壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用的制作方法

壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用。还提供了一种蓝莓果酒的酿造方法。其以壳聚糖磁珠载体，以蓝莓为原料，工艺简单、成本低廉，制得的蓝莓果酒品质好、口感佳。
【专利说明】壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于果酒酿造【技术领域】，特别涉及壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用，还涉及一种蓝莓果酒的酿造方法。
【背景技术】
[0002]果酒是指以水果或野生果实为原料，经过破碎，压榨取汁，发酵或浸泡等工艺流程精心酿制调配而成的一类低度饮料酒。果酒具有酒精度低，营养丰富，口感好等特点。果酒因其酒精度较低，所以对身体的刺激性小，而且常喝果酒能起到提神、消除疲劳的作用且不伤身。 [0003]人类最早酿造的酒便是果酒，苏美尔人和古埃及人早在6000多年前就已经开始酿造出葡萄酒了。这种技术在中国的历史同样可以追溯到2000多年前，史籍中就有着“猿猴酿酒”的传说，但那仅仅是依靠自然发酵而制成的果酒。在唐宋时期，葡萄酒的酿造在我国就已经比较普遍了，除葡萄酒外，还有枣酒、梨酒、石榴酒等众多品种。虽然种类众多，但都未能像白酒和黄酒那样在世界酿酒史上独占一席之地。
[0004]我国人工酿制果酒的历史则要晚很多，一般认为是在汉代时葡萄从西域传入以后才出现。直到清朝末年，位于烟台的张裕葡萄酿酒公司的成立，才标志我国果酒的规模化生产的开端。在建国之后，国内的果酒酿造有了较快的发展，目前，世界上普遍的葡萄酒品种，在国内均可以大规模生产。
[0005]果酒是利用水果酿造而成的低度酒，因果实中含有丰富的营养成分，所以果酒也具有丰富的营养，其中含有多种有机酸，糖类，芳香醇，并且果酒中还含有可以增强免疫功能的SOD等物质。同时果酒中还含有很齐全的氨基酸种类，含有大量的常量元素和微量元素，维生素等营养物质，并且，在果酒的发酵过程中很多的营养成分没有被消耗而保存在果酒中。就是果酒中被保留的这些营养成分对调节人体机能以及维持人体的正常活动起着重要作用。有研究提出饮用果酒有利于预防心血管疾病，有杀菌、滋补作用、助消化作用。果酒具有调节机体新陈代谢和促进血液循环的功能，并能防止胆固醇的增加，改善心脑血管功能。同时还有抗衰老，激发肝功能和利尿的功效。此外，长期饮用适量的果酒可以在一定程度上预防癌症。
[0006]果酒的酿造工艺主要为以下流程:原料选择、破碎打浆、加酶灭酶、调节成分、主后发酵、澄清处理、陈酿过程、处理杀菌、成品果酒。
[0007]水果经过破碎打浆后，应立即添加果胶酶以提高出汁率，因为果胶酶可以对果浆中的果胶物质进行软化并将其分解成果胶酸和半乳糖醛酸，提高浆液中的可溶性固形物的含量，进而提高出汁率，使其更加澄清。
[0008]加果胶酶一定时间后，将其过滤取汁，向果汁中添加一定的亚硫酸盐，使其与果汁中的酸反应，缓慢的释放出游离的so2，以起到抑制杂菌的作用。
[0009]进行主发酵时，将已经活化好的酵母接入到待发酵的果汁中，在一定的温度条件下进行主发酵。在发酵过程中应当注意，对发酵形成的泡盖要及时的搅拌破坏，以使发酵完全。主发酵时间一般在六天左右。
[0010]主发酵后是后发酵，后发酵时用四层的纱布对其进行过滤。过滤时会混入一定的空气，使休眠的酵母复苏，然后于20°c左右进行发酵，一般为10到14天。后发酵时应当注意，尽量使发酵容器内的空气减少，以防止染上醋酸菌。
[0011]后发酵后，经过陈酿杀菌即得到蓝莓果酒成品。蓝莓果酒在成品前可进行冷处理，这有利于蓝莓果酒的成熟及其稳定性的增加。主要有三点作用:一是改善口味，使不安全的色素和过量的硫酸盐析出并沉淀；二是可以加速发酵后残留在果酒中的死酵母、果胶等有机物质加速沉淀；三是可以在低温下令蓝莓果酒中溶解较多的氧气，加快果酒的陈酿过程。冷处理是一种物理过程，微生物的活性可能会暂时下降，当温度恢复时会重新活跃起来，因而冷处理不能维持持久的微生物稳定性，但是对澄清过程有一定帮助。
[0012]近些年来，为了提高果酒生产效率、保证安全高效生产，世界主要的果酒成产国开始研究果酒酿造的新工艺、新技术，主要包括果酒酵母的选育，果酒酿造工艺的优化，陈化，澄清，果酒与啤酒工艺结合等方面。
[0013](I)果酒酵母选育新技术
[0014]①筛选自然酵母。由于用筛选的纯种酿酒酵母酿造的果酒通常风味平淡，果香味不充分，因此需要选育一些产香酵母、产酯酵母，如毕赤酵母属，可以产生一些芳香物质和风味成分，能够改善果酒的风味。②采用现代育种手段筛选果酒酵母。通过采用一些现代育种手段，如基因工程技术、原生质体融合、诱变育种和杂交育种技术等，使菌种的生产性状发生明显的改善和较大幅度的提高。
[0015](2)果酒酿造新工艺
[0016]①冷冻浓缩技术。传统的葡萄酒冷冻浓缩技术是指先把葡萄在采摘前自然冷冻，然后手工采摘冷冻后的葡萄，榨汁，得到极少量糖含量较高的葡萄汁，最后向葡萄汁中接入酵母进行低温发酵。用于生产中的冷冻浓缩技术有悬浮结晶法和渐进冷冻法。近年来，一些新的冷冻浓缩技术用于食品冷冻浓缩中，如冰核细菌(简称INA细菌)。其原理是，INA细菌能产生冰核活性很强的特异性冰蛋白，该蛋白首先以冰核活性很低的单体形式合成，然后在细胞中聚合行成冰核活性很强的蛋白复合物，这种蛋白复合物作为水分子冷冻的模板，在零下较高温度的诱发下加速水的冷冻过程，最终获得高质量的浓缩果汁。国外已有相关文献报道，表明INA细菌可以明显的提高食品的过冷点，缩短冷冻时间，从而节省大量能源；还可促进较大冰晶生长，降低操作成本。②固定化酵母技术。目前，固定化技术广泛应用于果酒发酵中。
[0017](3)陈化新工艺
[0018]陈酿是在果酒发酵过程中非常重要的一道工序，充分的陈酿才可以使果酒品质得到保证。为了提高果酒的生产效率，缩短果酒陈化时间，可采用一些物理辅助方法，如光、电、磁化等物理因素来催陈，以加强果酒的陈香，也可以采用化学方法如采用微氧化和采用催化剂加速果酒的陈化。
[0019](4)澄清新工艺
[0020]在果酒发酵结束后，澄清果酒中的杂质对果酒的品质起着重要的作用。传统的澄清方法是采用硅藻土助滤剂和支撑板过滤系统。在20世纪80年代中期，国外在葡萄酒生产中采用错流技术代替硅藻土粗 滤及纸板和圆盘精滤，错流技术在我国的使用刚刚开始。近年来，刘淑华找到了一种解决果酒沉淀的方法，即采用糖浆作为澄清剂进行下胶，其原理是，在配置果酒的化糖工序中，将糖浆充分煮沸，静置至少lh，使糖浆自然冷却，温度不低于30°C，加入酒中，过滤至澄清。这种方法不改变原果酒工艺流程，对果酒的品质、口味无任何影响，果香味保持完整，放置数年或-30°C以下仍不浑浊。
[0021](5)果酒与啤酒工艺结合。啤酒深受我国广大消费者的喜爱，将啤酒和果酒的酿制工艺相结合，生产出的果啤酒既具有啤酒清爽的口感，又具有果酒特殊的香味。果啤酒的酿造工艺主要有3种，一种是用果汁与麦芽汁共同发酵生产果啤，第二种是将果酒与啤酒勾兑生产果啤酒，第三种是在啤酒中添加果汁或者其他调味剂调配而成。
[0022]蓝莓，英文名为Blueberry，是蓝色的浆果意思。蓝莓是一种小浆果，果实呈蓝色，色泽鲜亮、并由一层白色果粉包裹，果肉细腻，种子极小。蓝莓果实酸甜可口，并且具有宜人的香气，可鲜食也可制成蓝莓制品使用。蓝莓主要有两种类型，一种是野生低灌木，果树低矮，果实颗粒较小，但花青素的含量很高；第二种是人工培育型蓝莓，果树较高，和普通果树相似，果实也较大，水分较多，但是花青素的含量相对偏低。蓝莓果实中含有很丰富的营养成分，这些不仅具有良好的保健作用，还具有防止脑神经老化、强心、抗癌软化血管、增强人机体免疫等功能。据报道，全世界蓝莓约400余种，其中，中国有37种，在我国东北的大小兴安岭及海南等地区都有野生种分布。
[0023]蓝莓果实中含有多种营养成分，除了糖、酸、V。以外，还富含多种维生素，如VA、VB、VE等，花青素、SOD、蛋白质、熊果苷、食用纤维、矿物质元素(K、Fe、Zn、Ca等)。根据对14个美国的蓝莓品种进行分析，测定出每一百克新鲜蓝莓中的花青素含量高达163mg、S0D5.39g、蛋白质500mg、碳水化合物12.9g、脂肪IOOmg VA81_100mg、VE2.7-9.5mg，是其它水果，如葡萄、苹果等等几倍甚至十几倍。不仅如此，蓝莓中的矿物质元素含量也很高，每一百克新鲜蓝莓中，含 Ca220-920y g、Mgll4-249y g、P98-274y g、Fe7.6-30.0 μ g、Zn2.1_4.3μ g，总得氨基酸含量达到了 2.54%，比以富含氨基酸而著称的山楂还要高。除此之外，蓝莓果汁中还含有黄酮等特殊成分，因而被美国时代杂志评选为“十大最佳营养食品之一”。经常食用蓝莓制品，可明显地增强视力，消除眼睛疲劳；营养皮肤；延缓脑神经衰老；对由糖尿病引起的毛细血管病有治疗作用；增强心脏功`能；预防老年痴呆。
[0024]Svarcova等人收集了 1935~2007年的有关资料，认为蓝莓富含花青苷色素与前花青素、黄酮等物质，对人体健康具有促进作用。例如可以用于辅助心血管疾病、糖尿病、癌症等慢性疾病的康复治疗。
[0025]蓝莓中的果胶含量很高，能够有效地减少胆固醇含量，防止动脉血液硬化，促进心血管健康；所含的花青贰色素对视网膜有保护的功能，可以强化视力，防止眼睛疲劳，明目提神；所含维生素C有增强心脏功能，预防癌症和心脏病的功效，能防止脑神经衰老，增进眼力。蓝莓的保健作用主要有:是强力抗氧化剂，提高记忆；预防癌症；增强视力；美容护肤；清除体内有害物质；改善身体微循环，调节睡眠，减少亚健康的发生。
[0026]相对于蓝莓而言，蓝莓果酒的保存时间更长。而且蓝莓果酒保留了蓝莓果中所含有的人体所需的糖、酸、矿物质、维生素等营养成份，不添加任何人工色素、香精、防腐剂等添加剂，保持蓝莓果实的天然绿色风格，是新型的具有保健功能的果酒。
[0027]固定化技术是用化学或物理方法将游离的酶或细胞固定于限定的空间区域内，使其成为既可保持本身催化活性，又克服游离态酶或细胞的不足之处，还可在连续反应之后回收和反复利用的一种生物催化剂。
[0028]固定化酶的研究始于20世纪50年代，1953年德国的生物学家第一次制成固定化酶，20世纪60年代后期，1969年日本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL—氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一次变革。此后，酶的固定化技术迅速发展，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为immobilized enzyme,确切的表达了固定化酶。
[0029]固定化酶的应用研究从固定化单一酶进行简单的一步催化反应开始，到同时固定化两个或两个以上的酶。目前，对固定化酶技术的研究已经很多并很全面了。有关方面的研究报道也越来越多，大量的综述和专著都着重介绍这方面的成果，但固定化酶也存在着缺陷:(I)在某些反应过程中需要多种酶协同作用才可实行；(2)有些酶难分离纯化；(3)有些反应需辅酶的再生。因此，固定化酶的实际应用受到了很大限制，这种情况下，人们又将注意力又转移到酶的主要来源一微生物上，于是，20世纪70年代后期，在固定化酶的基础上出现了固定化细胞技术。其机理很简单，就是将活的微生物细胞高度密集固定在载体之上，在合适的条件下，并使其不断生长繁殖，形成高浓度的生物催化剂，从而大大加快了反应速度，使生产能力大幅度提高。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，取得良好的效果。
[0030]虽然固定化细胞技术起步晚，但是其从研究阶段进入生产应用的速度大大超过了固定化酶。目前，大规模工业生产应用的固定化细胞也比固定化酶多，可以预见其应用前景将更加广阔。
[0031]与游离态细胞相比较，固定化细胞有以下的显著特点:
[0032](I)固定化细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，可以进行正常的生长繁殖；
[0033](2)固定化细胞保持了细胞原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并有效的进行代谢调控；
[0034](3)由于有载体的保护作用，可以提高基因工程菌的质粒稳定性；
[0035](4)使用固定化微生物细胞可连续、稳定地生产，并且可连续稳定地分离；
[0036](5)利用固定化微生物细胞容易实现自动控制，节约劳动力。
[0037](6)克服了生物细胞太小与水溶液分离较难，易造成2次污染的缺点，保持了生产效率高、能纯化和长期保持高效菌种的优点。
[0038]细胞的种类多种多样，大小和特性也不相同，故常用微生物固定化方法也有很多，一般来说，大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法四大类:
[0039]1、吸附法:利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。常用的固体吸附剂有硅藻土、多孔陶瓷、多空玻璃等等。例如酵母细胞在PH3-5的条件下能吸附在多空陶瓷和多空塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒的发酵。用吸附法制备固定化细胞时，操作简单易行，对细胞的生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响，但吸附力较弱，载体吸附细胞不牢固，容易使其脱落，使用受到一定的限制。
[0040]2、结合法:选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与细胞结合在一起的固定化方法称为结合法。采用共价结合法固定的微生物与固相载体的结合力较强，但是因为固定过程中反应激烈，操作较复杂，因而对微生物活性存在较大抑制，普遍应用性较差。[0041]3、交联法:交联法与共价结合法类似，借助双功能试剂使细胞之间发生交联作用使细胞固定的方法称为交联法。但交联法所采用的载体是非水溶性的，交联剂多采用戊二醛、双重氮联苯胺等。交联法固定的细胞与载体联结牢固，稳定性高，但是由于交联反应条件激烈，抑制了微生物的活性，适用范围较狭窄。
[0042]4、包埋法:将细胞包埋在多空载体内部而制成的固定化细胞的方法称包埋法。包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法，即将细胞包裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内，该方法成本低，操作简单，对细胞活性影响较小，制作的固定化细胞球的强度较高。但传质阻力较大。包埋的载体主要有海藻酸钙凝胶、角叉莱胶、明胶等。
[0043]包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都比较高，且包埋在反应工程(包括反应器的设计、操作稳定性等)中应用灵活，因此，包埋法成为整个固定化生物催化剂技术中应用最广泛的固定化方法；但是包埋法的扩散阻力较大，使细胞的催化活性受到限制，较适合于小分子底物与产物的反应。
[0044]自20世纪70年代后期以来，对固定化细胞的研究迅速发展。固定化细胞载体主要可以分为两大类，一类是无机载体，如硅藻土、多空玻璃等；另一类是有机载体，又可分为两种，一种为天然高分子凝胶载体，如琼脂、明胶和海藻酸钙凝胶等，这些载体无生物毒性，传质性好，但强度低，在厌氧条件下易被生物分解。另一种是有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰铵(ACRM)凝胶、聚乙烯醇(PVA)凝胶等，一般强度较好，但传质性能较，包埋后对细胞活性有影响。近年来也出现了使用甘蔗渣、葡糖干和红枣等天然的食用性物质来固定细胞，这些载体来源广泛，无生物毒性，可用于食品级生产过程中。同时，固定化细胞的应用很广，归纳起来主要为两个方面，一方面是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产品，如酒精、氨基酸等等；一方面是利用固定化细胞与各种电极结合制成微生物电极。 [0045]20世纪80年代初期，Ugelstad提出了用带有磁性的微粒来分离细胞，后由挪威的Dynal公司生产制做免疫磁珠，以此来出售，其被命名为Dynabead，可分离各种各样的细胞。这种免疫磁珠因操作简便、分离细胞纯度高、保留了固定细胞的活性等特点而被人们所接受并应用。它的出现打破了世人皆接受的一种传统观念一有机物与“铁磁”无缘。由于磁性微球的超顺磁性，所以对于分离生物产品来说是一次革命性的突破。目前，磁性微球作为一种新型的生物分离技术和靶向药物的载体，受到人们的广泛关注和研究。
[0046]磁性微球是指使用适当方法使有机高分子与无机磁性粒子结合形成具有一定磁性及特殊结构的复合微球，因为磁性微球具有高分子微球的众多特性和磁响应性，不仅可以通过共聚及表面改性等方法来赋予其表面功能基(如一0H、一C00H、— CH0, -NH2, 一SH等)，与其它大小分子或细胞等生物活性物质结合，还可以利用磁核对外磁场的响应，在磁场中定向移动，利用这一性质可以对磁性微球进行定位，或很快速地从周围介质中分离磁性微球，通过磁性微球对研究对象施力。磁性微球具有两种主要的作用，载体作用及分离作用，利用化学、物理学和生物学原理，使许多烦琐复杂的操作简单化，还可使传统测试的周期大大缩短。因此，磁性微球在靶向给药、细胞分离、亲合色谱、核酸研究和固定化酶等许多领域得到广泛应用，另外磁性微球也被广泛应用于有机和生化合成生物催化和环境/食品微生物检测等领域。
[0047]选择合适的磁性材料是要制备性能优越的磁性微球的首要条件。在我们目前所熟知的大量磁性材料中，只有几种材料可以用来制作磁性微粒:金属氧化物Y-Fe2O3, Fe3O4,MeFe2O4 (Me=Co, Mn, Ni)，金属Ni, Co, Fe及其合金Fe-Co, N1-Fe等。在上述磁性材料中Co(cubic)和Fe (cubic)具有较高的饱和磁化强度,而剩下的金属氧化物和Ni的饱和磁化强度较低。即使具有较高饱和磁化强度的Co，Fe等金属，但是它们在空气中容易被氧化成CoO和FeO，这两种氧化物是反铁磁性的物质，这对金属材料的磁性起副作用；其次，N1、Co等存在毒性，在生物、医药等领域的应用受到严格限制；再次，这些纯金属的磁性材料制备微粒的工艺条件往往十分苛刻，这些原因都在一定程度上限制了这些高饱和磁化强度的磁性微粒的应用。而铁的氧化物(Fe3O4, Y-Fe2O3)因其具有良好的氧化稳定性、较低的毒性(LD50约2000mg/kg体重，远远高于目前临床应用剂量)、易得等特点通常被用作磁性聚合物微球的磁性微粒。
[0048]制备磁性聚合物微球的方法多种多样，主要的方法有:
[0049]1.原位合成法:是一种化学转化法，旨在磁珠制备过程中加入功能单体或对微球进行后修饰使微球带有大量能与铁盐形成配位键或离子键的基团。
[0050]2.无皂乳液聚合法:在反应过程中完全不含或仅含微量(其浓度小于CMC值)乳化剂的乳液聚合，它是在传统乳液聚合的基础上发展起来的一项聚合反应新技术。
[0051]3.微乳液聚合法:微乳液聚合法制备磁性微球是近几年用的较多的一种方法，它分正相微乳液聚合法和反相微乳液聚合法。
[0052]4.分散聚合法:指通过一种溶于有机溶剂(或水)的单体聚合生成不溶于该溶剂的聚合物，并形成稳定的分散体系的聚合方式。
[0053]5.悬浮聚合法:主要原理是在磁性粒子、悬浮稳定剂和表面活性剂存在的条件下，用引发剂使一种或几种单体在磁性粒子表面引发均聚或共聚，将磁性粒子包裹在聚合物里面。`
[0054]6.原子转移自由基聚合法:可用来制备核-壳型磁性微球。具体做法是通过修饰磁性无机粒子使之成为大分子引发剂，然后分散于单体，通过本体聚合获得核-壳型磁性微球。
[0055]甲壳素是一种储量十分丰富的天然多糖，它是虾、蟹、蚕蛹和昆虫等外壳的主要成分，是一种极为丰富且用处很大的的自然资源。纤维素是地球上存在的天然有机化合物中最丰富的物质，而其次就是甲壳素，前者主要由植物生成，后者主要由动物生成。甲壳素具有很多显著的优点:对蛋白质具有高亲和性；具有许多反应基团，可被广泛地进行化学改性等。因为甲壳素在一般溶剂下难溶解，使它在提纯、加工、化学反应等过程中都比较困难，应用受到限制。但若在碱性条件下将其水解，脱去分子中的部分乙酰基，就会转变成为壳聚糖。壳聚糖的溶解性能大大的改善，故也常称之为可溶性甲壳素，又称壳多糖，脱乙酰甲壳素，可溶性甲壳素，壳糖胺，甲壳胺，甲壳糖等等。
[0056]壳聚糖是唯一的天然存在的碱性多糖，具有良好的吸附性、通透性、成模性、成纤性、吸湿性和保湿性。并具有较突出的生物亲和性，壳聚糖分子链上含有丰富的羟基和氨基，这就使其易于进行化学修饰而赋予多种功能。位于壳聚糖糖残基上的自由羟基，能与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤等发生酯化反应，导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基，形成有机酸脂；糖残基上的氨基发生酰化反应可以生成酰胺，也可以与醛发生缩合反应生成西佛碱，可由双官能团的醛或酸酐等进行交联，得到网状结构的不溶产物，交联的目的是使产物不溶解，甚至溶胀也很小，性质很稳定，这对于他们被用作层析的载体或做固定化的载体是十分重要的。
[0057]制备壳聚糖磁性微球的方法是利用壳聚糖上的氨基与双官能团的醛基进行联，而得到网状结构聚合物微球。本实验的制备工艺主要采用E.B.Denkbas的悬浮交联的制备方法:在强烈搅拌下，将壳聚糖的醋酸水溶液和磁核微粒分散于适当的有机介质中，在乳化剂存在下，可形成细小的壳聚糖微粒。在戊二醛作用下，壳聚糖微粒可进一步交联形成微球。交联后的壳聚糖磁性微球，不溶于稀酸，具有较高的强度。
[0058]果酒的鉴别也是果酒酿造过程中不可缺少的环节。有感官鉴别，化学鉴别两种方法。
[0059]感官鉴别有以下四种方法。1.果酒外观鉴别一果酒应呈现宝石红色或檀香色，酒液清亮透明，具有光泽，无悬浮物、沉淀和混浊现象。2.果酒香气鉴别一果酒一般应具有原果实特有的香气，陈酒还应具有浓郁的酒香，而且一般都是果香与酒香混为一体。酒香越丰富，酒的品质越好。3.果酒滋味鉴别一应该酸甜适口，醇厚纯净而无异味，甜型酒要甜而不腻，干型酒要干而不涩，不得有突出的酒精气味。4.果酒酒度鉴别一我国国产果酒的酒度多在12~18度范围内。
[0060]化学鉴别是指可以使用一些分析仪器，如可以用色谱法或分光光度法等多种方，来测定果酒中的糖类，酸类，酒精度，维生素C、黄酮类，单宁，花青素，香气成分等影响果酒品质的化合物的含量，以此来评定果酒的品质的优劣。
[0061]果酒因其具有的营养和保健作用而备受现代人喜爱，成为当今饮料业的发展方向。大力进行天然果酒的开发和研究，发展果酒生产，不仅可以充分利用我国丰富的果类资源，提高资源利用率，还可减少粮食消耗，改善酒类产品消费结构，满足消费者需求，有益于国民健康，同时可有效地促进土`坡地和山地资源的开发利用。蓝莓作为世界认可的健康食品之一，具有很大的发展前景，而蓝莓果酒只是其中的一部分。蓝莓果酒具有较多的保健功能，很受大家欢迎。
[0062]酵母的固定化技术是不仅是固定化技术的一种新发现，同时也是果酒发酵新技术的一种体现。近年来，对酵母固定化技术研究很多，但用磁珠来固定酵母并发酵果酒的研究却很少。

【发明内容】

[0063]发明目的:本发明的目的在于提供壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用。
[0064]技术方案:本发明提供了壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用。
[0065]其中，所述壳聚糖磁珠固定酵母采用以下步骤制得:
[0066]( I)四氧化三铁磁珠的制备:将氯化铁和硫酸亚铁溶于蒸馏水中，加入PEG混匀；加热至50-70°C，搅拌20-40min反应，滴加氢氧化钠水溶液至溶液完全变黑色，调pH至10-12，50-70°C恒温搅拌l_3h ;70-90°C陈化20_40min ;超声0.5_2h，洗涤并调pH至中性，即得四氧化三铁磁珠；
[0067](2)壳聚糖磁珠的制备:将四氧化三铁磁珠和壳聚糖溶于乙酸水溶液中，搅拌同时倒入分散介质中，加入戊二醛继续搅拌，用磁铁收集，洗净，即得壳聚糖磁珠；[0068](3)酵母的扩陪:将酵母于酵母培养液上培养3-5d ；
[0069](4)壳聚糖磁珠固定酵母:将壳聚糖磁珠在酵母培养液中溶胀2-3d后，接入扩陪的酵母，30-35°C培养30-40h ；
[0070]本发明还提供了一种蓝莓果酒的酿造方法，包括以下步骤:
[0071](I)四氧化三铁磁珠的制备:将氯化铁和硫酸亚铁溶于蒸馏水中，加入PEG混匀；加热至50-70°C，搅拌20-40min反应，滴加氢氧化钠水溶液至溶液完全变黑色，调pH至10-12，50-70°C恒温搅拌l_3h ;70-90°C陈化20_40min ;超声0.5_2h，洗涤并调pH至中性，即得四氧化三铁磁珠； [0072](2)壳聚糖磁珠的制备:将四氧化三铁磁珠和壳聚糖溶于乙酸水溶液中，搅拌同时倒入分散介质中，加入戊二醛继续搅拌，用磁铁收集，洗净，即得壳聚糖磁珠；
[0073](3)酵母的扩陪:将酵母于酵母培养液上培养3-5d ；
[0074](4)壳聚糖磁珠固定酵母:将壳聚糖磁珠在酵母培养液中溶胀2-3d后，接入扩陪的酵母，30-35°C培养30-40h ；
[0075](5)蓝莓浆的制备:将蓝莓打浆后，加入蓝莓总质量的0.3-0.5%的果胶酶酶解l-3h，80-90°C的水浴中灭菌5-10min，加糖水调糖度至12-24BX，加碳酸钙或柠檬酸调pH至3-5，即得蓝莓浆；
[0076](6)主发酵:将固定酵母的壳聚糖磁珠加入蓝莓酱中，室温发酵5-7d;
[0077](7)后发酵:过滤步骤(6)的发酵液，滤液加入固定酵母的壳聚糖磁珠，10_20°C发酵7-14d ;过滤。
[0078]步骤(1)中，氢氧化钠水溶液的浓度为0.5-1.5mol/L ;氯化铁、硫酸亚铁、蒸馏水和 PEG 的用量比为 8-10g:10-12g:250-350mL:50_150mL。
[0079]步骤(2)中，所述分散介质包括体积比为40-60:60_80:1_5的液体石蜡、石油醚和
吐温80。
[0080]步骤(2)中，四氧化三铁磁珠、壳聚糖、乙酸水溶液、分散介质和戊二醛的用量比为l-2g:2-4g:50-150mL:101-145mL:l_3mL。
[0081]步骤(2)中，搅拌温度为室温，搅拌速度为500-1500r/min。
[0082]酵母培养液的制备方法为:取200g土豆，切块后，加水煮沸，过滤，滤液加入20g葡萄糖，定容至1000mL,灭菌即得。
[0083]有益效果:本发明提供了壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用，其以壳聚糖磁珠载体，以蓝莓为原料，工艺简单、成本低廉，制得的蓝莓果酒品质好、口感佳。
【专利附图】

【附图说明】
[0084]图1为本发明壳聚糖磁珠固定酵母显微成像图。
[0085]图2为主发酵温度对固定化发酵的影响曲线。
[0086]图3为初始糖度对固定化发酵的影响曲线。
[0087]图4为初始pH值对固定化发酵的影响。
[0088]图5为乙醇含量随发酵时间的变化曲线。
[0089]图6为pH随发酵时间的变化曲线。
[0090]图7为Vc随发酵时间的变化曲线。[0091]图8为还原糖随发酵时间的变化曲线。
[0092]图9为花青素随发酵时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0093]下面结合附图对本发明做出进一步说明。
[0094]本发明培养基的配方或制备方法:
[0095]酵母培养液的制备方法为:称取200g的土豆,切成小块,加水煮沸30min,过滤冷却，加入20g葡萄糖，定容到lOOOmL，后分装并在121°C下灭菌20min。
[0096]本发明对蓝莓果酒发酵的品质采用的评价方法包括感官评价和理化鉴别，分别如下:
[0097](1)感官评价
[0098]主要从外观(20分)，气味(40分)，典型性(10分)，滋味(30分)四方面评价。
[0099]蓝莓果酒的感官评价指标，见表1。
[0100]表1蓝莓果酒感官评价评分标准[28]
[0101]
【权利要求】
1.壳聚糖磁珠固定酵母在蓝莓果酒酿造中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述壳聚糖磁珠固定酵母采用以下步骤制得: (1)四氧化三铁磁珠的制备:将氯化铁和硫酸亚铁溶于蒸馏水中，加入PEG混匀；加热至50-70°C，搅拌20-40min反应，滴加氢氧化钠水溶液至溶液完全变黑色，调pH至10-12，50-70°C恒温搅拌l_3h ;70-90°C陈化20_40min ;超声0.5_2h，洗涤并调pH至中性，即得四氧化三铁磁珠； (2)壳聚糖磁珠的制备:将四氧化三铁磁珠和壳聚糖溶于乙酸水溶液中，搅拌同时倒入分散介质中，加入戊二醛继续搅拌，用磁铁收集，洗净，即得壳聚糖磁珠； (3)酵母的扩陪:将酵母于酵母培养液上培养3-5d； (4)壳聚糖磁珠固定酵母:将壳聚糖磁珠在酵母培养液中溶胀2-3d后，接入扩陪的酵母，30-35 °C 培养 30-40h。
3.—种蓝莓果酒的酿造方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)四氧化三铁磁珠的制备:将氯化铁和硫酸亚铁溶于蒸馏水中，加入PEG混匀；加热至50-70°C，搅拌20-40min反应，滴加氢氧化钠水溶液至溶液完全变黑色，调pH至10-12，50-70°C恒温搅拌l_3h ;70-90°C陈化20_40min ;超声0.5_2h，洗涤并调pH至中性，即得四氧化三铁磁珠；` (2)壳聚糖磁珠的制备:将四氧化三铁磁珠和壳聚糖溶于乙酸水溶液中，搅拌同时倒入分散介质中，加入戊二醛继续搅拌，用磁铁收集，洗净，即得壳聚糖磁珠； (3)酵母的扩陪:将酵母于酵母培养液上培养3-5d； (4)壳聚糖磁珠固定酵母:将壳聚糖磁珠在酵母培养液中溶胀2-3d后，接入扩陪的酵母，30-35 °C 培养 30-40h ； (5)蓝莓浆的制备:将蓝莓打浆后，加入蓝莓总质量的0.3-0.5%的果胶酶酶解l_3h，80-90°C的水浴中灭菌5-10min，加糖水调糖度至12-24BX，加碳酸钙或柠檬酸调pH至3_5，即得蓝莓浆； (6)主发酵:将固定酵母的壳聚糖磁珠加入蓝莓酱中，室温发酵5-7d； (7)后发酵:过滤步骤(6)的发酵液，滤液加入固定酵母的壳聚糖磁珠，10-20°C发酵7-14d;过滤即得。
4.根据权利要求3所述的一种蓝莓果酒的酿造方法，其特征在于:步骤(1)中，氢氧化钠水溶液的浓度为0.5-1.5mol/L ;氯化铁、硫酸亚铁、蒸馏水和PEG的用量比为8_10g:10-12g:250-350mL:50_150mL。
5.根据权利要求3所述的一种蓝莓果酒的酿造方法，其特征在于:步骤(2)中，所述分散介质包括体积比为40-60:60-80:1-5的液体石蜡、石油醚和吐温80。
6.根据权利要求3所述的一种蓝莓果酒的酿造方法，其特征在于:步骤(2)中，四氧化三铁磁珠、壳聚糖、乙酸水溶液、分散介质和戊二醛的用量比为l_2g:2-4g:50-150mL:101-145mL:l_3mL。
7.根据权利要求3所述的一种蓝莓果酒的酿造方法，其特征在于:步骤(2)中，搅拌温度为室温，搅拌速度为500-1500r/min。
8.根据权利要求3所述的一种蓝莓果酒的酿造方法，其特征在于:酵母培养液的制备方法为:取200g 土豆,切块后,加水煮沸，过滤,滤液加入20g葡萄糖,定容至1000mL,灭菌即得。`
【文档编号】C12N11/14GK103773650SQ201310658608
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】江明珠, 张娇, 闻燕 申请人:江苏科技大学