专利名称：人CD3+CD8+γδT淋巴细胞及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种T淋巴细胞及其制备方法与应用，特别涉及一种人⑶3+CD8+Y 5T 淋巴细胞及其制备方法与应用。
背景技术：
淋巴细胞是具有特异免疫识别功能的细胞系，人和哺乳类动物的淋巴细胞系是由形态相似、功能各异的不均一细胞群所组成。按其个体发生、表面分子和功能的不同，可将淋巴细胞系分为τ细胞和B细胞二个亚群。其中的T细胞是由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成，由于它在胸腺内分化成熟故称为T细胞。成熟T细胞由胸腺迁出，移居于周围淋巴组织中淋巴节的副皮质区和脾白髓小动脉的周围。不同功能成熟的T细胞均属小淋巴细胞，在形态学上不能区分，但可借其细胞膜表面分子不同加以鉴别。在T细胞发育不同阶段以及成熟T细胞在静止期和活化期，其细胞膜分子表达的种类和数量均不相同。由于这些分子在T细胞表面相当稳定，故可视为T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同功能的T细胞。这些分子的单克隆抗体对临床相关疾病的诊断和治疗也具有重要应用价值。其中，TCR(T cell rec印tor)是T细胞识别蛋白抗原的特异性受体，不同的T细胞克隆其抗原识别受体的分子结构也是不相同的。TCR有两种类型，均由两条不同的跨膜的多肽链组成，S卩α β TCR和γ δ TCR0大多数成熟T细胞(约占95% )的TCR分子是由α和β 二条异二聚体肽链组成的α β TCR分子。TCRY δ细胞多见于胸腺内早期T细胞(⑶4_，⑶8_， TCRy δ+)，而在人周围血成熟T细胞(⑶3+，TCRy δ+)中所占的比例甚少，约为1 % 10%。对这种新发现的T细胞的生理功能尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人T淋巴细胞。本发明所提供的人T淋巴细胞，名称为人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞，表达如下三种T 淋巴细胞膜分子人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人Y sT细胞受体。实验证明，人⑶3+⑶8+γ、淋巴细胞可以缓解肿瘤放疗和/化疗所致骨髓抑制。以人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞为活性成分的缓解肿瘤放疗和/化疗所致骨髓抑制的产品也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明的人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞配合化疗和/或放疗，可使肺癌原发病灶和转移病灶缩小，使肺癌细胞转移胸椎、肺癌细胞转移椎体和肺癌细胞转移肋骨逐渐硬化。以人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞为活性成分的治疗肿瘤的药物或产品，以及活性成分包括治疗肿瘤的化疗药物和人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞的治疗肿瘤的成套药物或成套产品，均属于本发明的保护范围。所述肿瘤具体可为肺癌、胃癌或结肠癌。上述人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞可按照包括如下步骤的方法制备离体的人外周血单个核细胞在如下人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中培养并传代得到人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞在RPMI 1640培养基中添加人血浆、异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2得到的培养基，所述人血浆在所述人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中的浓度是10% (体积百分浓度)，所述异戊烯焦磷酸在所述人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中的浓度是100 μ g/ L，所述人白细胞介素-2在人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞专用培养基中的浓度是60万U/L。其中，所述人血浆具体可为人AB血浆。所述RPMI 1640培养基可从商业途径获得， 如可为GENMED公司产品编号为GMS12049. 2A的RPMI 1640培养基。其中所述离体的人外周血单个核细胞在所述人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞专用培养基中传代5代以上。上述培养和传代均可在37°C，5% CO2中进行。本发明的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞配合传统的手术、化疗和放疗治疗，可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，再使用生物学治疗方式清除、杀伤少量的残留或扩散的肿瘤细胞，以提高、巩固肿瘤治疗的效果，减少肿瘤复发的目的。
图1为肺癌病史2年的男患者人⑶3+CD8+Y sT淋巴细胞治疗前后CT检查对比。箭头示肺癌病灶及转移灶A为肺窗的CT检查结果上左为2009. 08. 04日输注实施例1分离的人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞前的结果上右为2009. 09. 22日的CT检查结果下左为2009. 11. 19日的CT检查结果下右为2010. 03. 07日的CT检查结果B为纵隔窗的CT检查结果上左为2009. 08. 04日输注实施例1分离的人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞前的结果
上右为2009. 09. 22日的CT检查结果下左为2009. 11. 19日的CT检查结果下右为2010. 03. 07日的CT检查结果C为转移胸椎病灶逐渐硬化的CT检查结果从左至右依次为2009. 08. 04日输注实施例1分离的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞前的结果、2009. 09. 22日的CT检查结果、2009. 11. 19日的CT检查结果和2010. 03. 07日的CT
检查结果D为转移肋骨逐渐变小硬化的CT检查结果从左至右依次为2009. 08. 04日输注实施例1分离的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞前的结果、2009. 09. 22日的CT检查结果、2009. 11. 19日的CT检查结果和2010. 03. 07日的CT
检查结果E为转移椎体逐渐硬化的CT检查结果从左至右依次为2009. 08. 04日输注实施例1分离的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞前的结果、2009. 09. 22日的CT检查结果、2009. 11. 19日的CT检查结果和2010. 03. 07日的CT
检查结果F为各胸椎骨质破坏区逐渐密度增高硬化的CT检查结果
从左至右依次为2009. 08. 04日输注实施例1分离的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞前的结果、2009. 09. 22日的CT检查结果、2009. 11. 19日的CT检查结果和2010. 03. 07日的CT
检查结果图2为肺癌病史6年的女患者人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞治疗前后CT检查对比图3A为人⑶3+CD8+Y、淋巴细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原⑶3的表达情况图;3B为人⑶3+CD8+Y、淋巴细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原⑶8的表达情况图3C为人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞通过流式细胞仪检测人Y 5T细胞受体的表达情况
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。RPMI 1640为GENMED公司的产品，其产品编号为GMS12049. 2Α ；人AB血浆购自北京红十字血液中心；注射用重组人白细胞介素-2(国药准字S10970016)。实施例1、人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞的分离1)将血站在6- 内采集的人三联袋血液配平后放置在大容量冷冻离心机内，以离心力1160Xg，温度4士2°C，离心8分钟。2)停机后轻轻取出血袋置于分浆夹上，将上层血浆连同白膜层及靠近白膜层 1. 5-2. Ocm的红细胞一起挤入转移袋内。3)将离心机按要求预热(温度22士2°C )。4)将多联袋中保养液加入红细胞中成为少浆血，用高频热合机将少浆血切断。剩余二联袋配平后，以；3500转，温度22 士 2°C，离心8分钟。5)离心后分出上层血浆至转移袋，留下约15ml血浆，剩下的血浆及白膜层即为白细胞血小板悬液。6)制备完毕，微机录入后立即入待检库于22士2°C血小板振荡保存箱中保存。保存有效期为Mh。7)采用FicolΙ-hypaque法从白细胞血小板悬液分离出单个核细胞(PBMC)。具体方法如下用PBS将白细胞血小板悬液1倍稀释后，加到Ficoll-hypaque分离液上，稀释的白细胞血小板悬液分离液约为1 1。用水平离心机以2000r/min离心20min离心后，单个核细胞位于血浆和分离液的界面层，吸取界面单个核细胞层，用PBS稀释后2000r/min离心IOmin洗二次。8)将所分离的PBMC培养于37 °C，5 % CO2培养箱，培养液为人⑶3+⑶8+Y s T淋巴细胞专用培养基。该人⑶3+⑶S+ysT淋巴细胞专用培养基是在RPMI 1640培养基中添加人AB血浆、异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2 (IL-幻得到的培养基，人AB血浆在该人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中的浓度是10 % (体积百分浓度)，异戊烯焦磷酸在该人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中的浓度是100 μ g/L，人白细胞介素-2在该人 ⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中的浓度是60万U/L。该人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞专用培养基的PH为7. 2-7. 4。每2-3天在该人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中传代一次， 使细胞浓度维持在(5 10) X IO5个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37°C，5% C02。传 5代得到人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞。该人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞用抗人⑶3单克隆抗体通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD3的表达情况，用抗人CD8单克隆抗体通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD8的表达情况，用抗人TCR γ δ单克隆抗体通过流式细胞仪检测人ysT细胞受体的表达情况，结果如图3Α、图;3Β和图3C所示，表明该人⑶3+⑶S+ysT淋巴细胞表达人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人ysT细胞受体。流式细胞仪检测结果表明该人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞的纯度达到95%。实施例2、人⑶3+CD8+Y 5T淋巴细胞的活性均经过一个疗程的化疗(一周1次化疗，共6周)的53例肿瘤患者，随机分为治疗组和对照组。治疗组22例肿瘤患者，其中临床诊断为胃癌患者5例，临床诊断为结肠癌患者6例，临床诊断为肺癌患者11例。对照组31例，其中临床诊断为胃癌患者7例，临床诊断为结肠癌患者8例，临床诊断为肺癌患者16例。将步骤1得到的人⑶3+CD8+Y S T淋巴细胞加入由如下配比的物质组成的无菌保存液(血液保存液II)中进行保存枸橼酸钠(C6H5Na3O7 · 2Η20) 13. 2g、枸橼酸 (C6H8O7 -H2O) 4. 8g、葡萄糖(C6H12O6 -H2O) 14. 7g 和水 1000ml。该无菌保存液的 pH 是 7. 2-7. 4。 人CD3+CD8+YST淋巴细胞在该无菌保存液的含量是(2-3) X IO7个细胞/(30-50)ml。在4°C 保存10-12小时，作为给患者回输的人⑶3+⑶S+ysT淋巴细胞悬液。治疗组的22例肿瘤患者化疗药停止后72小时给予静脉回输上述人⑶3+CD8+Y 5T 淋巴细胞悬液。每位患者一次性输入30-50ml上述人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞悬液，在30分钟内输完。即每位患者一次性输入上述人⑶3+⑶S+ysT淋巴细胞(2- X IO7个细胞。对照组的患者在化疗后不进行治疗。各位患者在化疗前、化疗药停止后72小时人CD3+CD8+Y 5T 淋巴细胞回输前、人⑶3+⑶8+YST淋巴细胞回输后3天检测外周血象WBC、PLT。数据以平均值士标准差表示，两组间比较进行t检验。结果表明，人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞回输后肿瘤患者的外周血WBC、PLT升高明显， *P < 0. 05。说明人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞可明显缓解骨髓抑制(表1)。表1治疗组和对照组化疗后外周血象WBC、PLT变化情况
权利要求
1.人T淋巴细胞，其特征在于所述人T淋巴细胞表达如下三种T淋巴细胞膜分子人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人Y sT细胞受体。
2.缓解肿瘤放疗和/化疗所致骨髓抑制产品，其活性成分为权利要求1所述的人T淋巴细胞。
3.治疗肿瘤的药物，其活性成分为权利要求1所述的人T淋巴细胞。
4.治疗肿瘤的成套药物，其活性成分包括治疗肿瘤的化疗药物，其特征在于所述治疗肿瘤的成套药物的活性成分还包括权利要求1所述的人T淋巴细胞。
5.根据权利要求4所述的成套药物，其特征在于所述治疗肿瘤的成套药物的活性成分为治疗肿瘤的化疗药物和权利要求1所述的人T淋巴细胞。
6.权利要求2所述的缓解肿瘤放疗和/化疗所致骨髓抑制产品的制备方法，权利要求 3所述治疗肿瘤的药物的制备方法均包括如下步骤将权利要求1所述的人T淋巴细胞作为活性成分；或，权利要求5所述治疗肿瘤的成套药物的制备方法，包括如下步骤将权利要求3所述的治疗肿瘤的药物和治疗肿瘤的化疗药物分别独立包装后，再将得到的两个独立包装放入同一个盒内。
7.权利要求1所述的人T淋巴细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用、或在制备缓解肿瘤放疗和/化疗所致骨髓抑制的产品中的应用。
8.根据权利要求2所述的产品、权利要求3所述的药物、权利要求4或5所述的成套药物、权利要求6所述的制备方法、权利要求7所述的应用，其特征在于所述肿瘤为肺癌、胃癌或结肠癌。
9.权利要求1所述的人T淋巴细胞的分离方法，包括如下步骤将离体的人外周血单个核细胞在如下人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中培养并传代得到人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞在RPMI 1640培养基中添加人血浆、异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2得到的培养基，所述人血浆在所述人CD3+CD8+Y δ T淋巴细胞专用培养基中的浓度是10% (体积百分浓度)，所述异戊烯焦磷酸在所述人CD3+CD8+Y 5T淋巴细胞专用培养基中的浓度是100 μ g/ L，所述人白细胞介素-2在人CD3+CD8+Y sT淋巴细胞专用培养基中的浓度是60万U/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述离体的人外周血单个核细胞在所述人⑶3+⑶8+Y sT淋巴细胞专用培养基中传代5代以上。
全文摘要
本发明公开了人CD3+CD8+γδT淋巴细胞及其制备方法与应用。该T淋巴细胞是表达如下三种T淋巴细胞膜分子的人T淋巴细胞人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人γδT细胞受体。本发明的人CD3+CD8+γδT淋巴细胞配合传统的手术、化疗和放疗治疗，可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，再使用生物学治疗方式清除、杀伤少量的残留或扩散的肿瘤细胞，以提高、巩固肿瘤治疗的效果，减少肿瘤复发的目的。
文档编号A61K39/00GK102277330SQ201110162578
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者刘 英, 初碧珠, 蒋宇扬, 陈喆 申请人:清华大学深圳研究生院