用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒、其制备和用图

用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒、其制备和用图
【专利摘要】描述了磁性纳米颗粒，其表面用儿茶酚功能化；和构建体，所述构建体包含封装在生物相容的聚合物基质中的多个所述纳米颗粒，其中具有治疗作用的分子任选地被分散，所述聚合物基质任选地转而被进一步功能化；还描述了免疫系统的细胞，所述免疫系统的细胞并入所述聚合物构建体以引起它们的工程化。
【专利说明】用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒、其制备和用途 发明领域
[0001] 本发明涉及功能化的纳米颗粒、其制备以及其用途的领域。 现有技术
[0002] 已知磁铁矿(magnetite)是具有铁磁特性的矿物质，其化学式是Fe3〇4(有时也写作 FeO · Fe2〇3) 〇
[0003] 众所周知，呈纳米颗粒形式即具有范围从几纳米到几十纳米的尺寸的磁铁矿，如 果被浸没在无线电波范围内的可变磁场中，与电磁场相互作用，且然后向其周围的事物释 放热能，因此产生所谓的过热作用或磁过热疗法。
[0004]在肿瘤学中，开发过热疗法以改进化学疗法或放射疗法的功效;事实上，将实体瘤 的温度升高在41°C和45°C之间诱导了肿瘤细胞的凋亡;通常，这借助于用达到适当温度并 且在受到肿瘤块影响的部位附近循环的液体洗涤来应用。
[0005] 近期，采用了天线，所述天线直接插入到肿瘤块中，产生微波，并且因此与水的偶 极分子相互作用，产生过热。
[0006] 这些治疗通常是极具侵入性的并且具有差的功效(在第一种情况下），并且在第二 种情况下没有避免可能的负面作用诸如转移的风险、组织坏死等。
[0007] 使用到达紧邻肿瘤组织处或优选地渗透进入癌细胞的磁性纳米颗粒，克服以上问 题并且实现高效的过热作用是可能的，所述过热作用以细胞水平被定位。
[0008] 将纳米结构特定地递送到实体瘤的肿瘤细胞中、或病理组织上或诸如阿尔茨海默 病的淀粉样斑块的部位上、或多发性硬化的受损组织上，以有效的方式并且无副作用地传 递多个配合的治疗诸如过热疗法和药理学治疗因此是可能的。
[0009] 在文献中，存在杂化的无机聚合物或蛋白纳米颗粒的许多实例，所述杂化的无机 聚合物或蛋白纳米颗粒包含生物相容的纳米颗粒磁铁矿核心以及为聚合物或蛋白的包衣， 所述包衣可能装载有药物并且在表面上用合适的靶向剂功能化。
[0010] 这些纳米颗粒是潜在的治疗诊断剂，其中在电磁EM场的作用下产生热的能力（过 热作用）、药物递送(DD)的可能性以及在其与成像技术(MRI)作用期间被识别出的能力被协 同地组合。
[0011] 国际专利申请W0 2004/071386描述了由单层或双层脂质体微胶囊组成的化合物， 其含有磁性纳米颗粒和生物活性分子，具有到达并治疗肝脏肿瘤的主要目标。
[0012] 在欧洲专利EP 1 979 365中，
【申请人】已描述了由用双功能分子功能化的纳米级磁 性颗粒组成的构建体，其中所述分子的一端与磁性颗粒的表面结合，而另一端是游离的并 且因此能够与用于在制药和诊断领域中使用的复合单元诸如生物聚合物、环糊精、抗体和 药物反应，允许获得纳米颗粒/粘合剂复合物，其中存在纳米颗粒的完全且紧实的包衣而不 显著改变依赖于其的特性(例如光学或磁性特性）。
[0013] 随后的专利EP 2 117 600描述了构建体，其中功能化的颗粒与在以上专利EP 1 979 365中描述的那些类似，用聚合物包覆，其中具有药理特性的分子可能已被分散。
[0014] (姓名为同一
【申请人】的）欧洲专利申请2 512 992还描述了多元醇合成方法，其允 许容易地获得具有均匀且受控制的尺寸的磁铁矿纳米颗粒(其因此具有高的过热疗法功 效)。
[0015] 因此，如可以看出的，在文献中已经提出许多解决方案用于解决在体内选择性地 指导颗粒的问题，所述颗粒能够通过单独地或与传统药物联合地应用过热疗法而执行治疗 作用;但是，已知的产品由于多种尚未克服的问题而未完全满足用纳米结构实现肿瘤和其 他疾病的有效治疗的应用需求。
[0016] 第一个问题是纳米结构的特异性，事实上，从文献已知，杂化的无机聚合物/蛋白 颗粒当被全身施用时从网状内皮系统快速消除（网状细胞、巨噬细胞、枯否氏细胞(Kupffer cell)) 〇
[0017] 因此，纳米结构的清除是以全身水平的纳米治疗诊断治疗的无效的原因；已经进 行多种尝试来克服该困难，包括用递送单元诸如单克隆抗体、肽和活性分子(诸如糖等等） 使纳米颗粒聚合物/蛋白表面功能化，但是还是在这种情况下，大多数颗粒被网状内皮系统 消除，且仅少量到达有关部位:肿瘤组织和癌细胞。
[0018] 第一个问题的结果，第二个问题是到达肿瘤或病理组织的磁性颗粒的量可以证明 不足以进行有效的过热作用。
[0019] 最后，目前的纳米治疗诊断系统在生物流体中具有差的稳定性，并因此趋向于形 成不可能渗透至肿瘤块中或逾越完整的血脑屏障的大的聚集体(高至超过500-1000nm)，这 使靶细胞中这些系统的特定靶向性变得更差，进一步限制了治疗的效率。
[0020] 从文献已知的是，免疫系统内的T淋巴细胞是抗肿瘤应答的主要角色。
[0021] T淋巴细胞由于它们的被称为TCR的特异性受体而能够选择性地识别肿瘤细胞。只 有抗原通过由单核细胞、巨细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、小神经胶 质细胞或还有B淋巴细胞代表的细胞来呈递时，才可以发生T淋巴细胞通过各自的肿瘤抗原 肽的活化。
[0022] 对于有效的T淋巴细胞活化而言，除了抗原之外，还需要膜信号和可溶性信号。在 可溶性信号中，最强有力的活化因子是白细胞介素2(IL_2)，而在膜信号中，最强有力的是 分子B7〇
[0023] 肿瘤被识别后，其通过多种机制被淋巴细胞破坏，在这些机制中，主要的机制是： 与穿孔素关联的细胞毒性机制(cytotoxic machinery)和与Fas配体关联的细胞毒性机制。 [0024]黑素瘤是与由T淋巴细胞介导的强烈的局部免疫应答相关的第一肿瘤之一，并且 这些年来，证明强烈的τ-淋巴细胞应答与较好的预后相关已成为可能。
[0025] 通过纳米颗粒的使用，开发一种新的定制的抗癌策略是可能的，该抗癌策略基于 专门杀伤肿瘤的装备有纳米颗粒的T淋巴细胞的使用，所述T淋巴细胞在通过激光/电磁场 活化后易于击中肿瘤。
[0026] 此外，文献广泛地描述了在神经系统的疾病诸如多发性硬化、阿尔茨海默病中由 免疫系统、并且特别地由淋巴细胞和炎性细胞发挥的作用。
[0027]多发性硬化确实是自体免疫性疾病的原型，在其发病机理中，由T淋巴细胞发挥关 键作用（Elliot M.Frohman，M.D.，Michael K.Racke，M.D·，和Cedric S.Raine，N Engl J Med 2006; 354:942-955)。特别地，能够产生重要的炎性细胞因子诸如干扰素-γ和淋巴毒 素的τ-辅助细胞(称为I型τ-辅助细胞(Thl))，还有T淋巴细胞⑶8、B淋巴细胞和单核细胞系 的免疫细胞是非常重要的。另外，在阿尔茨海默病中（Henry W. Querfurth，和Frank M.LaFerla，N Engl J Med 2010;362:329-344)，重要的致病作用通过涉及以下的炎性机制 来进行：由于淀粉样蛋白通过小神经胶质细胞和星形胶质细胞产生白细胞介素1、白细胞介 素6、肿瘤坏死因子α;因此，根据本发明的纳米颗粒还能够在这些疾病的治疗中发挥重要作 用。
[0028] 附图简述
[0029] 图1示出用以STEM模式的场发射枪扫描显微镜拍摄的、通过在聚合物基质内的根 据本发明的纳米颗粒取得的典型的簇形成。
[0030] 图2示出磁性颗粒和金纳米棒的混合物构建体。
[0031] 图3示意性地示出由磁铁矿的纳米颗粒或磁铁矿和金纳米棒组成的并且包覆有嵌 段聚合物PLGA-b-PEG-C00H的构建体模型。
[0032] 图4示出根据本发明的纳米结构构建体的逐步制备过程的布局。
[0033]图5示出用于纯化和选择淋巴细胞的过程的布局。
[0034] 图6示出用光学显微镜拍摄的装载有根据本发明的纳米颗粒的单核细胞/巨噬细 胞的照片。
[0035] 图7和图8示出与NH2-PEG-C00H辄合的聚合物PLGA-NHS的lH-NMRo
[0036] 图9示出根据本发明的产物的UV-Vis光谱。
[0037] 图10示出对根据本发明的产物进行的BCA测试。
[0038] 发明概述
[0039] 描述了磁性纳米颗粒，其表面用儿茶酚功能化;和构建体，所述构建体包含封装在 生物相容的聚合物基质中的多个所述纳米颗粒，其中具有治疗作用的分子任选地被分散， 所述聚合物基质任选地转而被进一步功能化。惊奇地发现，所述聚合物构建体能够被并入 免疫系统细胞中以引起其工程化。
[0040] 发明详述
[0041] 现在已经惊奇地发现，包含封装在生物相容的聚合物基质中的用儿茶酚功能化的 多个磁性纳米颗粒的构建体能够克服以上问题，确保在生理介质和在人类血液中的必需的 稳定性。
[0042] 此外，与通过在以上专利中描述的单分散的无机核所示的过热作用相比，这些构 建体的结构特征帮助确保实施的过热作用；这种优势归因于磁性颗粒的所谓的"簇结构" (参见图1)，所述磁性颗粒倾向于在聚合物基质内的多个颗粒的结构中心中结合，进行对过 热特性的协同作用。
[0043] 根据本发明用儿茶酚使磁性颗粒功能化对于产生以上簇结构是必需的，并因此允 许获得关于过热特性和随着时间推移的稳定性的比现有技术中已知的那些构建体优越的 多的构建体。
[0044] 在磁性颗粒中，磁铁矿是特别优选的。如果优选，根据本发明的构建体除了如上所 描述的磁性纳米颗粒之外还可以具有多个金纳米棒(参见图2)。
[0045] 通过施加红外线激光辐射诸如通过C02激光器产生的红外线激光辐射，纳米棒的 存在允许可观的过热作用，该过热作用有助于进一步增强由磁铁矿的簇结构赋予的过热作 用。
[0046]这使得组合的激光和无线电波系统得以实现，所述系统对表面区域或可以经由探 针到达的那些区域使用激光，而对深的区域使用无线电波。
[0047]磁性纳米颗粒可以通过已知的多元醇法来制备，如例如在以上的欧洲专利申请 2512992中所描述的，所述申请描述了制备方法，在该制备方法中：
[0048] i)从FeQ开始制备Fem的多元醇溶液；
[0049] ii)在多元醇合成条件下制备磁铁矿纳米颗粒；
[0050] 以上步骤（i)是熟知的并且描述的根据以下方程式的酸(还有弱酸诸如乙酸)对铁 的攻击的反应：
[0051] Fe°+2H+^ Fe2++1/2H2T
[0052] 其后，在低于100°C的温度的反应环境中通过吹气和添加 H202 ,使Fe11在多元醇中 的溶液完全氧化成Fem (例如乙酸盐)是可能的。
[0053]金纳米棒以已知的方式在以下多种添加剂的存在下从离子形式的金开始用微波 辅助的合成来制备:烷基三甲基溴化铵，CnTAB n = 10-16;氯化十六烷基吡啶，C16PC;和PVP [就此而言，参见M. Tsu ji，K .Matsumoto，T · Tsu ji，H. Kawazumid，Mater .Lett.59(2005) 3856]或通过在CTAB和AgN03的存在下用抗坏血酸还原HAuCl4来制备(就此而言，参见Ratto F.等人J NANOPARTICLE RESEARCH 2010和[Ratto F.等人J NANOPARTICLE RESEARCH 2012)。
[0054] 如上所描述地获得的磁性颗粒和/或磁光颗粒的表面用儿茶酚(双官能团）通过以 下功能化:利用极性基团0H对颗粒的表面的亲和力并且允许未结合至颗粒表面的末端部分 保持适合于随后并入聚合物/蛋白基质中的疏水性反应性。
[0055] 根据本发明的聚合物基质被理解为由生物可降解的共聚物组成，并且因此能够允 许药物的释放，该释放必须随着基质在生理环境中的降解而逐渐地进行。
[0056] 用于该目的的合适的共聚物的实例是:生物可降解的纳米胶束、聚酯、聚酯、聚氨 酯、聚碳酸酯和聚谷氨酸、聚醚胺和聚谷氨酸苄酯。
[0057]特别地优选的是生物可降解的纳米胶束，其由聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙二醇 羧酸酯的嵌段共聚物(PLGA-b-PEG-C00H，MnPLGA范围=44-1 OkDa，MnPEG = 2-3kDa)组成，具 有式(I)
[0059]其中 m=[117-330];n=[117-330];p = [60-100]。
[0000]该产物是已知的并且在Drug Delivery的多种其他工作中已经被采用，还在临床 阶段I (Clinical Phase I)的层面用于测试抗癌剂(参见X. Shuai等人，2004和X. Shuai， H.Ai,N.Nasonkla,S.Kim,J.Geo,J.Controlled Release,2004,98,415)〇 [0061]事实上，聚合物具有允许组装纳米球系统的特征，具有由PLGA的残基保证的疏水 性内部区域和由PEG-COOH的末端赋予的亲水性外部区域(参见图3)。
[0062] 该双重特征允许纳米球将有机活性成分捕获在疏水性部分且由于亲水性部分在 水溶液中被分散。
[0063] 如果需要的话，聚合物可以与具有治疗作用的分子混合，所述具有治疗作用的分 子根据已知的方法且如在下面给出的实施例中阐明的被分散在聚合物基质中。
[0064]根据本发明的具有治疗作用的分子的实例是例如抗癌药物(紫杉烷、吉西他滨、长 春新碱等等）、过氧亚硝基清除剂、超氧化物歧化酶抑制剂、维甲酸(蓓萨罗丁）、细胞因子诸 如白细胞介素1 〇、TLR-配体诸如能够活化TLR2的HP-NAP分子、阿司匹林。
[0065]另外，胶束的PEG-C00H片段的羧酸功能允许与单克隆抗体、蛋白、肽或感兴趣的活 性分子(例如，荧光染料)的化学稳定键合，用于通过细胞过表达物的特异性识别。
[0066] 在可用于根据本发明的功能化的抗体中，我们可以提到hERG、hEGFR、I gG、m〇Ab等 等。
[0067]实施例（参见实施例10)描述了以上的功能化，特别是使用在意大利专利IT 1， 367,861中描述和要求保护的特异性单克隆抗体hERGl的功能化。
[0068]特别地，hERGl是由杂交瘤产生的针对蛋白HERG1的细胞外部分S5-孔的特异性单 克隆抗体，所述杂交瘤包含在属于鼠赘生性细胞系NS0的永生化细胞和通过用序列 EQPHMDSRIGWLHN的肽免疫小鼠获得的淋巴细胞之间的融合的产物。
[0069] 通过进行纳米沉淀来制备根据本发明的构建体(在下文中也被称作"纳米生物反 应器"或"NBR"），该构建体含有用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒，其中通过批量或连续合成 在混合池中以恒定流动混合以下两种液体：
[0070] -溶解于溶剂中的聚合物的有机溶液，所述溶解于溶剂中的聚合物的有机溶液与 用有机粘合剂包覆的纳米颗粒的悬浮液混合，所述聚合物和所述用有机粘合剂包覆的纳米 颗粒二者在相同的溶剂中，
[0071] 和
[0072] -Na2HP〇4 的水溶液（ImM)。
[0073] 对于批量合成，在单一步骤中，用注射器将含有聚合物和颗粒的有机悬浮液注射 在水溶液中，而不进行磁力搅拌。
[0074] 对于连续合成，准备双联蠕动栗系统以进行将有机溶液添加到含水的流(有机体 积/水的比1/10)。相应的管直接地从含有有机悬浮液（具有功能化的颗粒和聚合物）和 他 2冊031禮(?!17.4)的溶液的呼吸器(111即）中抽取溶液。
[0075] 获得杂化颗粒（由用包括在聚合物中的儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒组成）的分 散体后，有机溶剂的一部分经由旋转蒸发器去除以便在后续的制备步骤中使有机相的量最 小化。
[0076]然后，将悬浮液对水溶液Na2HP03透析以用于去除有机相并且浓缩到可能获得从 0.1 % w/w到1 % w/w的浓度的最小体积。
[0077]通过第二次浓缩，通过膜透析获得更加浓缩的产物是可能的，所述更加浓缩的产 物具有取决于用途的范围从5 X到20 X的理论浓缩系数。然后，用0.22μπι的过滤器过滤产物 以去除细菌负荷(bacterial load)。如果用21-24kA/m的交变磁场和160-190kHz的频率辐 射30分钟，那么产物具有优异的过热效率，其温度升高了至少5°C。
[0078] 本文描述的方法允许制备具有集中在从30nm到60nm的范围内的尺寸分布的构建 体。
[0079] 测量以掌握关于悬浮液的静电稳定性及其离子强度的信息的由此获得的产物的 电势马尔文纳米粒度电位分析仪_S(Malvern Zetasizer nan〇-S))低于_30mV，这意味着 这些颗粒受到羧基产生的负表面静电斥力的影响，所述羧基在(生理的)pH 7.4下被部分地 去质子化。
[0080]以上描述的实验条件允许制备具有在稀释到通常用于细胞培养物的培养基 (DMEM、RPMI)中之后的良好稳定性的悬浮液，所述悬浮液在因稀释引起的离子强度条件的 明显变化后还表现出聚集和沉降的小的趋向性。
[0081]获得在表面上利用用于靶向递送和用于在成像技术中使用的单克隆抗体和/或荧 光染料(例如Cyanine?、Dylight?等等)功能化的产物需要使用NBR作为前体，然后其经 历第二次浓缩过程(参见上文）。
[0082] 通常地，在此阶段，产物具有约0.05 % wt. -0.1 % wt.的浓度的无机材料。
[0083] 初始加工步骤用活化剂诸如EDAC[1-乙基-3-(-3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸 盐](摩尔比m)AC/C00H= 10/1)和磺酸基_NHS(NHS/C00H= 1/1)提供聚合物的末端羧基的活 化，该聚合物的末端羧基朝向纳米颗粒的外部部分暴露，与极性相接触，以便促进随后的通 过单克隆抗体和/或荧光染料的末端胺基团的酯化的攻击。
[0084]在具有λ600-800ηπι的发射的荧光染料的情况下（适合于体内NIR成像应用），因为 仅NHS酯-末端分子是市场上可得的，所以必需提供中间步骤，在该中间步骤中，添加二氨 基-末端连接物用于一方面与荧光染料桥连接(bridge link)，以及另一方面与活化的聚合 物的羧基桥连接。
[0085]纳米颗粒的表面被活化后，添加抗体和/或氨基-末端染料溶液，并且保持静止。 [0086]然后，悬浮液被浓缩并且对含水的Na2HP03透析，并且取决于用途被浓缩到高至 0.2-1.0%wt.的无机相。
[0087]然后，用0.22μπι的过滤器过滤产物以去除细菌负荷。
[0088]本文描述的方法允许制备具有集中在从40nm到70nm的范围内的尺寸分布的构建 体。
[0089] 测量以掌握关于悬浮液的静电稳定性及其离子强度的信息的由此获得的产物的 电势ξ(马尔文纳米粒度电位分析仪-S)低于_30mV，但是高于在NBR产物上测量的值，这意味 着由初级产物(raw product)的羧基产生的负电荷被结合的抗体/染料部分地中和。
[0090] 使用BCA?测试分析与颗粒结合的抗体的含量：向含有蛋白分析物的溶液添加 合适的试剂后，产生Cu2+的络合物，用光谱分析观察到该Cu 2+的络合物在562nm的着色，并且 使用线性校正从其导出抗体的浓度。
[0091] 通过本文描述的程序，例如产生用moAb功能化的纳米颗粒是可能的，具有相比于 无机相含量在5 % wt和30 % wt之间的moAb攻击百分比。
[0092] 纳米生物反应器/亲脂性药物（下文中NBR_PTX)和纳米生物反应器/抗体/亲脂性 药物(NBR_hERG_PTX)系统(其中亲脂性药物例如是紫杉醇）的制备与如以上所描述的纳米 生物反应器的合成过程完全相同，并且因此提供了将之前用儿茶酚功能化的无机纳米颗粒 封装在基于PLGA-b-PEG-C00H的聚合物基质内。该过程的仅有改变提供了特定量的药物在 聚合物和功能化的纳米颗粒的悬浮液内的溶解。
[0093] 然后，使用纳米沉淀方法获得装载有紫杉醇的纳米生物反应器(NBR_PTX)，其中将 前面提到的有机溶液剧烈地添加到混合池内的Na 2HP04 ImM的水溶液。从批量合成到连续合 成，不存在悬浮液的形态特征的变化。应用的纯化、过滤和浓缩方法与如以上所描述的相 同。
[0094] 对于产物表征，除了确定平均颗粒直径、它们的电势ξ和无机相的浓度之外，封装 的活性成分的量也通过高效液相色谱被确定。
[0095]然后，由此获得的和表征的产物可以在表面上用靶向单元诸如（hEGR、hEGFR、 IgG、...）被进一步功能化。
[0096]为了这个目的建立的方法准确地遵循如以上所描述的纳米生物反应器NBR_moAb 的靶向程序。
[0097]事实上，其提供了用活化剂诸如EDAC和磺酸基-NHS活化存在于聚合物上的羧基的 初始步骤和与单克隆抗体反应的步骤，所有步骤根据与在之前关于NBR_m〇Ab描述的程序中 列出的相同的比例。
[0098]然后进行通常的纯化和表征程序。由此获得的纳米颗粒悬浮液的特征为在45nm和 55nm之间的平均流体动力学直径，同时电势ξ远低于-30mV。
[0099] 根据本发明的另外的实施方案，如以上定义的构建体可以被并入免疫系统的细胞 中，作为用蛋白或用抗体的修饰物(decorat i on)的替代物。
[0100] 令人意外地，如以上所描述的包含用儿茶酚功能化的且用聚乳酸-乙醇酸共聚物 和聚乙二醇羧酸酯的嵌段共聚物（PLGA-b-PEG-C00H，MnPLGA范围=44-10kDa，MnPEG = 2-3kDa) 包覆的磁铁矿颗粒的簇的构建体容易地被免疫系统的细胞并入而不损害它们的功能 和活力。
[0101] 免疫系统细胞通过引入根据本发明的构建体被工程化后，这些免疫系统细胞可以 用于诊断肿瘤疾病、中枢神经系统的退行性疾病(例如阿尔茨海默病）、心脑血管疾病和传 染病、移植、自体免疫性疾病，并且还用于治疗肿瘤、心脑血管疾病、退行性疾病(例如阿尔 茨海默病）、传染病、移植、肝硬化和涉及纤维发生的其他状况、特征在于多次流产的疾病、 子宫内胎儿死亡、新生儿疾病、先天性和获得性凝血功能障碍、遗传疾病、自体免疫性疾病， 并且最后用于疼痛缓解。
[0102] 释放的诱导可以通过不同的方法进行，诸如特定抗原（例如在治疗黑素瘤的情况 中的MAGE-3、在治疗多发性硬化中的M0G或髓磷脂抗原等等），或通过合适的免疫调节物质 诸如IL-2、⑶40配体、TLR-激动剂、脂质体、免疫刺激复合物(ISC0MS)进行。
[0103] 应注意，事实上，免疫系统的细胞的重要特性通过它们到达身体的几乎所有区域 的能力来体现，因此，它们作为载体以到达特定区域的用途超越了由治疗的低特异性体现 的纳米治疗诊断的大的现有局限性，该载体通过根据本发明的构建体携带目的区域 (destination)所需的特定产物。
[0104] 可用于以上目的的免疫系统的细胞例如选自：
[0105] T-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、B-淋巴细胞、嗜中性 粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γ s细胞。
[0106]细胞从单个患者获取、用所需的纳米颗粒装载并且然后局部地或全身地重新引入 同一患者中。
[0107] 然后，免疫系统的细胞将如以下所描述的被纯化，并且为了促进受到所讨论的疾 病影响的身体区域的选择性/优先靶向，细胞可以用相关的抗原(或过敏原）、免疫调节药物 离体处理，或用免疫增强或免疫抑制分子工程化。
[0108] 选择用于诊断或治疗目的的T细胞的方式之一是富集特定抗原特异性的T淋巴细 胞的数目，该特定抗原可以是如以上所描述的肿瘤抗原。
[0109] 用本发明的构建体适当地工程化的淋巴细胞一旦就位就可以借助于合适的化学 刺激物释放颗粒，然后，所述颗粒可以在处于无线电波范围内的电磁场的辐射下发挥过热 疗法或释放活性成分诸如抗肿瘤药物、在脑组织的氧化应激中活跃的分子的清除剂、抗炎 性分子等等。即使纳米颗粒保持局限在淋巴细胞自身内，它们仍可以执行它们的功能。
[0110] 磁性纳米颗粒还可以执行MRI成像功能，是优异的T2T2*造影剂（参见上文的专 利），含有金纳米棒的纳米颗粒可以在激光介导的抗肿瘤疗法中使用，并且通过光声光谱型 的方法来识别。
[0111] 淋巴细胞的纯化和选择
[0112] 用于针对肿瘤的T淋巴细胞使用标准化的方法和/或在选择性MACS?*法的辅 助下从外周血或从肿瘤部位或从预先施用相关肿瘤抗原之后的患者的淋巴结、或从身体的 如视为相关的其他区域来纯化(Current Protocols in Immunology 2013;D'Elios等人J Immunol 1997；158:962-967)〇
[0113]为了选择肿瘤特异性T淋巴细胞，将T淋巴细胞与相关的肿瘤抗原（例如对于黑素 瘤的MAGE-3,以10μg/ml的浓度)一起放置在完全的RPMI培养基中培养持续五天。然后，每三 天添加重组人类IL-2,并且然后将使细胞装载有纳米颗粒、洗涤并且然后局部地和/或全身 地施用至患者。
[0114] 用作诊断产品，例如用于通过核磁共振技术的多发性硬化的诊断产品的T细胞，针 对它们对髓磷脂抗原或M0G(10μg/ml)或如优选地能够获得CNS的结构的其他抗原的特异性 被选择。
[0115] 为了这个目的，将它们与一个或更多个抗原一起培养持续五天，然后用IL-2扩大， 并且然后用NP装载。
[0116] 使用合适的相关抗原，相同的程序可以用于其他神经疾病，诸如阿尔茨海默病、帕 金森病、中风和其他心脑血管疾病。
[0117]使用传统的标准化的方法和/或在选择性方法MACS?:的辅助下，获得树突细胞 (对于它们将抗原呈递至T淋巴细胞的能力是高效的，并因此很大程度上能够活化T-淋巴细 胞）（Current Protocols in Immunology 2013;Codolo等人Arthr Rheum 2008;58:3609-17)。它们将与所需的抗原一起孵育36-44小时，然后用NP装载、洗涤并且重新注入到患者中 用于治疗或诊断目的（参见图5中的过程布局）。
[0118]使用传统的标准化的方法和/或在选择性MACS?方法的辅助下获得具有强的 细胞毒性活性的自然杀伤细胞和/或y δ淋巴细胞(Current Protocols in Immunology, 2013)，然后用所需的NP和可能地用其他免疫调节化合物装载它们、洗涤并且重新引入到患 者中用于治疗(例如抗肿瘤）目的或也用于诊断目的。
[0119] 使用传统的标准化的方法和/或在选择性MACS?方法的辅助下获得嗜中性粒 细胞(Current Protocols in Immunology,2013)，然后将用所需的NP和可能地用其他免疫 调节化合物装载它们、洗涤并且重新引入患者内用于诊断（例如以鉴定身体中不能通过其 他技术鉴定出的任何感染病灶的存在）目的或也用于治疗目的。
[0120] 另外，可以针对诊断用途和/或治疗用途(诸如即将用于治疗肿瘤、自体免疫性疾 病、感染、退行性疾病的效应细胞)选择其他细胞类型，诸如B淋巴细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性 细胞，所述细胞使用传统的标准化的方法和/或在选择性MACS?方法的辅助下获得 (Current Protocols in Immunology,2013)〇
[0121] 然后，用所需的NP或可能地用其他免疫调节化合物装载它们、洗涤并且重新引入 到患者中。
[0122] 装载有纳米颗粒的免疫细胞可以用于利用合适的成像技术显示为疾病的位置的 身体区域。
[0123] 在4小时后，T细胞和Jurkat细胞最佳地填充有NP。
[0124] 单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、J774A.1细胞能够并入根据本发明的方法的纳米 颗粒，其中单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、J774A.1细胞装载有以在合适的特定培养基(培 养基）中0.05%的浓度的纳米颗粒(NP)。为了形成含有NP的培养基，首先分配NP，并且然后 分配特定培养基。
[0125] 培养基由以下组成：
[0126] 完全的 DMEM 10%FBS
[0127] 完全的 DMEM:
[0128] · DMEM高葡萄糖(DME/HIGiOdEUROCLONE)(代码:ECB7501L)
[0129] ?1^-谷氨酰胺，溶液20〇1111(100\)。"1]1?001)陬）（代码408 30000)
[0130] ?青霉素-链霉素溶液（lOOXhUTCC)(代码:30-2300)
[0131] · 10% 胎牛血清 FBS:胎牛血清，合格的。（Sigma-Aldrich)(代码:F6178-100mL)
[0132] 当需要时，将使用患者的自体血清或缺乏血清的培养基代替胎牛血清。
[0133] 在2小时后，单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、J774A.1细胞最佳地填充有NP，但是在 15 '直到24h后并入现象是活跃的。
[0134] 图6示出用光学显微镜拍摄的装载有纳米颗粒的单核细胞/巨噬细胞的照片。
[0135] 鉴于下面给出的实施例，本发明将被更多且更好地理解，还注意，图4和图5,它们 示意性地概括了用于构建体的制备和免疫系统的细胞的工程化的多个步骤。
[0136] 实施例1
[0137] 在二甘醇DEG中制备乙酸铁
[0138] 试剂：
[0139] 40g 卩6(卩6〈99%〈212臟），等于0.716111〇1;80(^水；80(^013(：00!1(80%)，等于 10·67mol ;46·64g含氧水（30%)，等于0·41mol;0·12g浓HCl;DEG(二甘醇）3850g。
[0140] 合成：
[0141] 在氮气流下，将铁、乙酸和水溶液以及盐酸装载到5000mL 4-颈烧瓶，并且将温度 升高到90 °C并且维持6小时。使体系在N2下冷却，并过滤溶液以去除未溶解的Fe。使用滴注 器将含氧水逐滴添加到放置在烧瓶中的澄清溶液中，保持温度在35°C，持续lh，获得具有 2.40%w/w的铁滴度（iron titer)的等于1628.3g的澄清溶液。然后，过量的酸通过在40°C 的T的第一次真空蒸馏、干燥部分用水再循环并且通过蒸馏两次(两次连续的洗涤)去除以 及在约50°C的Τ的最终汽提来汽提。将3850g DEG添加到干燥部分以使理论铁滴度达到 1.01%w/w Fe的值。
[0142] 实施例2
[0143] 在二甘醇中制备Fe3〇4纳米颗粒
[0144] 试剂：
[0145] 1.50g Fe0(Fe0〈99%，〈212mm)Fe0 = 0.179mol;150g DEG;DEG中 1/10HC1 浓度37% 的1.2g溶液;在DEG中的300.00g FeAc3(1.01%w/w Fe111)。
[0146] 在犯下将金属铁和DEG放置在500mL 4-颈烧瓶中，并且将温度升高到150°C。将盐 酸在DEG中的溶液添加到体系并且保持在搅拌下持续5分钟。然后，使用注射器以10当量的 等分试样添加乙酸铁，以确保颗粒的适当生长，将温度升高到170°C，使反应在24-36小时内 终止。
[0147] 将产物冷却到60°C并且倾注在烧杯中，以磁力保留未反应的金属铁，并且然后在 0.45μπι玻璃纤维上过滤。
[0148] 450g的磁铁矿在二甘醇中的纳米悬浮液具有等于0.91 % ±0.05的离子铁的滴度， 该离子铁的滴度用Fe3〇4表示相当于1.253% ±0.05。对该样品测量过热并且值如表中所示。
[0150] SARm:针对金属(Fe)质量表示的比吸收率
[0151] 实施例3
[0152]有机粘合剂N- (3，4-二羟基苯乙基)十二酰胺(DDA)
[0154] Mff=335.48g/mol
[0155] 试剂：
[0156] 25g盐酸多巴胺，等于0 · 1318mol; 1L THF;45mL三乙胺0 · 32mol ;31 · 20mL十二酰氯 0.135mol；
[0157] 纯化和结晶
[0158] 400mL THF(Aldrich 401757-2L-Lot STBC4923V)
[0159] 935mL乙酸乙酯（Aldrich 34972-2.5L-Lot 57BC011AV)
[0160] 315mL石油醚（Aldrich 77379-2.5L-Lot BCBG7367V)
[0161] 合成：
[0162] 在氮气气氛下将盐酸多巴胺并且然后THF(IL)放置至5L 4-颈烧瓶，并且然后添加 三乙胺，并且在搅拌下保持系统持续约20'以得到白色悬浮液。
[0163] 向3L平底烧瓶添加 THF(IL)和酰化剂。搅拌溶液，并且使用蠕动栗以约2mL/min的 速率历时9h将溶液添加到包含在5L烧瓶中的试剂，获得黄-橙色的溶液，底部具有些许白色 固体。
[0164] 纯化：
[0165] 然后，纯化含有合成产物的有机相，并且从在反应期间形成的副产物中回收合成 产物。通过以下进行纯化:经由旋转蒸发器通过两次循环（2 X200mL)去除溶剂。在另一方 面，在独立的漏斗中对固体残渣、和在合成烧瓶中的痕量残渣进行水提取和用乙酸乙酯处 理。完全合并有机相，用Na 2S04干燥，并且最终在旋转蒸发器中达到干燥。得到57g橙色油状 产物。
[0166] 结晶：
[0167] 将450mL的石油醚：乙酸乙酯=7:3的混合物添加到产物中。将悬浮液置于冷水下， 并且白色固体开始结晶。使体系静置1天。
[0168]固体在Buckner上过滤、用母液洗涤并且使用油栗干燥。获得约39g(理论值44g-产 率 88.6%)。
[0169] 使从结晶（2.45g-橙棕色固体)和从洗涤得到的母液干燥(PR頂E27.13g-深棕色固 体)。
[0170] 实施例4
[0171] Fe3〇4纳米颗粒(在THF中）的表面功能化：
[0172] 试剂：
[0173] 40.0g Fe3〇4分散体，等于2.164 · 10-3mol;1089mg DAA，等于3.247 · 10-3mol; 120mL Et0H;80.0g THF。
[0174] 在250mL烧瓶中使1089mg DDA在120mL EtOH中溶解；用60ml注射器将由此制备的 溶液添加到磁铁矿中。然后，在超声浴中对其进行声处理，持续lh。使样品静置几分钟，并且 然后添加60mL H20,且NP沉降在钕磁体(magnet)上;分离上清液，并且使纳米颗粒再次分散 在80.0g THF中。将4滴三乙胺添加至分散体(在约10分钟之后，颗粒分散）。
[0175] 表征
[0176] DLS
[0178] 实施例5
[0179] Fe3〇4纳米颗粒(在丙酮中）的表面功能化：
[0180] 试剂：
[0181] 4 · 0g Fe3〇4分散体，等于0 · 2 · 10-3mol; 108 · Omg DAA，等于0 · 3 · 10-3mol; 12 · OmL EtOH; 13.6mL丙酮。
[0182] 在超声浴中对磁铁矿的悬浮液进行声处理，持续lh，然后用25mL注射器将其添加 至lj 108mg DDA在12. OmL EtOH中的溶液中。然后，使其进行声处理，持续30min。使样品静置持 续几分钟。添加6mL H20，且NP沉降在钕磁体上，然后分离上清液，并且使NP再次分散在 13.6mL丙酮中。将2滴三乙胺添加至分散体(颗粒立即分散）。
[0183] 表征
[0184] DLS
[0186] 实施例6
[0187] 聚合物PLGA-b-PEG-COOH 43-3kDa的合成
[0188] 为了合成嵌段共聚物PLGA-b-PEG-C00H，使用二环己基碳二亚胺(DCC)的偶联化学 用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使前体PLGA-C00H(MW44-10kDa)活化，并且然后，如以下所描述 的，使加合物与二氯甲烷(DCM)中的氨基-官能部分PEG-NH 2 (MW 2-3kDa)化合：
[0189] 步骤1:用NHS活化羧基官能团
[0190]
[0191] 试剂
[0192]
[0193] 程序
[0194] 在氮气条件下向5L四-颈烧瓶添加 PLGA-C00H和600mL二氯甲烷。在聚合物溶解后， 添加 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并且然后添加 N，N二环己基碳二亚胺(DCC-每次约0.25g);在 惰性气氛中使体系在搅拌下保持约40h。使用120mL二氯甲烷从固体洗涤漏斗，以便不损失 原始材料。
[0195] 将黄色悬浮液过滤到2L有尾烧瓶中，以便去除二环己脲。用250mL( X 3)和190ml CH2C12洗涤5L烧瓶。
[0196] 产物在1L烧瓶中通过旋转蒸发器浓缩到约400mL体积(50ml干DCM洗涤）：获得稠密 的微黄色悬浮液。
[0197] PLGA-NHS使用400mL( X 4)的冷二乙醚来沉淀。对于每次洗涤，滗析白色固体并去 除上清液。随后，使用油栗干燥固体，持续约2h30 '。
[0198] 步骤 2: PLGA-NHS 与 NH2-PEG-C00H 的辄合
[0199] PLGA-NHS
[0201] CHCls
[0202] CH2Cl2-PM=119.38
[0203] DIPEA N-乙基二异丙胺[(CH3)2CH]2NC2H5-PM= 129.24
[0204] COOH-PEG-NH2 HC1 x NH2-PEG-O-C3H6-COOH-PM PEG = 3000da [0205] 试剂
[0206] PLGA-NHS(反应中间物）
[0207]
[0208] 程序
[0209] 在配备有机械搅拌器的2L 3-颈烧瓶中，在氮气流下，使得到的中间物溶解在1L氯 仿中。使用注射器向体系添加 1.2mL DIPEA，并且随后添加 7g C00H-PEG-NH2(少量添加）。在 惰性气流下，使体系在搅拌下保持约90h。
[0210] 将黄色溶液从3-颈烧瓶转移到2L 1-颈烧瓶中，并且用100mL氯仿洗涤。
[0211] 借助于旋转蒸发器将产物浓缩到约550ml (蒸馏液体积CHCl3 = 650ml)。将产物从 2L烧瓶中转移到1L 1-颈烧瓶(用250mL CHC13洗涤）。
[0212]沉淀聚合物并且用250mL( X 5)的冷二乙醚洗涤:在开始时，必须缓慢地添加悬浮 液并用玻璃棒摇动以防止过饱和。在每次洗涤时，将体系置于冰浴中，并且然后去除上清液 (含有季盐和未反应的有机杂质的乳白色悬浮液）。
[0213]用250mL( X5)去离子水洗涤橡胶状外观的白色固体以去除痕量的未反应的C00H-PEG-NH2〇
[0214] 将体系置于真空（首先为液环栗，且其后为油栗），交替真空干燥（油栗-阱，在-30 °C)，瓦解聚合物以促进干燥，并且在冰箱中储存过夜。重复该程序直到不再观察到重量损 耗。
[0215] 将产物储存在冰箱中。
[0216] 回收到86.80g的聚合物(产率为约83%)。
[0217] 实施例7
[0218] 合成（？11^-13^^6-〇)0!112-31^)&)
[0219]步骤1:用NHS活化羧基官能团
[0220]
[0221]试剂技术规格：
[0222] 试剂
[0223] 7g PLGA-C00H 7000-17000(50:50聚（DL-丙交酯-共-乙交酯），羧酸酯末端基团） -0·582mmol
[0224] 150mL CH2C12(二氯甲烷->99.9%)，用于PLGA-C00H的溶解
[0225] 0.27g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺-98%)，用30mL CH2C12洗涤-2.34mmol
[0226] 〇.51g DCC(N，N二环己基碳二亚胺-99%)，用50mL CH2CI2洗涤-2.493mmol
[0227] 70mL CH2C12(二氯甲烷>99.9%，用于在Buckner上过滤前洗涤500mL烧瓶
[0228] 55〇1^二乙醚（厶1(14(*彡99.8%)
[0229] 在氮气条件下向500mL烧瓶添加 PLGA-C00H和150mL二氯甲烷。在聚合物溶解后，添 加 NHS(用于漏斗洗涤的30mL CH2C12)，并且然后添加 DCC-连续添加（用于漏斗洗涤的50mL CH2Cl2)〇
[0230] 在惰性气氛中，使体系在搅拌下保持约24小时。
[0231] 在Buckner上过滤无色溶液(具有在悬浮液中的白色固体)到1L有尾烧瓶中，以便 去除二环己脲。用70ml CH2C12洗涤500mL烧瓶。
[0232] 将产物转移到梨形1-颈烧瓶，并且通过Buchi旋转蒸发器浓缩，在约lh后，获得稠 的白色悬浮液。
[0233] 步骤 2: PLGA-NHS 与 NH2-PEG-C00H 的辄合
[0235] 试剂
[0236] 在稠的悬浮液中的PLGA-NHS (反应中间物）
[0238] 程序
[0239] 在氮气条件下，在500mL烧瓶中溶解中间物100(X2)和60mL CHC13。使用注射器， 向体系添加0.3 5mL DI PEA，并且随后添加具有2OmL漏斗洗涤的CHC13的1.8 2g⑶0H-PEG-NH2。在惰性气流下，体系在搅拌下保持96h。
[0240]由于棕色和白色残余物的存在而在Buckner上过滤的悬浮液从4-颈烧瓶转移到 500mL 1-颈烧瓶，用几 mL氯仿洗涤。
[0241] 产物借助于旋转蒸发器来浓缩（体积CHC13蒸馏液=170mL)。向黄色溶液添加 120mL冷的二乙醚（白色悬浮液-用玻璃棒摩擦-冰浴）、60mL(白色悬浮液-冰浴）、80mL(沉淀 的开始-冰浴）、60mL(冰箱持续约1小时）。产物用1 OOmL( X 2)冷的二乙醚洗涤。在每次洗涤 时，将体系置于冰箱中，并且然后去除上清液(含有季盐和未反应的有机杂质的乳白色悬浮 液）。使在醚中的三个级分干燥（1.20g)。
[0242] 用100mL(X3)去离子水(冰浴)洗涤橡胶状外观的白色固体以去除痕量的未反应 的C00H-PEG-NH2。
[0243]将共聚物（18.10g)置于真空条件下Buchi旋转蒸发器中并且然后与油栗连接（乙 醇-干冰阱）持续约4h(7.78g-干燥与瓦解交替）。产物经历瓦解，且然后被放置在真空下，使 干燥、瓦解和冷冻的阶段交替。重复该程序直到不再观察到重量损耗。
[0244] 产物储存在冰箱中。
[0245] 回收到7.52g的聚合物(产率为88%_86%)。
[0246] (2g)P.M.:11300g/mol-0.1769mmol
[0247] (5g)P.M.:15400g/mol-0.3246mmol
[0248] mmol PLGA C00H:0.5015
[0249] g PLGA PEG C00H(mol 2g*P.M.2g) + (mol 5g*P.M.5g) = 2.529+5.972 = 8.5g
[0250] 用PM=12000进行计算。预测8.74g PLGA PEG C00H
[0251] 实施例8
[0252] 建立纳米生物反应器(NBR)
[0253]试剂：
[0254] 40.0g Fe3〇4_DDA，等于9.5e-04mol Fe3〇4;220.0mg PLGA-b-PEG-⑶0H，等于5e- 06mol聚合物;400ml磷酸盐缓冲液ImM。
[0255] 在已将220.0mg聚合物溶解在5mL THF中后，在有机溶液中注入40.0g Fe3〇4_DDA。 使用60mL注射器，在旋转蒸发器中浓缩产物以去除存在的THF。当不再存在有机蒸汽的形成 和凝结时，终止过程。
[0256] 然后浓缩产物，并且根据以下的过程用具有Pellicon 2mini lOOkDa膜的Cogent Μ系统透析：
[0257] 系统已经排干水后，引入以1.5的理论因子浓缩的且然后用2000mL UP水缓冲的 10_3M透析的NBR的悬浮液。
[0258] 在将系统保持在NaOCl 1 : 10中持续30分钟后，将悬浮液在具有500kDa膜的 Pellicon XL系统中进一步浓缩到100mL的体积。
[0259] 已达到20 X的理论浓缩系数(无机物的理论浓缩:1.0% )后，终止过程。
[0260] 然后，悬浮液用Millipore Sterivex 0·22μπι PES过滤器过滤。将其储存在冰箱 中。
[0261 ] 表征
[0268] 在培养基中的稳定性
[0269] 样品在DMEM+10%FBS+谷氨酰胺+抗生素中稀释到1:20(0.05%?七无机相） ：它是澄 清的，无聚集体。
[0270] DLS
[0272] 实施例9
[0273] 连续的纳米生物反应器制备(NBR)
[0274]试剂：
[0275] 200mg PLGA-b-PEG-C00H，等于4.4e-06mol聚合物；52.6g THF;36.4g Fe3〇4_DDA， 等于8.6e-04mol Fe3〇4;具有在pH 7.4=10-3M的磷酸盐缓冲液的 1000mL H2O MilliQ。
[0276]向 lOOmL爱伦美氏（Erlenmeyer)烧瓶添加0 · 2g聚合物PLGA-b-PEG-⑶0H和52 · 6g THF，搅拌直到完全溶解(几分钟）。最后，添加36.4g Fe3〇4_DDA。
[0277]合成：
[0278]在校准后设置双联蠕动栗系统以执行将有机溶液添加到含水的流中（THF/水体积 比=1/10)。相应的管直接地从含有THF溶液(具有PLGA-b-PEG-⑶0H和颗粒)和在2.5L瓶中 制备的磷酸盐缓冲溶液的呼吸器抽取溶液。
[0279]产物首先在旋转蒸发器中汽提以去除THF，并且然后使其干燥;挥发性组分已经蒸 发后，回收产物。
[0280] 然后浓缩产物，并用具有Pellicon 2mini lOOkDa膜的Cogent Μ系统透析：
[0281] 清空系统，回收到254.5g产物。
[0282] 理论浓缩系数:4·7Χ
[0283] 理论浓度:0.078%
[0284] 浓缩和透析所需的时间：20'。
[0285] 产物在具有500kDa膜的Pellicon XL中进一步浓缩。最终浓缩所需的时间：lh。
[0286] 回收的：扣除膜内的约l-2mL的死体积，11 · 5g。
[0287] 理论浓度(考虑V死1.5mL):14%
[0288] 表征
[0289] DLS
[0290]
[0291] #用于在血清中以0.05%的稳定性测试(理论）
[0292] ICP
[0294] 实施例10
[0295] 建立具有moAb的靶向纳米生物反应器(NBR_hERG)
[0296]试剂：
[0297] 40.3811^陬1?，等于0.533以111〇1-(：00!1;2.3211^磺酸基-順5 0.23111]\1溶液，等于0.5334 mol;190yL EDAOHC1 28mM溶液，等于0.053mmol;2.64mL 1.52mg/mL hERG溶液，等于4.0mg hERG(2 · 7e-08mo 1); 1500mL Na2HP03的水溶液，=10-3M。
[0298] 向无菌的250mL容器添加40.38mL NBR并且然后添加0.19mL EDAC(0.028M)和 2.32mL磺酸基-NHS。在40'（静置）后，用15.52mL磷酸盐缓冲液ImM稀释2.64mL的hERGl溶液 (1 · 52mg/mL = 4 · Omg)，并且将其添加到42 · 89mL活化的NBR中。（V终=61 · 05mL;Fe3〇4 = 0.056%)。使其静置过夜。
[0299] 设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。将系统用300mL H2〇 Mi 11 iQ洗涤，流动400mL的0.5 %的次氯酸钠，并且然后使系统灭菌持续约30min。然后，将其 用400mL缓冲液ImM洗涤。
[0300] 然后，将产物浓缩到22mL的体积，将栗速设置为约15mL/min(P = 0.27巴）。第一透 析渗透液(permeate)还经由BCA?测试分析。
[0301] 产物用100mL(4体积）的缓冲液ImM以15mL/min(P = 0.27巴）的速度透析，并且浓缩 到4.7mL的体积。
[0302]最后，产物用0.22μΜ PES过滤器过滤。将其储存在冰箱中。
[0303]如此获得的产物在以0.05%wt稀释在培养基中后表现出良好的稳定性;不存在肉 眼可见的聚集体形式或絮凝的固体形式。
[0314] BCA 测试
[0315] 为了执行BCA测试，NBR_hERG的浓度相对于相应的无抗体(NBR)的浓度标准化，因 此无抗体(NBR)充当空白。通过添加相关试剂显现染色后，通过UV-vis分光光度计分析样 品，然后将吸光度值内推到之前(使用BSA标准品）制备的校准曲线上，并且外推出当量moAb 浓度。存在于NBR_hERG上的抗体的净量通过从对应于NBR_hERG的样品的moAb值减去在洗脱 液中和在空白（NBR)中发现的moAb值来计算。参见下面的等式：
[031 6] CmoAb(NBR-moAb)净一CmoAb(NBR-moAb) _CmoAb( NBR) _CmoAb(i姗液）
[0317] 以下是测量的实验值：
[0318] mAb 洗脱液= 45yg/mL
[0319] mAb NBR = 435yg/mL
[0320] mAb NBR_hERG = 863yg/mL
[0321] 实际的減13(11^匕陬1〇^1?-11^匕陬1〇=428以8/11^
[0322] 比 mAb/Fe3〇4 = 0.14
[0323] 实施例11
[0324] 建立具有Fluo-染料(NBR_Fluo)的靶向纳米生物反应器
[0325] 试剂技术规格：
[0329] Flu〇-NH2溶液的制备
[0330] 将荧光团用770yL DMS0溶解，获得lnmol/yL的溶液。在12mL小瓶中，添加4950yL ImM磷酸盐缓冲液并添加50yL的荧光团Alexa Fluor 750溶液(50nmol)。然后，将其置于磁 力搅拌下，并且然后添加 l〇〇yL的132yg/mL的1，4_二氨基丁烷溶液（相当于150nmol = 13.2g)。在黑暗中和在氮气流条件下，使溶液反应持续24h。如此获得的NH2-末端荧光团将 用于随后的合成步骤，而无需纯化。
[0331] 磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
[0332] 准确称量5.0mg的磺酸基-NHS并且然后使用ImM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶 中。
[0333] EDAC 溶液（0.028mM)的制备
[0334] 向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL ImM缓冲液。加盖并摇动以促进混合。该溶液 必需在临反应前制备。
[0335] 合成：
[0336] 向l〇〇mL容器添加30.00mL NBR DF并且添加0.14mL EDAC(0.028M)和 1.72mL磺酸 基-NHS(0.23mM)。
[0337] 总体积：30 · 00mL+0 · 14mL+l · 72mL = 31 · 86mL
[0338] 在40'（静置）后，添加2.64mL的Alexa Fluor 750溶液（10nmol/mL)。
[0339] 使其静置持续4h。
[0340] 进行对照DLS(NBR_Fluo TQ)。
[0341] 纯化：
[0342] 设置系统用于使用Pell icon XL 500kDa PES膜和具有容易装载的II头部的蠕动 栗Masterflex L/S透析产物。然后，系统通过使0.5%的次氯酸钠流动并且使反应持续约30 分钟来灭菌。在用无菌的MilliQ水洗涤并且用ImM磷酸盐缓冲液(也是无菌的)设置系统后， 将栗速设置为约12mL/min(P = 0.25毫巴），将产物浓缩到1 OmL的体积(收集23ml的渗透液）。 保留第一渗透液的比率用于UV-VIS分析。然后用40mL (4体积）的缓冲液ImM对产物透析，以 12mL/min(P = 0.25毫巴）的速度工作。此时，产物被浓缩到6mL的体积。
[0343] 回收的：5.00g
[0344] 理论合成浓缩系数：5.8 X
[0345] 相比于NBR的理论浓缩系数：5X
[0346] 过滤：
[0347] 产物用0.22μΜ Millex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。 将产物储存在冰箱中。
[0348] 回收的 NBR_27_F 1 uo_01DF = 4 · 49g
[0349] 表征
[0350] DLS
[0351] R0366/2013；R0368/2013
[0353] Z 电势
[0354] R0368/2013
[0356] ICP
[0357] R0368/2013
[0362] 实施例12
[0363] 建立具有Fluo-染料的靶向纳米生物反应器(NBR_Fluo)
[0364] 试剂技术规格：
[0368] Flu〇-NH2溶液的制备
[0369] 向12mL小瓶添加5mL ImM磷酸盐缓冲液、50nmol(l瓶)花菁5、NHS酯，并且然后添加 150nmol(13.2g)l，4-二氨基丁烷。在黑暗中、在磁力搅拌和氮气流条件下，使溶液反应持续 24h。由此获得的NH 2-末端荧光团将用于随后的合成步骤，而无需纯化。
[0370] 磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
[0371] 准确称量5 .Omg的磺酸基-NHS，并且然后使用ImM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶 中。
[0372] H)AC 溶液（0.028mM)的制备
[0373] 向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL缓冲液ImM。加盖并摇动以促进混合。该溶液必 需在临反应前制备。
[0374] 合成：
[0375] 向50mL无菌容器添加30.00mL NBR并且添加0.14mL EDAC(0.028M)和 1.72mL磺酸 基-NHS(0.23mM)。
[0376] 总体积：30 · 00mL+0 · 14mL+l · 72mL = 31 · 86mL。
[0377] 在40 '（静置)后，添加2 · 64mL的花青苷-5-NH2溶液（lOnmol/mL)。
[0378]使其静置持续4h。
[0379] 纯化：
[0380] 设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。
[0381] 此时，产物被浓缩到10mL的体积(收集23mL渗透液）。将栗速设置到约12mL/min(P = 0.25毫巴）；t = 4/
[0382] 保留第一渗透液的比率用于UV-VIS分析。
[0383] 用40mL(4体积）的缓冲液ImM透析。v 12mL/min(P = 0.25毫巴）；t = ll'。
[0384] 此时，产物被浓缩到6mL的体积;t = 5 '。
[0385] 回收的：4.29g
[0386] 理论合成浓缩系数:5.5 X
[0387] 相比于NBR的理论浓缩系数:4.8 X
[0388] 过滤：
[0389] 产物用0.22μΜ Millex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。 将产物储存在冰箱中。
[0390] 回收的NBR_Fluo = 4. llg
[0391] 实施例13
[0392] 具有moAb和Fluo-染料的靶向纳米生物反应器(NBR_hERG-Fluo)的制备
[0393] 试剂技术规格：
[0398] Flu〇-NH2溶液的制备
[0399] 向12mL小瓶添加5mL ImM磷酸盐缓冲液、50nmol(l瓶)花菁5NHS-酯，置于磁力搅拌 下并且然后添加100yL的13.2mg/100mL的1,4-二氨基丁烧溶液(相当于150nmol = 13.2yg)。 在黑暗中且在氮气流条件下，使溶液反应持续24h。由此获得的NH2-末端荧光团将用于随后 的合成步骤，而无需纯化。
[0400] 磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
[04011准确称量5.0mg的磺酸基-NHS，并且使用ImM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶中。 [0402] H)AC 溶液（0.028mM)的制备
[0403]向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL缓冲液ImM。加盖并摇动以促进混合。该溶液必 需在临反应前制备。
[0404] 合成：
[0405] 向无菌的100mL容器添加7.95mL缓冲液ImM并且然后添加4.79mL NBR。温和搅拌混 合物以混合，并且然后添加2.29mL EDAC(0.028M)和2.79mL磺酸基-NHS(0.23mM)。
[0406] 总体积：7 · 95mL+4 · 79mL+2 · 29mL+2 · 79mL= 17 · 83mL。
[0407] 在40'（静置）后，添加2.5mL的花青苷5-NH2酯溶液（10nm 〇l/mL)。然后将3.2mL的 hERGl溶液（1.5mg/mL = 4.8mg)在52.32mL磷酸盐缓冲液ImM中稀释并且添加到含有活化的 NBR和荧光团的悬浮液中。使其静置过夜。
[0408] 纯化：
[0409] 设置系统用于使用已经用于NBR_19的Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。用 300mL H20 Mi 11 iQ洗涤，然后使400mL的0.5 %次氯酸钠流动，并且保留在次氯酸盐中持续 约30分钟。用400mL缓冲液ImM洗涤系统。
[0410]此时，产物被浓缩到20mL的体积(收集50mL渗透液）。将栗速设置为约14mL/min(P = 0.25毫巴）；t = 15'。
[0411]保留第一渗透液的比率用于BCA测试。
[0412]用 80mL(4 体积）的缓冲液 ImM 透析。v 14mL/min(P = 0.2 毫巴）；t = 16'。
[0413]此时，产物被浓缩到l〇mL的体积;t = 4'。
[0414] 回收的：6.46g
[0415] 相比于NBR的理论稀释系数：1.3 X
[0416] 过滤：
[0417] 产物用0.22μΜ Millex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。 将产物储存在冰箱中。
[0418] 回收的 NBR_hERG-Fluo = 7.79g
[0419] 表征
[0426] 实施例14[0427] 装载有活性成分的纳米生物反应器(NBR_PTX和NBR_hERG_PTX)的制备[0428] 试剂技术规格：
[0430] 试剂：
[0431] 35.6g Fe3〇4-DDA(40.0mL)(195.8mg Fe3〇4) 490mg/L(在水中）
[0432] 212.6mg PPGC43-3.1 490mg/L(水中）
[0433] 21.2mg PTX
[0434] 400ml磷酸盐缓冲液lmM(实际值:440mL)
[0435] 60mL注射器25G针头
[0436] THF溶液[具有PLGA-PEG(5 · 5mg/g)、PTX(0 · 55mg/g)和Fe304(5 · 5mg/g)]的制备
[0437] 将212.6mg PPGC43-3.1溶解于4mL(4mL小瓶）THF中，并且将21.2mg PTX溶解在 2.12mL THF(4mL小瓶)中，且然后将其添加到lOOmL烧瓶中的35.6g Fe3〇4_DDA。
[0438] 合成：
[0439] 使用具有25G针头的60mL注射器，将THF溶液堆积在400ml的磷酸盐缓冲液ImM中。
[0440] 获得的 NBR_PTX :455.8g [0441 ] 汽提
[0442] 将产物在旋转蒸发器中处理以去除存在的THF。为了该目的，将产物移到100011114? 瓶并且设置以下条件：
[0443] 浴T 40°
[0444] 压力：154毫巴
[0445] 转速:80rpm
[0446] 在lh后，完成挥发性组分的蒸发后，回收产物并且称重。
[0447] 回收的 NBR_PTX 旋转蒸发物(Rotavap) =418 · 22g(37 · 58g 去除的 THF)
[0448] 透析和浓缩：
[0449] 产物根据以下的程序用具有50kDa膜的AMIC0N系统浓缩和透析。
[°450] 1)用5 OmL渗透的（〇 smo t i z e d) H2O洗涤以去除膜中的杂质。
[0451 ] 2)用具有在出0 UP中的50mL磷酸盐缓冲液10-3Μ的溶液洗涤系统。
[0452] 系统排干水后，添加 NBR_PTX并且浓缩到约100mL。
[0453] 其后，用150mL缓冲液ImM进行4次洗涤。最后，浓缩到75mL，弃掉45mL洗脱液。
[0454] 清空系统，回收到59.40g的产物(NBR_PTX)。
[0455] 理论浓缩系数= 7.7 X
[0456] 过滤：
[0457] 产物用Millipore Sterivex 0·22μΜ PES过滤器（圆柱形过滤器)过滤。
[0458] 表征
[0463] 稳定性：
[0464] 在DMEM+10%FBS+谷氨酰胺+抗生素中以1:8稀释的浓缩的样品是透明的，无聚集 体。
[0465] DLS
[0466] R0211/2013
[0470] 实施例15
[0471 ] 装载有活性成分的纳米生物反应器(NBR_PT-X和NBR_hERG_PTX)的制备
[0472] 试剂技术规格：
[0473]
[0476] pH 7.4的 1500mL磷酸盐缓冲液[] = 10-3M
[0477] 磺酸基-NHS溶液(0 · 23mM)的制备
[0478] 称量5. Omg的磺酸基-NHS并且使用ImM磷酸盐缓冲液溶解在lOOmL烧瓶中。
[0479] H)AC 溶液（0.028mM)的制备
[0480]向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL缓冲液ImM。加盖并摇动以促进混合。该溶液必 需在临反应前制备。
[0481] 合成：
[0482] 向无菌的40mL容器添加2.36mL缓冲液ImM并且然后添加4.26mL NBR_PTX。温和搅 拌混合物以混合，并且然后添加1.19mL EDAC(0.028M)和1.45mL磺酸基-NHS。
[0483] 总体积：2 · 36mL+4 · 26mL+l · 19mL+l · 45mL = 9 · 26mL
[0484] 在40 '（静置）后，添加通过用27.25mL缓冲液ImM稀释0.833mL的hERGl溶液（3mg/ mL)获得的HERG1 溶液。（％= 37 · 34mL; Fe3〇4 = 0 · 056 % )。
[0485] 使其静置过夜。
[0486] 纯化：
[0487] 设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。用300mL H20 MilliQ洗 涤，然后使400mL的0.5 %次氯酸钠流动，并且保持在次氯酸盐中持续约30min。用400mL缓冲 液ImM洗涤系统。
[0488] 此时，产物被浓缩到13mL的体积(收集25mL渗透液）。将栗速设置为约13mL/min(P = 0.2毫巴）；t = 5'。
[0489] 保留第一渗透液的比率用于BCA测试。
[0490] 用60mL(4体积）的缓冲液ImM透析。v 13mL/min(P = 0.2毫巴）；t = 14'。
[0491 ]此时，产物被浓缩到10mL的体积;t = 10 '。
[0492] 回收的：7.40g
[0493] 理论合成浓缩系数：5.5 X
[0494] 相比于NBR_PTX的理论稀释系数:2.8 X
[0495] 过滤：
[0496] 产物用0.22μΜ Sterivex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤 器。将产物储存在冰箱中。
[0497] 回收的NBR_PTX = 6.88g
[0498] 表征
[0499] DLS
[0505] 程序的实际产率= 94.5%
[0506] 实施例16
[0507] 将NBR并入淋巴细胞中
[0508] T细胞和Jurkat细胞能够并入用由
【申请人】开发的方法的纳米颗粒。T细胞/Jurkat 细胞装载有以在合适的特定培养基(培养基）中0.05%的浓度的NP。为了形成含有NP的培养 基，首先分配NP，并且然后分配特定培养基。培养基由以下组成：
[0509] · RPMI 1640培养基，w 2.0g/L NaHC03-w/o L-谷氨酰胺。（BI0CHR0M)(代码： F1215)-500mL 添加有：
[0510] · L-谷氨酰胺，溶液200mM(100 X )。（EUR0CL0NE)(代码:ECB3000D)-5 · 5mL，未稀释
[0511] ?丙酮酸钠，100禮(100\)。（6让(：〇)(代码：11360-039)-5.511^，未稀释
[0512] · MEM NEAA最小必需培养基非必需氨基酸（100 XhWibco)(代码：11140-035 )-5.5mL，未稀释
[0513] · GENT0MIL(庆大霉素）80mg/2ml(AIC N°029314059)-12mL小瓶
[0514] ?2-巯基乙醇(16代1〇(代码:444203)-使用5.51^如下的2-巯基乙醇 ：在99.9631^ 无菌H2〇中的37μ1 2-巯基乙醇(终体积100mL)。
[0515] · 10% 胎牛血清 FBS:胎牛血清，合格的。（Sigma-Aldrich)(代码:F6178)。
[0516] 当必需时，将使用患者的自体血清或缺乏血清的培养基代替胎牛血清。
【主权项】
1. 磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒的表面用儿茶酚功能化，并且其中所述磁性颗粒 由纳米级磁铁矿颗粒组成。2. 构建体，所述构建体包含封装在生物相容的聚合物基质中的多个根据权利要求1所 述的纳米颗粒，其中具有治疗作用的分子任选地被分散。3. 根据权利要求2所述的构建体，所述构建体还包含多个金纳米棒。4. 根据权利要求2和3所述的构建体，其中所述生物相容的聚合物基质由生物可降解的 共聚物组成。5. 根据权利要求5所述的构建体，其中所述生物可降解的共聚物选自：生物可降解的纳 米胶束、聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯和聚谷氨酸、聚醚胺和聚谷氨酸苄酯。6. 根据权利要求5所述的构建体，其中所述生物可降解的纳米胶束由聚乳酸-乙醇酸共 聚物和聚乙二醇羧酸酯(PLGA-b-PEG-COOH)组成，具有式（I)其中m= [117-330] ;n= [117-330] ;p= [60-100]。7. 根据权利要求2所述的构建体，其中所述具有治疗作用的分子选自：抗癌剂、过氧亚 硝基清除剂、超氧化物歧化酶抑制剂、维甲酸、细胞因子、阿司匹林。8. 根据权利要求6所述的构建体，其中所述胶束的片段PEG-C00H的末端羧基用单克隆 抗体、蛋白、肽或感兴趣的活性分子进一步功能化，用于通过细胞过表达物的特异性识别。9. 根据权利要求8所述的构建体，其中所述抗体选自hEGR、hEGFR、I gG、moAb。10. -种用于制备根据权利要求2-6所述的构建体的方法，其中：通过批量或连续合成 在混合池中以恒定流动将以下混合： -溶解在溶剂中的聚合物的有机溶液，所述溶解在溶剂中的聚合物的有机溶液与用有 机粘合剂包覆的纳米颗粒的悬浮液混合， 所述聚合物和所述用有机粘合剂包覆的纳米颗粒二者在相同的溶剂中， -和 -Na2HP〇4的水溶液（ImM)。11. 一种用于制备根据权利要求7和8所述的构建体的方法，其中所述片段PEG-C00H的 末端羧基被活化以促进随后的通过氨基末端基团的酯化的攻击。12. 人类免疫系统的细胞，所述人类免疫系统的细胞含有根据权利要求2-8所述的构建 体。13. 根据权利要求12所述的细胞，其中所述人类免疫系统的细胞选自：T-淋巴细胞、单 核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、B-淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜 碱性粒细胞、γ S细胞。14. 根据权利要求1所述的纳米级颗粒和根据权利要求2-9所述的构建体用于过热疗法 治疗的用途。15. 根据权利要求12和13所述的细胞用于诊断癌症、退行性疾病、中枢神经系统疾病、 心脑血管疾病、传染病、移植、自体免疫性疾病的用途，和还用于治疗肿瘤、心脑血管疾病、 退行性疾病(例如阿尔茨海默病）、传染病、移植、肝硬化和特征在于纤维发生的其他疾病、 特征在于复发性胎儿丢失的疾病、子宫内胎儿死亡、新生儿疾病、先天性和获得性凝血功能 障碍、遗传疾病、自体免疫性疾病的用途，和最后用于疼痛缓解的用途。16. 根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒作为MRI成像工具的用途。17. 根据权利要求3所述的含有纳米棒的纳米颗粒用于诊断和治疗肿瘤疾病的用途。
【文档编号】A61K49/18GK106068128SQ201580003992
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2015年1月7日 公开号201580003992.6, CN 106068128 A, CN 106068128A, CN 201580003992, CN-A-106068128, CN106068128 A, CN106068128A, CN201580003992, CN201580003992.6, PCT/2015/50122, PCT/IB/15/050122, PCT/IB/15/50122, PCT/IB/2015/050122, PCT/IB/2015/50122, PCT/IB15/050122, PCT/IB15/50122, PCT/IB15050122, PCT/IB1550122, PCT/IB2015/050122, PCT/IB2015/50122, PCT/IB2015050122, PCT/IB201550122
【发明人】吉奥瓦尼·巴迪, 科斯坦萨·拉瓦格利, 马罗·康默斯弗兰奇尼, 马里奥·米尔科·德里奥斯, 玛莉莎·贝纳加诺, 马克·比托斯
【申请人】卡罗比亚意大利（共同）股份公司