于计数微核的双核细胞应具备以下特征:
[0173](I)细胞有两个核；
[0174](2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；
[0175](3) BNC中的两个核大小、染色模式和深度应大概一致；
[0176](4) BNC中的两个主核可以接触，但一般不应相互重叠，如果BNC中的两个核相互重叠，但可以清晰地判断边界，也可以计入；
[0177](5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。
[0178]双核细胞中微核的计数标准:
[0179]MN在形态上与主核相似但是比主核小，他们具有以下特征:
[0180](I)人类淋巴细胞中的丽直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256 到 1/9 ；
[0181](2)MN是没有折射的，因此它们能与染料颗粒区别开来；
[0182](3)MN与主核是不连接的；
[0183](4)MN可能与主核接触，但不重叠，微核的边界应与主核边界能清晰区分；
[0184](5)MN通常与主核的染色深度一致，但偶尔也会比主核深。
[0185]双核细胞中核质桥的计数标准:
[0186]计数的NPB应具备下特征:
[0187](I)NPB的宽度可能变化比较大，但一般不超过所在细胞主核的1/4 ;
[0188](2) NPB应与主核的染色深度一致；
[0189](3)少数情况下，一个BNC中会出现多个NPB ；
[0190](4) 一个含有NPB的BNC可能还有一个或多个丽。
[0191]双核细胞中核芽的计数标准:
[0192]计数的NBud应具备以下特征:
[0193](I)NBud在外形上与MN —致，但其有一个细小的桥与主核相连；
[0194](2) NBud通常与MN的染色深度一致；
[0195](3)偶尔的，NBud会出在一个空泡里，并与主核相邻；
[0196]9.胞质阻断基因组损伤测评分析:
[0197]通过计数，对个体淋巴细胞中的微核MN、核质桥NPB以及核芽NBud的出现频率进行测评为基础，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，减少遗传-环境相关疾病风险的目标。
[0198]实施例3
[0199]1.取血:用抗凝管(肝素或EDTA)通过静脉穿刺取外周血4ml用于淋巴细胞的分离；
[0200]2.淋巴细胞培养基配置:在20ml的RPMI1640培养基中加入2ml 10%胎牛血清FBS, 200 μ I浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200 μ I浓度为10mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，按培养的要求准备少量的培养基，培养基可以在4°C储存一个星期，超过一周的培养基不能再继续使用，需重新配置；
[0201]3.淋巴细胞的分离和计数(约需要3小时):
[0202]S1、将全血与Hank’s平衡盐溶液HBSS以1:1的比例稀释，温度为21°C，并轻轻地颠倒混匀；
[0203]S2、轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液:稀释血液的比值为1:3，小心不要破坏分离界面；
[0204]S3、称量使离心管平衡，于19°C以400g离心30分钟；
[0205]S4、淋巴细胞层位于淋巴细胞分离液与稀释的血浆的界面之间，用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液；
[0206]S5、稀释淋巴细胞悬浮液，为淋巴细胞和单核细胞的混合物，加入其体积3倍的HBSS，于室温21°C时轻轻混匀，180g离心10分钟；
[0207]S6、弃上清，用巴斯德移液管加入2ml HBSS，重新悬浮呈淡米色细胞球状面，于
19。。以10g离心10分钟；
[0208]S7、弃上清，于室温加入200 μ I培养基，轻轻悬浮细胞；
[0209]S8、用血球计数板进行细胞计数；
[0210]4.淋巴细胞培养(约需要44h):
[0211]S9、调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为I X 106/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750 μ I ；
[0212]S10、加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20 μ I质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750 μ I的培养液中，若细胞数量较少可以适当的提高PHA的量；
[0213]SI 1、剩的体积补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；
[0214]S12、细胞在37°C温育，盖子扎松，在湿润并含有5% CO2的环境中培养44h以上，细胞松弛素B(CB)必须在加入PHA44小时以后加入；
[0215]S13、第二天观察细胞管，正常情况下细胞已经开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，第一天培养体积少的可以根据生长状况补一定的培养基，通常补到终体积为800 μ I ;
[0216]5.加CB到培养基中(约需要28h):
[0217]S14、解冻装有10yl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600 μ g/ml ；
[0218]S15、将置于室温的900 μ I培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60 μ g/ml 的 CB 溶液 1000 μ I ；
[0219]S16、从步骤S13制备的800 μ I培养物的顶层取出60 μ I培养基，加入60 μ I质量浓度60 μ g/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5 μ g/ml ；
[0220]S17、将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；
[0221]6.通过细胞离心收集细胞(约需要30分钟)
[0222]S18、准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，淋巴细胞是在圆底试管中进行培养，由于细胞易于沉于培养瓶底部，则只须根据细胞浓度丢弃一定量的表面培养物质，如:从培养物中约取出400 μ 1，剩下400 μ 1，加7.5%的DMSO 30 μ 1，处理9min ；
[0223]S19、迅速将80 μ I细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中，根据培养物中的细胞浓度和用于涂片的最佳细胞密度，这些都取决于试验和误差，所需的量可能还需要做轻微调整；
[0224]S20、重新放置转子上的盖子，按压中间的按钮以锁定，放置细胞离心机中的转子并使主要的盖子闭锁发出喀哒声，按照厂家的推荐设置时间和速度参数进行涂片；
[0225]7.细胞的干燥、固定和染色及片子的准备(约需要30分钟):
[0226]S21、拆除每个片子固定器，小心不要抹掉片子上的斑点，将滤纸丢进生物危害箱内，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干，不要直接加热使杯子干燥；
[0227]S22、将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干10分钟，片子风干的时间不要超过10分钟，否则细胞和核的形态改变将难以对片子进行计数；
[0228]S23、按照3:1的比例配置甲醇:冰醋酸固定液，固定lOmin，自然风干过夜；
[0229]S24、吉姆萨母液用pH为7.4、浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液按1:10稀释(通常取3ml的母液加30ml的磷酸缓冲液)，染色5min，蒸馏水水洗，干燥，要是颜色不深可以复染；
[0230]S25、用二甲苯透明处理5min，中性树脂封片；
[0231]8.计数:是在100X光学显微镜下，计数由CB诱导的1000个BNC中MN、NPB、NBud的数目，若一个BNC中出现多个遗传损伤指标应按出现个数计数，至少2人重复计数后误差在30%以内数据可用，每个个体各指标的频率以千分率计算(如:MN/1000BN)。
[0232]双核细胞计数标准:
[0233]用于计数微核的双核细胞应具备以下特征:
[0234](I)细胞有两个核；
[0235](2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；
[0236](3) BNC中的两个核大小、染色模式和深度应大概一致；
[0237](4) BNC中的两个主核可以接触，但一般不应相互重叠，如果BNC中的两个核相互重叠，但可以清晰地判断边界，也可以计入；
[0238](5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。
[0239]双核细胞中微核的计数标准:
[0240]MN在形态上与主核相似但是比主核小，他们具有以下特征:
[0241](I)人类淋巴细胞中的丽直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256 到 1/9 ；
[0242](2)MN是没有折射的，因此它们能