一种氨基功能化磁性纳米粒子分离溶菌酶的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明设计一种氨基功能化磁性纳米粒子分离溶菌酶的制备方法，特别设计一种利用磁性纳米吸附材料从蛋清中分离溶菌酶的方法，属于精细化工技术领域。
【背景技术】
[0002]溶菌酶又称胞壁质酶，其化学名为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，由一条多肽链组成，分子内有4个二硫键交联，结构非常稳定，并且耐酸碱，在pHl.2-11.2范围内剧烈变化仍能保持良好的稳定性，对热也极为稳定，在PH3.0条件下，沸水浴中加热60min仍保持90%以上。1907年，Nicolle最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Laschtschenk指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶。紧接着Fleming和Meyer等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。
[0003]不同来源的溶菌酶分子大小不一样，其氨基酸排列顺序也有所不同，因此，它们的理化性质有很大差别。例如，T4噬菌体溶菌酶由164个氨基酸组成，分子量为19kDa ;鸡蛋溶菌酶只有129个氨基酸，其分子量约为14.3kDa ;植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24kDa-29kDa。各种溶菌酶的等电点在10.7-11.5之间。其中，人们研究最深入的是鸡蛋蛋清溶菌酶。
[0004]溶菌酶的用途很多，是一种安全性高的食品添加剂，可以作为防腐、保鲜剂，广泛应用于乳制品、低度酒、饮料、水产品、肉类制品和糕点等的防腐保鲜；在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，广泛应用于临床医学，溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒的功效。
[0005]随着生活水平的提高和科学技术的进步，在药物和食品中添加化学药品开始被许多国家限制，因此具有天然活性的溶菌酶因其高效且安全而深受关注。溶菌酶研究虽然在我国起步较晚些，但国家近20年投入了巨大人力和财力对溶菌酶的分离提取及开发应用进行了大量的研发工作，尤其上世纪有关蛋清溶菌酶技术的研究多次被列为国家级重点攻关项目。然而，与国外相比，我国的溶菌酶制造业规模仍然有较大差距，生产技术仍相对落后。因而目前国内高活性蛋清溶菌酶的生产供应还不能满足我国日益增长的需求。
[0006]功能性磁性纳米颗粒是以合成的化学高分子物质，天然高分子物质或无机物材料作为壳体修饰材料，通过物理、化学方法吸附或包埋Fe304所形成的具有核/壳结构且粒径在纳米级的功能性磁性纳米颗粒，并且可以在外加磁场的作用下进行快速的分离、定位及导向。功能性磁性纳米颗粒表面特定的功能基团(如0H、C00H、CH0、順2等)对Fe 304起到保护作用，防止其氧化，漏磁。此外，粒径小于30nm的磁性颗粒具有超顺磁性，称为超顺磁性纳米颗粒；超顺磁性纳米颗粒具有较强的磁响应性，在外加磁场的作用下，磁性颗粒可以快速富集、定位，当外加磁场消失后，磁性的也随之消失。因此，研究磁性纳米材料对蛋白质的吸附分离已成为国内外重要的研究课题。
【发明内容】
[0007]本发明是为解决常规溶菌酶提取过程中，低温分离低，高温易变性等缺点，提出了采用表面修饰氨基的磁性Fe304纳米粒子来吸附分离蛋清中的溶菌酶。
[0008]本发明的技术方案由以下部分组成。
[0009]1)磁性Fe304纳米粒子的制备:将硫酸亚铁和氯化铁溶解在水中，室温下，在氮气保护下，想其中逐滴加入25%的氨水，搅拌反应30min后升温至70°C，继续搅拌30min后冷却，用磁体分离固体粒子，用去离子水反复冲洗，最终得到磁性Fe304纳米粒子。反应原理如式1所示。
[0010]Fe (II) +2Fe (III) +80H = Fe 304+4H201
[0011]2)氨基功能化磁性Fe304纳米粒子的制备:将磁性Fe 304纳米粒子放入无水的甲苯中，超声作用15min，在氮气保护下，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下搅拌5h，用磁体收集磁性粒子，用乙醇和二氯甲烷反复冲洗后干燥，即可得到氨基功能化的磁性纳米粒子。
[0012]3)鸡蛋清溶菌酶吸附:取新鲜鸡蛋的蛋清，向其中加入磷酸盐缓冲溶液(pH =7.0)，在冰水浴条件下搅拌6h，分离上层白色絮状沉淀，在4°C下冷冻离心，除去不溶性沉淀，所得上清液作为溶菌酶分离的蛋清原料液。
[0013]4)溶菌酶的分离:将吸附饱和的氨基功能化磁性纳米粒子加入磷酸盐缓冲液(20nmol, pH = 8.0, lmol/L NaCl)，放置于恒温振荡器中振荡洗脱2h。经磁性分离得到洗脱液，放入4 °C冰箱中。
[0014]上述3)中的鸡蛋清液与磷酸盐缓冲液的体积比例为lmL: lmL ;氨基功能化磁性纳米粒子与蛋清溶液的比例为lg:(100-150)mL。
[0015]本发明采用的氨基功能化磁性纳米粒子具有纳米尺度结构，比表面积很大，实现大容量的吸附；磁性颗粒能够强化分离速度实现快速分离过程。因此，本发明制备的氨基功能化磁性纳米粒子能够从蛋清液中通过吸附-解吸作用选择性的分离溶菌酶。该分离方法对蛋清溶菌酶的提取分离方法简单，条件温和，对溶菌酶影响较小，吸附量大。该材料可以多次重复利用。
[0016]下面结合实例对本
【发明内容】
进行描述。
【附图说明】
[0017]图1、2本发明制得的氨基功能化磁性纳米粒子SEM照片；
[0018]图3、4本发明制得的氨基功能化磁性纳米粒子TEM照片；
[0019]图5本发明制得的氨基功能化磁性纳米粒子红外光谱图；
具体实施例
[0020]实施例1
[0021]将3g Fe Cl2.4H20和8.lg FeCl3.6H20溶解在200mL去离子水中，室温下，在氮气保护下，向其中逐滴加入85mL 25%氨水，搅拌30min后升温至70°C继续搅拌30min，冷却到室温后用磁体收集，用去离子水多次冲洗，干燥，得到磁性Fe304纳米粒子。将4g磁性Fe304纳米粒子放入50mL无水甲苯中，超声作用15min，在氮