人外周血微泡中的mirna表达和其用图
【专利说明】人外周血微泡中的MIRNA表达和其用途
[0001] 本申请是申请号为200880114286. 9的中国专利申请的分案申请。
[0002] 优先权要求和关于联邦政府赞助的研宄的声明
[0003] 本申请要求2007年9月14日提交的美国临时专利申请60/993, 809和2008年5 月22日提交的美国临时专利申请61/055, 178的优先权，其通过引用完整地并入本文。本 发明并非由任何政府做出并且政府在本发明中没有权利。
[0004] 发明背景
[0005] 微RNAOniRNA或miR)是动物和植物中表达的小的非编码RNA。它们调节细胞功 能、细胞存活、细胞活化和发育期间的细胞分化。7 ;8
[0006] 微RNA是19-25个核苷酸RNA的小的非编码家族，其通过以序列特异性方式靶 向信使RNA(mRNA)，诱导翻译抑制或mRNA降解（取决于miRNA和它们的靶之间的互补程 度）来调苄基因表达（Bartel，D.P. (2004) Cell 116, 281-297 ;Ambros.V. (2004)Nature 431，350-355)。许多miR在序列上在远缘生物体之间是保守的，表明这些分子参与重要过 程。的确，miR参与发育期间基因表达的调节（Xu，P.等（2003)Curr. Biol. 13,790-795)，细 胞增殖（Xu，P.等（2003) Curn Biol. 13,790-795)，细胞凋亡（Cheng，A.M.等（2005)恥。1· Acids Res. 33, 1290-1297)，葡萄糖代谢（Poy，M.N.等（2004) Nature 432, 226-230)，压力 抗性（Dresios，J.等（2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,1865-1870)和癌症（Calin， G. A等（2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,1554-15529 ;Calin，G. Α·等（2004)Proc. Natl. Acad. Sci USAlOl，11755-11760 ;He，L.等（2005)Nature 435,828-833 ;和 Lu，J.等（2005) Nature 435:834-838)〇
[0007] 还有强有力的证据表明miR在哺乳动物造血中起作用。在小鼠中，miR-181、 miR-223和miR-142在造血组织中差异表达，并且它们的表达在造血和谱系定向（lineage commitment)期间被调节（Chen，C.Z·等（2004) Science 303,83_86)QmiR-181 在鼠造血祖 细胞中的异位表达导致B细胞区室中的增殖（Chen，C.Z.等（2004) Science 303,83-86)。 鼠造血系统的细胞中的系统性miR基因特征谱分析显示与神经元组织相比造血系统中不 同的miR表达模式，并且鉴定了在细胞分化期间发生的单独的miR表达变化（Monticelli， 5.等（2005)6611〇1116 8丨〇1(^7 6，1?71)。最近的研宄已经鉴定，111丨1?-221和111丨1?-222 在 CD34+脐血祖细胞的人红细胞生成培养物中下调（Felli，N.等（2005)Proc. Natl. Acad. Sci USA. 102,18081-18086)。已发现这些miR靶向癌基因 c-Kit。进一步的功能研宄表明这两 种miR在红细胞生成培养物中的下降在翻译水平上开启了 Kit蛋白产生，导致早期红系细 胞的扩增（Felli，N.等（2005)Proc. Natl. Acad. Sci USA. 102,18081-18086)。与 miR 调控 细胞分化的假说一致，发现miR-223是牵涉C/EBPa和NFI-A的调控回路（circuit)的关键 成员，其在全反视黄酸处理的急性早幼粒细胞性白血病细胞系中控制粒细胞的分化（Fazi， F.等（2005)Cell 123,819-831)。
[0008] 在B细胞慢性淋巴细胞性白血病中已鉴定到两种miR的频繁缺失和降低的表达9。 这些发现促进了很多的论文，其证明miR在头颈癌，小细胞肺癌，胶质母细胞瘤，乳腺癌，慢 性淋巴细胞性白血病和Burkitt淋巴瘤中异常表达942。最近，已经报道了巨噬细胞中炎症 和miR之间的关系。13
[0009] 为了检测此类病症，已获得组织样品以证实此类巨噬细胞的存在。另外，至今，一 直没有报道证明在血液中循环的微泡（microvesicle)包含miR。
[0010] 本发明的另外的优势，目的和特征将部分地在随后的说明书中阐明并且在检查下 列内容后对本领域技术人员来说将部分地变得显然，或可以从本发明的实践中认识到。如 附加的权利要求中特别指出的，可以实现和获得本发明的目的和优势。
[0011] 发明概述
[0012] 在一个方面中，提供了用于鉴定特定miR的方法，所述miR存在于微泡中，和/或 在组织、液体和/或细胞中具有改变的特定miR的表达水平。
[0013] 微泡促进细胞之间的联系。许多细胞（包括巨噬细胞、血小板、T-细胞和肿瘤）释 放包含核酸和/或蛋白的小的微泡1_5。包含在微泡内的因子调节血管发生、细胞生长和细 胞分化1:3。
[0014] 在另一个方面中，确定了 miR在液体例如患特定病症的患者的外周血中的存在。
[0015] 在另一个方面中，确定了 miR在患肺纤维化的患者的肺组织中的存在。
[0016] 在另一个方面中，本文提供了诊断或预测受试者（例如，人）中的特定病症的方 法。根据一种特定的方法，将来自受试者的受试样品中至少一种miR基因产物的水平与对 照样品中相应的miR基因产物的水平进行比较。相对于对照样品中相应的miR基因产物的 水平，受试样品中miR基因产物水平的变化（例如增加，减少）表示受试者患有急性炎性 病症，或者处于发生急性炎性病症的风险中。
[0017] 在一个实施方案中，来自受试者的受试样品中miR基因产物的水平大于对照的水 平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自本文所示的miRNA。
[0018] 在特定的实施方案中，被诊断或预测的病症是导致单核吞噬细胞和/或THP-I细 胞释放微泡的病症。
[0019] 在特定的实施方案中，被诊断或预测的病症是引起炎性应答的病症。
[0020] 在另一个实施方案中，本发明是治疗受试者（例如，人）的癌症和/或炎性病症的 方法。
[0021] 在一个特定的方法中，将有效量的用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合 物施用给受试者，所述miR基因产物选自表1-VI中的一个或多个组。
[0022] 在一个实施方案中，用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物抑制选自表 I-VI中的一个或多个组的miR基因产物的表达。
[0023] 本发明进一步提供了用于治疗癌症和/或炎性病症的药物组合物。在一个实施方 案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物和药学上可接受的载体。在 特定的实施方案中，所述至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物是特异的，所述miR 基因产物的表达，与正常相比，在来自患病的患者的血液中更高。
[0024] 在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种抗炎剂。
[0025] 在一个实施方案中，本发明是用于治疗与miR基因产物的过表达有关的癌症和/ 或与miR基因产物的过表达有关的肺部病症的药物组合物。此类药物组合物包括有效量的 至少一种miR基因产物和药学上可接受的载体，其中所述至少一种miR基因产物结合并且 减少所述miR基因产物的表达。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物包含与 所述miR-基因产物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述至少一 种miR基因产物是miR或其变体或生物学活性片段。在另一个实施方案中，药物组合物还 包含至少一种抗癌剂。
[0026] 根据下列优选实施方案的详细描述，当根据附图阅读时，本发明的各种目的和优 势对本领域技术人员来说将变得显然。
[0027] 附图简述
[0028] 图1显示来自巨噬细胞的微泡的释放诱导的分化。外周血单核细胞（PBM)未经处 理（浅色）或用GM-CSF处理（深色）24小时。收集无细胞上清液并且进行超速离心。将 小泡重悬浮于PBS中并且通过流式细胞术分析大小。分析之前，用2 μ m标准珠校准FSS和 SSC参数（未显示）。显示的是来自三个不同供体的代表性数据。
[0029] 图2A-2C显示微泡介导巨噬细胞分化。从PMA处理的THPl细胞收集微泡，然后将 其添加到未分化的THPl细胞（图2B)或单核细胞（图2C)中。作为对照，THPl细胞未进 行处理（图2A)。每天对所述细胞拍照。显示的是第3天的细胞。
[0030] 图3A-3C显示外周血微泡的分离。经告知同意后，从来自正常志愿者供体的20cc 血液中获得血浆。来自0. 5cc血浆的微泡和⑶206-FITC或MHCII-FITC抗体一起温育并且 在BD FACS Calibur上分析大小（利用前向角对侧向角散射（forward vs. side scatter)) (图3A)和表面抗原表达（图3B)。针对图3A所示的门控区（gated region)，确定CD206或 MHC II的百分比表达（与同种型对照相比）（图3C)。显示的是两个供体的平均值土SEM。
[0031] 图4.外周血微泡的来源的分析。
[0032] 通过流式细胞术分析来自健康供体（η = 10)的外周血微泡。为了确定细胞来源， 针对CD3、CD202b (Tie-2)、CD66b、CD79a或CD41a对微泡进行染色以确定来源于T-细胞、 内皮细胞、嗜中性粒细胞、B细胞或血小板的微泡。单核吞噬细胞衍生的微泡对于CD14、 CD206、CCR3、CCR2或CCR5是阳性的。显示的是平均的总门控事件的最大值％ ±S. E. M。
[0033] 图5A-5D.来自外周血微泡和PBMC的miRNA表达。（图5A)基于过滤标准显示微 泡和PBMC的层次聚类（Hierarchal clustering)分析。产生显示微泡（图5B)和PBMC (图 5C)的表达特征谱的热图。（图5D)显示各个样品组共有的和特异的数目。
[0034] 图6 :显示多种疾病和与其相关的上调和下调的miR的表1。列出了人类疾病（包 括癌和非癌）组织中重要的微RNA。通过将来自我们的数据集（图7,表1I)的血浆中未检 测到的miRNA与已知在特定疾病组织中增加的miRNA相比较，现在发明人相信我们预测几 种miRNA可以用作血浆中的生物标志物（参见图6,表1增加表达栏中粗体的miR)。
[0035] 图7 :显示在血浆中表达的miR和未检测到的miR的表1I。
[0036] 图8 :表1II列出了 miR并且显示在来自所有个体的血浆微泡和PBMC中表达最高 的十种miRNA。
[0037] 图9 :表1V显示参与代谢和获得性免疫系统的调控的经典途径（canonical pathway)受这些 miRNA(仅使用 Sanger miRBase(上部））或来自 Sanger miRBase 和 TargetScan的共有的靶（底部）的表达的高度调控。
[0038] 图10 :表V显示20种miRNA在PBMC级分中具有三倍以上的表达增加（与微泡血 浆样品相比），并且显示血浆微泡中与PMBC相比的倍数变化（最后一栏）。
[0039] 图11 :表VI显示所有检测到的miR的标准化的表达数据：检测器名称，ave-MNC， std-MNC，检测器名称，ave-血清，std-血清。
[0040] 优选实施方案的详细描述
[0041] 本发明部分基于参与炎性应答和/或在血液中具有改变的表达水平的特定微 RNA(miRNA)的鉴定。本发明还部分基于这些miRNA与特定的诊断、预后和治疗特征的关联。
[0042] 如本文描述和举例说明的，特定的miRNA在组织损伤和/或炎症期间上调或下调。
[0043] 如在本文中可互换使用的，"miR基因产物"、"微1?隱"、"11^1?"、"1^1?"或"1^1?隱"是 指来自miR基因的未加工或已加工的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白质，因 此术语"miR基因产物"不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为"miR前体"，其通 常包括长度大约70-100个核苷酸