专利名称：表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子及其制备方法
技术领域：
本发明属无机材料合成及生化分析技术领域，具体涉及一种具有超顺磁性的表面固定 金属离子的氨基磁性纳米粒子及其制备方法。
背景技术：
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。在哺乳动物细胞生命周期 中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几 乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收縮及肿 瘤发生等过程在内的所有生命活动。对蛋白质磷酸化修饰的研究是蛋白质结构分析与鉴定 中一个非常重要的内容，确定蛋白质的磷酸化修饰位点并总结其相关的序列特点有助于进 一步地了解参与磷酸化的底物及其酶的功能关系，从而更深入理解磷酸化修饰在生命过程 中的作用。因此发展磷酸化蛋白的研究方法对于认识生命活动过程具有重要的意义。规模 化的识别和鉴定生物体内磷酸化蛋白质的表达及其变化，在技术方法上还存在很大问题， 其中磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一。近年 来，基于基质辅助激光解析的飞行时间质谱成为磷酸化蛋白结构解析的强大辅助工具。由 于在实际生物样本中蛋白质磷酸化的化学计量值较低，且在质谱分析中，由于磷酸肽本身 所具的负电性又使其在质谱分析时信号受抑制，磷酸化肽段离子化效率低，因此其信号往 往被非磷酸化肽段所抑制，这对磷酸化肽段的鉴定提出了挑战。在质谱分析前对磷酸蛋白 /肽进行选择性分离或富集为磷酸化蛋白的结构解析提供了有效的解决方法。固定金属离 子螯合色谱(MAC)是该方面目前研究的热点。固相金属离子亲和色谱最初用于磷蛋白的 亲和纯化，磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力，可被选择性地吸附在上面，通过固 定在多孔树脂上的金属离子和磷酸化肽段或蛋白的磷酸根离子之间的静电相互作用实现 选择性分离富集。
磁性聚合物纳米粒子以其本身特有的物理、化学性质以及在细胞分离、磁辅助给药和 酶固定等众多领域中的潜在应用前景而得到了广泛的关注。磁性聚合物纳米粒子融合了磁 性材料的磁响应特性和微球聚合物材料的高分散性等优点，使得其对痕量肽段的富集成为 可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对痕量磷酸化肽段进行高
选择性富集及直接进行质谱分析的表面固定有金属离子的氨基磁性纳米粒子及其制备方 法和应用。
本发明提供的表面固定有金属离子的氨基磁性纳米粒子，是先采用水热法合成氨基四 氧化三铁磁性纳米材料，然后与己二酰氯反应，继而再与亚氨基二乙酸反应对其表面进行 化学修饰，生成表面带有羧基的磁性纳米材料，进而固定金属离子而获得。其结构如下式 所示-
<formula>formula see original document page 5</formula>式中，1表示氨基四氧化三铁磁性纳米粒子；M表示表面固定的金属离子；
金属离子M可以是Fe3+、 Al3+、 Ga3+、 In3+、 Ce3+、 Zr4+、 N产或C等。用于磷酸化
肽段富集的磁球外部固定的金属离子可以是F^+、 Al3+、 Ga3+、 In3+、 C^+或Zr"等。 上述表面固定有金属离子的氨基磁性纳米粒子的制备方法如下
(1) 用水热法合成表面带有氨基的超顺磁性纳米粒子采用1.0—5.0克FeCl3'6H20 为原料，以20 — 80mL乙二醇为分散体系，添加2-6克无水乙酸钠，反应温度为190_210 °C,反应时间为6—18小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子,其粒径是30 — 100nm;
(2) 在磁性纳米粒子表面进行化学修饰固定金属离子将0.2 — 0.6g氨基四氧化三铁 磁性纳米材料分散于40—80mL无水甲苯和5—20mL吡啶的混合液中，超声分散；然后 往密闭体系中注入5—20mL己二酰氯，反应3 — 6h。在外加磁场作用下，收集产物，并 用无水甲苯清洗。将最终材料分散于30—60mL无水甲苯中；然后往该混合液中加入5 — 20mLIDA，反应3 — 6h。最终产物经磁分离收集，用无水甲苯清洗。将得到的产物分散 在10-30mL，浓度为0.1-0.3 M的FeCl3溶液中，振荡分散2-4h;然后用去离子水反复清 洗材料。
本发明中，水热法合成粒子和进行化学修饰后表面羧基化的氨基磁性纳米粒子皆具有
很好的超顺磁性，其饱和磁化强度分别为40—70emu/g和30—60emu/g。
本发明合成的具有超顺磁性表面固定有金属离子的氨基磁性纳米粒子可直接放入含 有磷酸化肽的复杂肽段混合物中，进行痕量磷酸化肽选择性富集，无需特殊处理；富集好 后，采用简单磁场对磷酸化肽和其他样品的进行分离，无需离心，所以可以克服传统离心 造成的非磷酸化肽的共离心沉淀问题；富集后样品无需洗脱，克服了样品洗脱过程造成的
样品损失问题，并且该材料不存在传统材料的"孔洞效应"，可直接用于基质辅助激光解 析离子化质谱分析，进而实现磷酸化位点的鉴定，方法简单实用有效。
本发明中，上述富集体系的pH值为1-6，样品浓度为2X10- — 2X10—9 M，超顺磁性 微球量是50-1000吗/1 mL样品，富集时间在30秒一90分钟，富集温度在20-45°C ，本发 明可用任何一种合成的表面固定不同金属离子的磁性纳米粒子，其溶液分散性非常好，体 系均匀稳定，有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。
本发明的表面固定有金属离子的氨基磁性纳米粒子的合成方法简单有效并具有很好 的磁场感应性；可对磷酸化肽进行有效选择性富集；富集过程无需离心分离，采用磁场作 用就可实现材料和样品的分离；与基质辅助激光解析离子化质谱有很好的相容性，被固定 金属离子磁性纳米粒子吸附后的样品无需样品洗脱步骤可直接进行基质辅助激光解析电 离-飞行时间质谱分析，避免了洗脱过程造成的样品损失；方法简单有效。本发明可对低至 2 fmol/^L级的复杂肽段混合物中的磷酸化肽实现高选择性富集，富集效率提高一个数量级 以上；釆用富集到的磷酸化肽样品可进而实现磷酸化位点的鉴定。该材料的合成及应用为 磷酸化肽段的富集提供了新的方法，并扩展了磁性纳米材料的实际应用，在蛋白质组学翻 译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。
图1为水热法合成的氨基磁性纳米粒子的透射电镜图(a)和扫描电镜图(b)。 图2为表面羧基化磁性纳米粒子材料水热法合成的透射电镜图(a)和扫描电镜图(b)。 由图1和2可见氨基磁性纳米粒子和表面羧基化磁性纳米粒子皆具有很好的均一性 和分散性。
图3氨基磁性纳米粒子和表面羧基化磁性纳米粒子的磁滞回线图。可见化学修饰前后 磁性纳米粒子都具有很好的超顺磁性。
图4为氨基磁性纳米材料(a)和表面羧基化磁性纳米粒子(b)的傅立叶变换红外谱 图。将两者的红外图谱比较可见，经过表面修饰后我们成功制备了表面羧基化的磁性纳米 粒子。
图5为表面固定有金属离子的氨基磁性纳米粒子的合成路线图。
图6为50吗表面固定F^+离子的氨基磁性纳米粒子富集2Xl(r8 MP-casein的胰蛋 白酶酶解混合肽段的前后的MALDI-TOF MS谱图(a和b)。比较a和b图可见磷酸化肽 富集效率均超过一个数量级以上。
图7为50吗表面固定F^+离子的氨基磁性纳米粒子富集2xl(^M casein蛋白的胰蛋 白酶酶解混合肽段前后的MALDI-TOF MS谱图(a和b)。比较a和b图，可见肽段混合 物中的磷酸化肽得到了选择性富集。
具体实施例方式
通过实施例是对本发明所提供的超顺磁性的表面固定F^+离子的氨基磁性纳米粒子材 料进行样品富集和基质辅助激光解吸离子化/质谱直接分析过程的进一步说明。 实施例1表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子的合成
氨基四氧化三铁表面固定金属离子的磁性微球材料的合成共分为三步。 首先，采用水热法合成氨基四氧化三铁磁性纳米材料1.0gFeCl—H20溶于30mL乙 二醇中，磁力搅拌0.5 h得到黄色透明溶液。然后加入4.0 g无水NaAc，磁力搅拌0.5 h 后，加入3.6 g 1，6-己二胺，再磁力搅拌0.5h后，得到褐黄色透明溶液。将所得溶液转入 200 mL的Teflon-lined不锈钢反应釜中。放于烘箱，200 °C，放置12小时。50°(]真空干
其次，在氨基磁性纳米粒子表面进行化学修饰在双颈圆底烧瓶中将0.3 g氨基四氧
化三铁磁性纳米材料分散于60 mL无水甲苯和10 mL吡啶的混合液中超声分散；然后往 该密闭体系中注入10mL己二酰氯，反应4h。磁场分离收集产物。然后，将最终材料分 散于40mL无水甲苯中；然后往该混合液中加入10mLIDA，反应4h。磁分离收集产物， 真空干燥备用。
最后，将金属离子固定在氨基四氧化三铁磁性纳米材料表面将上述得到的产物分散 在20mL浓度为0.2M的氯化铁(FeCl3)水溶液中，分散液振荡2 h。 60'C真空干燥过夜
备用o
实施例2肽段混合物中磷酸化肽的选择性富集和质谱测定
取200pL浓度为2X10-SM酪蛋白的胰蛋白酶酶解的肽段混合物，加入5 浓度为 10mgml/1的表面固定F^+的氨基四氧化三铁磁性纳米材料分散，用乙酸调节体系pH值 为2; 37。C下分别孵育15 min。在磁场作用下，去除上清溶液；采用pH值为2的50%ACN 溶液清洗材料(用乙酸调节)，去除上清。在沉淀中加入10pL的50% (体积比)的乙腈 水溶液，振荡使之悬浮。悬浮液0.5pL与等体积30 mg mU1 2，5-DHB (50%乙腈水溶液，v/v) and 1% (v/v) H3P04水溶液，1:1 (v/v)混合点至MALDI耙板上，在MALDI-TOF/TOF (4700
Proteomics Analyzer, Applied Biosystems);激光器为Nd-YAG激光，波长355nm， 激光脉 冲频率200Hz;加速电压20KV;正离子模式，反射式TOF检测。由图6a和6b所示，磷 酸化肽段得到了有效选择性富集。 实施例3
调整采用的混合肽段样品是200 浓度为2xl(T7 M的Casein蛋白的胰蛋白酶酶解的 肽段混合物，其他条件同实施例l，进行选择性富集浓縮和质谱实验。实验结果如图7a和 7b所示。复杂肽段混合物中的磷酸化肽段得到了选择性富集。 实施例4一5
调整0 -酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物的浓度为2X 1(T7M和2X 10—9M，其他条件 同实施例2，重复上述选择性富集浓缩和质谱实验。 实施例6—8
调整吸附时间为30秒，15分钟，60分钟，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓 縮和质谱实验。实验结果表明表面固定F^+的氨基四氧化三铁磁性纳米材料在30秒的时间 时就能实现对磷酸化肽段的有效富集。 实施例9_10
调整吸附温度为20， 45度，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓縮和质谱实验。 实施例11一12
调整吸附体系pH值为4， 6，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓縮和质谱实验。 实施例13—17
调整采用的材料表面固定的金属离子分别是Al3+、 Ga3+、 In3+、 Ce3+、 Zr4+，其他条件 同实施例2，进行选择性富集浓縮和质谱实验。 实施例4-17所得结果与实施例2相似。
权利要求
1、一种表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子，其特征在于是先采用水热法合成氨基四氧化三铁磁性纳米材料，然后与己二酰氯反应，继而再与亚氨基二乙酸反应对其表面进行化学修饰，生成表面带有羧基的磁性纳米材料，进而固定金属离子而获得，其结构如下式所示式中，1表示氨基四氧化三铁磁性纳米粒子；M表示表面固定的金属离子；这里金属离子M为Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、Ce3+或Zr4+。
2、 一种如权利要求1所述的表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)用水热法合成表面带有氨基的超顺磁性纳米粒子采用1.0—5.0克FeCl3'6H20 为原料，以20—80mL乙二醇为分散体系，添加2-6克无水乙酸钠，反应温度为190—210 'C，反应时间为6—18小时，生成表面带有氨基的四氧化三铁磁性纳米粒子,其粒径是30(2)在磁性纳米粒子表面进行化学修饰固定金属离子将0.2—0.6g氨基四氧化三铁 磁性纳米材料分散于40—80mL无水甲苯和5—20mL吡啶的混合液中超声分散；然后往 该密闭体系中注入5—20mL己二酰氯，反应3—6h;在外加磁场作用下，收集产物，并 用无水甲苯清洗；将最终材料分散于30—60mL无水甲苯中；然后往该混合液中加入5 — 20mLIDA，反应3—6h;最终产物经磁分离收集，用无水甲苯清洗。
3、如权利要求1所述的表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子作为微吸附剂的应用， 其特征在于直接将所述磁性纳米粒子加入含有磷化肽的复合肽段混合物中，进行痕量磷酸一画nm; 化肽选择性富集，富集后采用磁场对磁酸化肽和其他样品进行分离；富集体系pH值为1 —6，样品浓度为2X10—7 —2X10力M，富集时间为30秒—90分钟；富集温度为20—45°C ， 超顺磁性纳米粒子量是50-1000 ^g/ m L样品。
全文摘要
本发明属于无机材料和生化分析技术领域，具体为一种表面固定金属离子的氨基磁性纳米粒子及其制备方法和应用。该磁性纳米粒子是先合成表面带有氨基的磁性纳米材料，然后采用己二酰氯继而采用亚氨基二乙酸对其进行表面化学修饰，进而固定金属子而获得。该固定金属离子的磁性纳米粒子作为微吸附剂，比表面积大，可进行复杂肽段混合物中痕量磷酸化肽段的选择性富集，方法简单有效。本发明可对低至2fmol/μL级的复杂肽段混合物中的磷酸化肽实现高选择性富集，富集效率可提高一个数量级以上。该材料在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的应用前景。
文档编号B22F1/02GK101104526SQ200710041500
公开日2008年1月16日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者宁 姚, 张祥民, 徐秀青, 邓春晖 申请人:复旦大学