用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于动物细胞系领域，具体涉及用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用。该人类肝癌细胞系，其特征在于：所述的人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签。本发明提供的细胞系可以直接与双砷染料结合，持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程，更直观的表现乙肝病毒的特性。
【专利说明】用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物细胞系领域，具体涉及用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用。
技术背景
[0002]全球各个地区都有乙肝病毒感染者，亚洲地区、南太平洋地区、非洲、新西兰等地区乙型肝炎病毒HBV是危害人类健康的主要病原体之一。中国是乙型肝炎的高发区，预防和治疗乙型肝炎是一项艰巨而重要的工作。 [0003]乙型肝炎病毒属于嗜肝病毒DNA病毒科，只有很窄的宿主范围，如人乙肝病毒只能感染人或者灵长类的猩猩和狒狒，鸭乙肝病毒并不能自然传染给所有种系的家鸭。乙肝病毒的复制周期经动物体内和体外研究，尤其借鉴鸭乙肝病毒，阐述人乙肝病毒的复制周期。乙肝颗粒的外膜与宿主细胞接触，以前S蛋白附着和侵入细胞，但是病毒颗粒如何附着和侵入细胞还所知甚少，迄今的报道较多，但是无法真正确认。研究HBV感染人体的机制是解决问题的关键，但是由于缺乏敏感的细胞系和病毒可视化的方法，乙肝病毒如何进入细胞、如何在胞内运输、复制、表达及出胞等方面的研究仍然没有确切的方法证实。
[0004]乙肝病毒C基因区相当保守，但在慢性感染中，多数变异集中在C基因区，这可能是由于核心抗原和E抗原有共同的T细胞表位，在HBeAg消失后，HBcAg承受免疫活性施加的选择压力，而C基因区的变异与基因型有关，所以C基因区变异有地理学的特点。我国的慢性乙肝病人常集中在AA48-60、AA84-101、AA147-155这几个序列中。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术的缺陷，提供了可以分泌可视化病毒颗粒的人类肝癌细胞系，此人类肝癌细胞系可以持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，所述真核表达载体命名为pcHBVl.3-TC，所述真核表达载体以pcDNA3.1+为基本骨架，所述的乙肝病毒真核表达载体含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上还同时含有TC标签。
[0008]进一步地，所述真核表达载体为:
[0009]真核表达载体pcHBVl.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759个碱基后插入TC标签，或；
[0010]真核表达载体pcHBVl.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906个碱基后插入TC标签，或；
[0011]真核表达载体pcHBVl.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990个碱基后插入TC标签，或；[0012]真核表达载体pcHBVl.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218个碱基后插入TC标签。
[0013]编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体的方法，包括步骤如下:
[0014]1)1.3倍乙肝病毒基因的获得
[0015]以含1.3倍乙肝病毒基因的环形载体质粒pTHBVl.3为模板设计引物，扩增pTHBVl.3质粒上从5675位点顺时针方向到3270位点的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段；
[0016]2) 1.3倍乙肝病毒基因真核表达载体的构建
[0017]根据酶切位点分析，结合pcDNA3.1+真核表达载体的限制性酶切位点图谱，选用HindIII和NotI两个限制性内切酶对1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表达载体进行双酶切，分别回收酶切的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化感受态细胞，酶切鉴定，载体命名为pcHBVl.3 ；
[0018]3) pcHBVl.3-TC真核表达载体的构建
[0019]利用SOE-PCR技术，设计引物并将TC标签设计入引物内，进行PCR，得到编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表达载体，命名为pcHBVl.3-TC。
[0020]将构建的乙肝病毒基因真核表达载体转染到人类肝癌细胞中，得到人类肝癌细胞系，
[0021]人类肝癌细胞系，该人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签。
[0022]进一步地，所述人类肝癌细`胞系包括四种人类肝癌细胞系，其中:
[0023]一种人类肝癌细胞系，命名为:TC2，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第2位氨基酸后插入TC标签,或；
[0024]一种人类肝癌细胞系，命名为:TC49，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第49位氨基酸后插入TC标签，或；
[0025]一种人类肝癌细胞系，命名为:TC79，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第79位氨基酸后插入TC标签，或；
[0026]一种肝癌细胞株(人类肝癌细胞系)，命名为:!fepG/TC155，简称:TC155，其中，将肝癌细胞株H印G/TC155于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC);保藏地址为:武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:C2013191
[0027]再进一步地，所述的TC标签是一个由四个半胱氨酸组成的发夹结构。
[0028]本发明还提供了一种利用人类肝癌细胞系在活细胞中示踪HBV的应用。
[0029]本发明的优点:
[0030]1、本发明提供的细胞系可以直接与双砷染料结合，持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程，更直观的表现乙肝病毒的特性。
[0031]2、本发明提供的细胞系所有细胞生长旺盛，和!fepG2—般生物学性状一致，具有典型的上皮样形态，可以无限传代培养。
[0032]3、本发明提供的细胞系所有细胞可以稳定分泌乙肝病毒。
[0033]4、本发明提供的细胞系所有细胞分泌的乙肝病毒携带有TC标签，可以与双砷染料结合，持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程。[0034]5、本发明在于提供4种可以稳定传代并且可以分泌乙肝病毒的细胞系，这4种细胞均可分泌的完整的乙肝病毒颗粒，并且分泌的乙肝病毒颗粒的核心蛋白上携带有四半胱氨酸(tetracysteine, TC)标签(核苷酸序列TGCTGCCCAGGATGCTGC)，TC标签是一个由4个半胱氨酸组成的发夹结构，这个结构可以特异地结合膜渗性双砷染料(ReAsH)。这种染料是一种荧光素类似物，含有两个氧苯砷环。当双砷染料与蛋白中融合的TC标签共价结合后，这些TC嵌合型蛋白就会特异地发出荧光。
[0035]6、本发明在乙肝核心蛋白的第2位，第49位，第79位，第155位氨基酸后面插入TC标签。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为pTHBVl.3的载体示意图；
[0037]图2为pcDNA3.1+的载体示意图；
[0038]图3为pcHBVl.3-TC载体示意图；
[0039]图4为pcHBVl.3-TC-1的质粒双酶切电泳图。
[0040]图5为显微镜下观察IfepG2细胞(*100)
[0041]图6为显微镜下观察稳转了 pcHBV-TC的乙肝病毒的!fepG2细胞系(*400)
[0042]图7为Western-blot检测HBcAg的表达。A图从左至右依次为IfepG2细胞，TC2、TC49、TC79、TC155。B 图为 B-actin 条带。
[0043]图8为细胞荧光染色。Ant1-core为FITC标记的HBcAg，ReAsh为双砷标记的HBcAg7DAPI为DAPI标记的细胞核，Merge为两种标记HbcAg以及细胞核的叠加图。激光共聚焦显微镜下观察，图中所示比例尺为50um。
[0044]图9为PCR检测HBcAg mRNA的表达。
[0045]图10为电镜观察细胞上清中的乙肝病毒颗粒。图中所示比例尺为lOOnm。
[0046]图11为细胞内微管与病毒的共定位情况。A图感染Ih后的情况，B图为感染4h后的情况。
【具体实施方式】
[0047]以下结合说明书附图和实施方式来对本发明做进一步的说明，但不是限制本发明。
[0048]实施例1
[0049]真核表达载体pcHBVl.3-TC-1构建
[0050]1、获得1.3倍乙肝病毒基因
[0051]I)设计引物，如下:
[0052]引物如下:
[0053]
【权利要求】
1.人类肝癌细胞系，其特征在于:所述的人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签。
2.根据权利要求1所述的人类肝癌细胞系，其特征在于:所述人类肝癌细胞系为: 一种人类肝癌细胞系，命名为:TC2，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第2位氨基酸后插入TC标签，或； 一种人类肝癌细胞系，命名为:TC49，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第49位氨基酸后插入TC标签,或； 一种人类肝癌细胞系，命名为:TC79，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第79位氨基酸后插入TC标签,或； 一种人类肝癌细胞系，命名为:TC155，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第155位氨基酸后插入TC标签。
3.根据权利要求1或2所述的人类肝癌细胞系，其特征在于:所述的TC标签是一个由四个半胱氨酸组成的发夹结构。
4.一种权利要求1或2所述的人类肝癌细胞系，其特征在于:利用人类肝癌细胞系在活细胞中示踪HBV的 应用。
【文档编号】C12Q1/70GK103667194SQ201310658809
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】林菊生, 廖家智, 孙淑珍, 闫静君, 何星星, 常莹, 田德安, 赵秋, 但自立 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院