丽和NPB(图1，E)或 MN 和 NBucK 图 1，F)。
[0003]MN通常形成于染色体断片或整条染色体在细胞分裂中期的滞后，染色体上因DNA双链断裂或者因单链断裂而在复制过程中引发的双链断裂会使断裂的无着丝粒染色体片段形成MN。而染色体着丝粒上的卫星DNA缺失或低甲基化以及细胞周期调控基因的突变或缺失都有可能导致整条染色在有丝分裂后期分离过程中发生滞后，最后形成MN。
[0004]当两个断裂染色体被错配修复而融合在一起，或是因染色体末端的端粒危机(端粒过度缩短、端粒加帽蛋白丢失或是端粒凝集缺陷)而发生完整染色体末端融合会形成双着丝粒染色体，双着丝粒染色体上的两个着丝粒在有丝分裂后期被纺锤丝反方向牵引、拉伸形成NPB。因此，NPB是染色体重排和端粒异常的指示端点。此外，某些基因突变可导致姐妹染色单体之间发生交联，使得交联的姐妹染色单体在后期无法正常分离而被拉伸形成NPB0
[0005]NBud与MN在外观上很相似，以一种柄状染色质结构与细胞内的主核相连接。基因异常扩增的DNA序列会被出芽的方式排挤出主核，因此NBud是形成微核的中间态，核出芽过程是细胞排除过多的扩增DNA的一种机制，因此核芽是基因扩增的生物标记。MN、NPB和NBud看似相互独立，分别代表不同遗传损伤的端点，但是这三者的形成彼此之间存在一定关联，共同反应了基因组的损伤状况。
[0006]基因组损伤是众多人类遗传-环境疾病的基础诱因，与出生缺陷、免疫系统缺陷、退行性疾病如老年性痴呆、帕金森氏病、高血压、心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、肿瘤等疾病密切相关。当个体暴露于遗传毒性物质或微营养物质的摄入不足都可能造成遗传损伤，通过CBGD分析检测人外周血淋巴细胞中的遗传损伤是一种较好的分析人活体中遗传损伤，进而评估基因组稳定性的方法。
[0007]现有技术多为检测个体是否携带与某疾病相关的基因，如单基因病多为检测某个相关基因，多基因病通常检测一系列相关基因，通过检测只是让个体有知情权，了解个体的患病风险高低，并不能作出改变或校正。而本技术是对个体整个基因组健康状况的检测，并在了解个体遗传损伤状况的基础上，可以通过营养干预、调整饮食和生活方式，使遗传损伤较高的个体得到校正，改善其基因组的稳定性，同时降低相关疾病，特别是退行性疾病的患病风险，目前在国内还没有相关技术。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，进而消减遗传-环境相关疾病风险的目标。
[0009]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0010]一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，包括如下步骤:
[0011]1.取血:用抗凝管(肝素或EDTA)通过静脉穿刺取外周血4ml用于淋巴细胞的分离；
[0012]2.淋巴细胞培养基配置:20ml的RPMI1640培养基中含有10% 2ml胎牛血清FBS，200 μ I浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200 μ I浓度为10mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，按培养的要求准备少量的培养基，培养基可以在4°C储存一个星期，超过一周的培养基不能再继续使用，需重新配置；
[0013]3.淋巴细胞的分离和计数(约需要3小时):
[0014]S1、将全血与Hank’s平衡盐溶液HBSS以1:1的比例稀释，温度为20?22°C，并轻轻地颠倒混匀；
[0015]S2、轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液:稀释血液的比值为1:3，小心不要破坏分离界面；
[0016]S3、称量使离心管平衡，于18?20°C以400g离心30分钟；
[0017]S4、淋巴细胞层位于淋巴细胞分离液与稀释的血浆的界面之间，用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液；
[0018]S5、得到的淋巴细胞悬浮液为淋巴细胞和单核细胞的混合物，加入其体积3倍的HBSS,于室温20?22°C时轻轻混匀，180g离心10分钟；
[0019]S6、弃上清，用巴斯德移液管加入2ml HBSS，重新悬浮呈淡米色细胞球状面，于18?20°C以10g离心10分钟；
[0020]S7、弃上清，于室温加入200 μ I培养基，轻轻悬浮细胞；
[0021]S8、用血球计数板进行细胞计数；
[0022]4.淋巴细胞培养(约需要44h):
[0023]S9、调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为I X 106/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750 μ I ；
[0024]S10、加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20 μ I质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750 μ I的培养液中，若细胞数量较少可以适当的提高PHA的量；
[0025]SI 1、剩的体积补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；
[0026]S12、细胞在37°C温育，盖子扎松，在湿润并含有5% CO2的环境中培养44h以上，细胞松弛素B(CB)必须在加入PHA44小时以后加入；
[0027]S13、第二天观察细胞管，正常情况下细胞已经开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，第一天培养体积少的可以根据生长状况补一定的培养基，通常补到终体积为800 μ I ;
[0028]5.加CB到培养基中(约需要28h):
[0029]S14、解冻装有10yl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600 μ g/ml ；
[0030]S15、将置于室温的900 μ I培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60 μ g/ml 的 CB 溶液 1000 μ I ；
[0031]S16、从步骤S13制备的800 μ I培养物的顶层取出60 μ I培养基，加入60 μ I质量浓度60 μ g/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5 μ g/ml ；
[0032]S17、将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；
[0033]6.通过细胞离心收集细胞(约需要30分钟)
[0034]S18、准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，淋巴细胞是在圆底试管中进行培养，由于细胞易于沉于培养瓶底部，则只须根据细胞浓度丢弃一定量的表面培养物质，如:从培养物中约取出400 μ I，剩下400 μ I，加7.5 %的DMSO 30 μ I，处理8?1min ；
[0035]S19、迅速将80 μ I细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中，根据培养物中的细胞浓度和用于涂片的最佳细胞密度，这些都取决于试验和误差，所需的量可能还需要做轻微调整；
[0036]S20、重新放置转子上的盖子，按压中间的按钮以锁定，放置细胞离心机中的转子并使主要的盖子闭锁发出喀哒声，按照厂家的推荐设置时间和速度参数进行涂片；
[0037]7.细胞的干燥、固定和染色及片子的准备(约需要30分钟):
[0038]S21、拆除每个片子固定器，小心不要抹掉片子上的斑点，将滤纸丢进生物危害箱内，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干，不要直接加热使杯子干燥；
[0039]S22、将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干10分钟，片子风干的时间不要超过10分钟，否则细胞和核的形态改变将难以对片子进行计数；
[0040]S23、按照3:1的比例配置甲醇:冰醋酸固定液，固定