治疗脂肪组织积聚的组合物和方法

治疗脂肪组织积聚的组合物和方法
【专利摘要】本公开涉及疾病或病症的治疗方法，所述疾病或病症与脂肪组织积聚有关，例如肥胖、代谢综合征、II型糖尿病等。施用包含针对抑胃肽的单克隆抗体的组合物。其导致重量增长率下降，并且显著降低脂质合成和积聚。
【专利说明】
治疗脂肪组织积聚的组合物和方法
技术领域
[00011 本申请要求于2013年12月17日提交的美国临时专利申请序列No.61/917,136;于 2014年4月3日提交的美国临时专利申请序列No.61/974,660;于2014年6月3日提交的美国 临时专利申请No. 62/007,255;于2014年9月3日提交的美国临时专利申请No. 62/045,189; 于2014年11月3日提交的美国临时专利申请No. 62/074,225;于2014年11月3日提交的美国 临时专利申请No.62/074，227;以及于2014年11月3日提交的美国临时专利申请No.62/074， 234的优先权。这些申请的公开内容通过引用完全并入本文。
【背景技术】
[0002] 在本文中，提交的序列表为于2014年12月17日创建的名称为"MHMS200014US01_ ST25. txt"的ASCII文本文件，该文件大小为24，995字节。由此，在该文本文件中的材料在此 全部引用并入本文。
[0003] 在各种示例性实施方案中，本公开一般而言涉及利用分子拮抗剂(如单克隆抗体 (mAb))治疗组织中脂肪积聚(buildup)的方法，所述分子拮抗剂与葡萄糖依赖性促胰岛素 多肽(GIP)结合。脂肪组织积聚发生在几种不同的疾病或病症中，其可以使用此类拮抗剂/ 单克隆抗体来治疗。本发明还涉及通过施用此类拮抗剂/单克隆抗体，在不需要增加血清胰 岛素的情况下，通过提高葡萄糖耐量从而治疗这些疾病或病症。
[0004] 肥胖症是这样一种医学病症，其中体内多余的脂肪积聚到对健康产生不利影响的 程度。在美国，当人的体重指数(BMI)为30kg/m 2以上时，则被视为出现肥胖症，该体重指数 通过该人的重量除以该人身高的平方计算。肥胖可能由多种因素的组合所诱发，包括过量 的热量摄入、不健康的饮食、缺乏体力活动、遗传、年龄以及睡眠不足。肥胖会增加各种疾病 发生的可能性，所述疾病包括心脏疾病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些癌症和骨关 节炎。
[0005] 当下面五种医学病症中的三种一起确诊时则可以诊断为代谢综合征：血压升高、 腰部出现过多的体内脂肪、空腹血糖高、血清甘油三酯高和高密度胆固醇(HDL)水平低。代 谢综合征也增加了一些疾病的患病风险，所述疾病包括2型糖尿病、冠状动脉心脏疾病、月旨 肪代谢障碍以及潜在的一些精神病。治疗包括生活方式的改变以及药物治疗。
[0006] 高脂血症是其中脂质和/或脂蛋白在血液中的水平异常升高的病症。原发性高脂 血症通常是由于遗传原因，而继发性高脂血症由其他潜在因素，如糖尿病、某些药物的使用 和嗜酒所诱发。高脂血症可划分为高胆固醇血症和高甘油三酯血症。在美国，一般而言，当 总胆固醇水平高于240mg/dl时则被诊断为高胆固醇血症。在美国，通常而言，当甘油三酯水 平高于500mg/dl时则被诊断为高甘油三酯血症。
[0007] 当身体的细胞不正确地响应胰岛素时，则会出现非胰岛素依赖性（II型)糖尿病， 这是已知为一种耐受胰岛素的病症。其结果是，高血糖水平持续过长时间。主要原因是体重 过重并且锻炼不足。长期并发症可包括心血管疾病、中风、肾衰竭和眼损伤。
[0008] 库欣综合征与长期暴露于异常高水平的激素皮质醇有关。皮质醇在肾上腺中产 生，而且通常是由促肾上腺皮质激素诱导。然而，当肾上腺是异常响应于胃抑制肽(GIP)时， 则会出现食物诱导的库欣综合征。
[0009] 脂肪肝(FLD)是出现在成人和儿童中的全球慢性健康问题。临床上将FLD分为两大 类:非酒精性FLD(NAFLD)和酒精性FLDUFLDhNAFLD和AFLD的特征在于肝脏脂肪含量超过 5%至10%，唯一的区别因素是疾病的潜在病因。然而，通常难以仅基于形态特征将两类FLD 进行区分。一般而言，FLD出现在消耗过量酒精的人群中，具有代谢紊乱或影响脂肪酸代谢 的遗传倾向的人群中，和/或肥胖的人群中。常见的共发病包括肥胖、2型(非胰岛素依赖型） 糖尿病和高脂血症。
[0010] FLD的核心病理包括肝性脂肪变性和会发展为肝硬化的脂肪肝炎。当肝脏中脂质 的含量超过5重量％至10重量％时，发生脂肪变性，其表现为脂质囊泡的异常滞留以及脂肪 酸氧化的抑制。脂肪变性被认为是可逆的，前提在于能够确认并解决该疾病的根本原因。 [0011]如果脂肪变性持续下去，则可能发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪 性肝炎(ASH)，这取决于疾病的严重性和诱因。与脂肪变性不同，NASH和ASH是不可逆的，仅 可以被治疗。NASH和ASH的特征在于更多的脂肪积聚、混合小叶炎症、肝细胞气球样退化、糖 原化的肝细胞核以及细胞周围纤维化。它们可发展为肝硬化，最终变成肝癌。
[0012]对于FLD当前的疗法包括：（1)遵循合理的饮食和锻炼计划，（2)避免通过突然体重 减轻或药物滥用而可能发生的肝损伤的恶化，（3)降低体重，（4)服用胰岛素增敏剂以降低 胰岛素抵抗并控制血糖，（5)使用降血脂药物或用于改善肝脏疾病的药物，和(6)寻求肝移 植。
[0013]在临床环境中，食欲抑制剂通过产生恶心而在某种程度上发挥作用。因此，如果 她/他愿意在减肥过程中感到不适，那么这样的人可以减肥。然而，特别要求患者遵循减肥 方案的情况下，不希望出现这样的副作用。
[0014] 期望存在对于FLD和其他涉及脂肪积聚的疾病的其他疗法。

【发明内容】

[0015] 本公开涉及结合胃抑制多肽(GIP)的单克隆抗体(mAb)以及使用这种mAb来治疗涉 及组织中脂肪积聚的疾病的方法，GIP也被称为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽，。
[0016] 本文在各种实施方案中公开的是治疗多种不同的疾病或病症的方法。这些疾病包 括肥胖症、II型糖尿病、食物诱发的库欣综合征或代谢综合征。本文还公开了降低肝脏组 织、网膜或皮下组织中脂肪积聚的方法。这些方法都包括向患者施用包含药学上有效量的 抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物。
[0017] 分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，其与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。
[0018] 在具体的实施方案中，所述分子拮抗剂包括具有第一CDR和第二CDR的轻链可变 域，各CDR与选自由SEQIDN0:20、SEQIDN0 :21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23和SEQID N0:24构成的组中的氨基酸序列具有至少95%同一性。分子拮抗剂的第一⑶R和第二⑶R通 过连接基团相互接合。该连接基团可以是氨基酸链。
[0019] 在其他实施方案中，所述分子拮抗剂包括轻链可变域，其具有与SEQ ID N0:20的 氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至少80% 同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:22的氨基酸序列具有至少85%同一性的第三⑶R。分子拮 抗剂的第一⑶R、第二⑶R和第三⑶R通过连接基团相互接合。该连接基团可以独立地为氨基 酸链。
[0020] 在又一些实施方案中，所述分子拮抗剂包括轻链可变域，其与选自由SEQ ID N0: 16、SEQIDN0:17、SEQIDN0:18和SEQIDN0 :19构成的组中的氨基酸序列具有至少80% 同一,性。
[0021] 在还一些实施方案中，所述分子拮抗剂包括重链可变域，其具有与SEQ ID N0:31 的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少 80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。 [0022] 在一些实施方案中，所述分子拮抗剂包括重链可变域，其与选自由SEQ ID N0:27、 SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一 性。
[0023] 在特定的实施方案中，所述分子拮抗剂包括轻链可变域和重链可变域;其中所述 轻链可变域包括第一CDR和第二CDR，各CDR与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24构成的组中的氨基酸序列具有至少95%同一性;其中 所述重链可变域包括与SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80 %同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨基酸序列具 有至少80%同一性的第三⑶R。所述分子拮抗剂可以是单链可变片段(scFv)、F(ab'）2片段、 Fab或Fab '片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体或单克隆抗体。
[0024] 在其他实施方案中，所述分子拮抗剂包括轻链可变域和重链可变域;其中所述轻 链可变域与选自由SEQIDN0:16、SEQIDN0 :17、SEQIDN0:18和SEQIDN0:19构成的组 中的氨基酸序列具有至少80%同一性；其中所述重链可变域与选自由SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。 所述分子诘抗剂可以是单链可变片段（scFv)、F(ab'）2片段、Fab或Fab'片段、双价抗体、三 价抗体、四价抗体或单克隆抗体。
[0025] 在具体的实施方案中，所述分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变域的单克隆 抗体，所述轻链可变域与SEQ ID N0:18具有至少80%同一性，并且所述重链可变域与选自 由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同 一性。
[0026] 在一个更具体的实施方案中，所述分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变域的 完整单克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID N0:18具有至少90 %同一性，并且所述重链可 变域与SEQ ID N0:29具有至少90%同一性。
[0027]所述分子拮抗剂可以结合GIP的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID N0: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4构成的组中。
[0028]在特定的实施方案中，所述分子拮抗剂是包括人恒定区的完整单克隆抗体。
[0029]所述分子拮抗剂的分子量可以为约30kDa至约500kDa。该分子拮抗剂可以具有对 GIP的结合亲和力，特征在于IC5〇为约O.lnM至约7nM。
[0030]该组合物可以静脉内、腹膜内或皮下施用。该组合物可以进一步包含惰性的药物 赋形剂，其选自缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、填充剂、聚合物和稳定剂组成的组中。该组合 物可以是粉末、注射剂、溶液、悬浮液或乳液的形式。
[0031 ]组合物包含的单克隆抗体诘抗剂的量可以为每升该组合物约0 . lmg至约lOOOmg。 有时，该组合物是冻干的。
[0032]脂肪肝疾病可以是酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪肝病。
[0033] 本文还公开了抑胃多肽(GIP)的分子拮抗剂，其可采用几种形式，如完整单克隆抗 体和其变体。该分子诘抗剂如上所述。
[0034] 本文还公开了互补DNA序列，其与选自由SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:41 和SEQ ID N0:42构成的 组中DNA序列具有至少85%同一性。
[0035] 以下将更加详细地讨论本公开的这些以及其他非限制性特征。
【附图说明】
[0036]本专利或申请文件包含至少一个用彩色显示的附图。在提出请求并缴纳所需费用 的基础上，官方将会提供包含彩色附图的本专利或专利申请公布文本的副本。
[0037]以下提供附图的简要说明，其用于说明本发明所公开的示例性实施方案，而不是 为了限制这些实施方案。
[0038]图1A是表示对于三组不同的小鼠进行15周的研究期间，小鼠体重vs.时间的图示。 喂食高脂肪饮食的C57BL/6小鼠是饮食引起肥胖及相关代谢综合征的确定模型。"HFD-对 照"小鼠被喂食高脂肪饮食(HFD)并且经由腹腔注射从而施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)Z'HFD-mAb"小鼠被喂食ΗΠ)饮食，并且经由腹腔注射，以每周60mg/kg体重(BW)施用PBS中的抑胃肽 的单克隆抗体(GIP mAb)拮抗剂。"等热量饮食"小鼠被喂食低脂肪等热量的饮食，而且不进 行治疗。在ΗΠ )饮食中，总热量的60%来自脂肪，而在等热量饮食中，总热量的10%左右来自 脂肪。施用GIP mAb的小鼠重量增加不太快。17周的研究期后，HFD-对照小鼠的平均重量增 量为21.5 ± 1.0g。17周的研究期后，HFD-mAb小鼠的平均重量增量为11.5 ± 0.5g。这两组之 间的重量增量差异显著，P值为〇.〇〇〇〇〇〇07。
[0039] 图1B示出了三组不同的小鼠中，重量增量百分比vs.时间的图示。施用GIP mAb的 小鼠重量增加不太快。在HFD-对照小鼠重量增量几乎是HFD-mAb小鼠增重速度的两倍。 [0040]图2是表示腹膜内（i.p.)葡萄糖耐量试验（IPGTT)的结果的图示。17周的研究期 后，对来自各组的6只小鼠进行IPGTT。腹膜内施用葡萄糖溶液(2mg葡萄糖/kg小鼠体重)后， 在第〇分钟、第10分钟、第30分钟、第60分钟和第120分钟收集血液，并测定葡萄糖含量。在图 中绘制了血糖浓度相对于时间的曲线。HFD-对照小鼠比HFD-mAB小鼠或等热量饮食小鼠在 处理腹膜内葡萄糖负荷的能力方面的效率低。这与HFD-对照小鼠中葡萄糖耐受不良的发展 相一致，但是HFD-mAB小鼠或等热量饮食小鼠没有出现这种情况。
[0041]图3示出了小鼠的代表性的磁共振图像。示出的是来自HFD-对照小鼠（左）和HFD-mAb 小鼠 （右） 的代表性图像。图像描绘了小鼠的侧视图 ，其中小鼠的前部在图像的上部，小 鼠的后部在图像的下部。白色或明亮区域代表脂肪含量高的区域。
[0042]图4示出了由弛豫补偿脂肪分级(RCFF)MRI得到的肝脏脂肪份数。在17周的饮食期 结束时，对来自各组的6只小鼠进行麻醉并进行MRI。使用RCFF技术对各小鼠的肝脏脂肪份 数进行定量评估。用每个治疗组的平均肝脏脂肪份数绘图。与利用GIP-特异性mAb(p = 0.03)治疗的小鼠相比，对照动物的肝脏内积聚了几乎2倍的脂肪量。
[0043] 图5示出了 17周的饮食期后，由弛豫补偿脂肪分级（RCFF)MRI得到的网膜脂肪份 数。用每个治疗组的平均网膜脂肪份数绘图。与利用GIP-特异性mAb治疗的小鼠相比，对照 动物积聚了几乎3.5倍的网膜脂肪量(p = 0.0005)。
[0044] 图6示出了由弛豫补偿脂肪份数(RCFF)MRI得到的皮下脂肪份数。用每个治疗组的 平均皮下脂肪份数绘图。与利用GIP-特异性mAb治疗的小鼠相比，对照动物的积聚了大约2 倍的皮下脂肪量(P = 〇. 0002)。
[0045] 图7示出了 17周的研究期后，来自被处死小鼠肝脏的染色组织横截面的代表性照 片。取出肝脏并固定在福尔马林中。将固定的组织切片，并用油红0染色，脂溶性偶氮 (lysochrome diazo)染料用于中性甘油三酯和脂质的染色。图片示出了代表性样品，示出 了与HFD-对照小鼠（左)相比，在HFD-mAb小鼠（右）的肝脏中，深红色的脂肪滴显著减少。 [0046]图8是17周的研究期后，在HFD-对照小鼠（左）中与HFD-mAb小鼠（右）中找到的网膜 脂肪的两张(一组)比较图片。脂肪是白色的，在HFD对照鼠中可见到更多的脂肪。
[0047]图9示出了在小鼠血清中测定的甘油三酯(TG)水平。在17周的饮食期结束时，处死 小鼠，收集全血，制备血清并测定血清甘油三酯。用各组中小鼠的平均血清甘油三酯水平绘 图。在HFD-对照组小鼠中的TG水平是HFD-mAM、鼠中的TG水平的1.44倍(p = 0.02)。较高的 TG水平与肥胖和代谢综合征相关。
[0048]图10示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的总胆固醇（TC)水平。HFD-对 照组小鼠中的TC水平是HFD-mAb小鼠中TC水平的1.55倍(p = 0.006)。较高的TC水平与肥胖 和代谢综合征相关。
[0049] 图11示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的高密度脂蛋白（HDL)占总胆 固醇(TC)的比例。用各组的平均值绘图。在HFD-mAb小鼠中HDL占总胆固醇的比例比HFD-对 照小鼠中HDL占总胆固醇的比例高2 5 % (p值=0.0 3)。期望的是HDL占总胆固醇的比例较高， 因为低比例与肥胖和代谢综合征相关。
[0050] 图12出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的低密度脂蛋白（HDL)水平。用各 组中小鼠的平均血清LDL水平绘图。在HFD-对照小鼠中LDL是HFD-mAb小鼠中LDL的1.95倍(p =0.007)。较高的LDL("坏"胆固醇)水平与肥胖和代谢综合征相关。
[0051] 图13示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的胰岛素水平。用来自各组的5 只小鼠的平均血清胰岛素水平绘图。在HFD-对照小鼠中的胰岛素水平是HFD-mAb小鼠中胰 岛素水平的2.6倍(p = 0.03)。较高的胰岛素水平与肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征相关。请 注意y轴的单位为皮克/毫升。
[0052] 图14示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的脂连蛋白水平。用各组中的 小鼠的平均血清脂连蛋白水平绘图。在HFD-对照组小鼠的中脂连蛋白水平是HFD-mAb小鼠 脂连蛋白水平的1.35倍。较高的脂连蛋白水平与总体内脂肪增加有关。请注意y轴的单位为 微克/_升。
[0053] 图15示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的瘦素水平。用各组中的小鼠 的平均血清瘦素水平绘图。在HFD-对照组小鼠中瘦素水平是HFD-mAb小鼠瘦素水平的5.73 倍。较高的瘦素水平与总体内脂肪增加有关。请注意y轴的单位为皮克/毫升。
[0054] 图16示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的胰高血糖素水平。用各组中 的小鼠的平均血清胰高血糖素水平绘图。各组之间的血清胰高血糖素水平没有显著差异。 请注意y轴的单位为皮克/毫升。
[0055] 图17示出了 17周的饮食期后，在小鼠的血清中测得的胰高血糖素样肽l(GLP-l)水 平。用各组中的小鼠的平均血清GLP-1水平绘图。各组之间的血清GLP-1水平没有显著差异。 请注意Y轴的单位为皮克/毫升。
[0056] 图18示出了在体外中和测定中，三种用于GIP的人源化抗体、以及原始抗体、阳性 对照和阴性对照的相对活性的图示。y轴是相对活性，并且是无单位的。
[0057]发明详述
[0058]除非上下文中另有明确说明，否则单数形式"一"，"一个"和"该"包括其复数形式。
[0059] 如在本说明书和权利要求中所使用的，开放式过渡词语"包含"、"包括"、"具有"、 "含有"及其变体要求存在指定成分/步骤并允许其他成分/步骤的存在。这些短语也应理解 为公开了仅允许指定成分/步骤和不可避免的杂质，并排除其他成分/步骤的封闭式短语 "由...组成"或"基本上由...组成"。
[0060] 本申请的说明书和权利要求书中的数值应理解为包括当保留到相同的有效数时 数值相同的值，以及与所限定的数值的差距小于本申请中所描述的常规测量技术会产生的 实验误差的值。
[0061] 本文所公开的所有范围都包括引入的端点值，并可以单独组合（例如，"从2g至 1 〇g"的范围包括端点2g和10g以及所有的中间值）。
[0062] 术语"约"可以用于包括在不改变值的基础功能的情况下能够变化的任意数值。当 与范围联用是，"约"也公开了由两个端点的绝对值所限定的范围。例如，表述"从约2至约4" 也公开了"从2至4"的范围。术语"约"还可以指给定值±10%。
[0063] 术语"同一性"指的是一对序列(核苷酸或氨基酸)之间的相似性。同一性是通过将 相同的残基数除以残基的总数，并且将商乘以1〇〇以获得百分比从而进行测定的。因此，完 全相同的序列的两个拷贝具有100%的同一性，但是较少高度保守、并且具有缺失、添加或 置换的序列可能具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到有几种计算机程序可以 用于确定序列的同一性，例如那些采用诸如BLAST之类的算法的程序。BLAST核苷酸搜索是 使用NBLAST程序进行，并且BLAST蛋白质搜索是利用BLASTP程序进行的，其中使用了各程序 的默认参数。
[0064] 两个不同的序列可以彼此不同，而不影响由该序列编码的蛋白质的整体功能。在 这方面，本领域已知的是化学上相似的氨基酸可以相互取代，通常功能不会发生改变。相关 属性可以包括酸性/碱性、极性/非极性、电荷、疏水性和化学结构。例如，碱性残基Lys和Arg 被认为是化学上相似的，并且经常互相取代，还有的例子是酸性残基Asp和Glu、羟基残基 Ser和Thr、芳香族残基Tyr、Phe和Trp以及非极性残基41&、￥&1、116、1^11和1^丨。这些置换被 认为是"保守的"。同样地，核苷酸密码子和可接受的变化在本领域中也是公知的。例如，密 码子ACT、ACC、ACA和ACG都编码氨基酸苏氨酸，即第三个核苷酸可以在不改变所得到的氨基 酸的情况下进行变化。通过相似的残基数除以残基的总数，在将商乘以100,以得到百份比， 从而测定相似性。注意，相似性和同一性测量不同的性质。
[0065] "抗体"是免疫系统用来识别靶抗原的蛋白质。抗体的基本功能单位是免疫球蛋白 单体。单体由形成为γ形蛋白质的两个相同的重链和两个相同的轻链构成。每条轻链由一个 恒定域和一个可变域组成。对于轻链，恒定域也可以被称为"恒定区"，而可变域也可以被称 为"可变区"。每条重链由一个可变域和三个或四个恒定域组成。对于重链，恒定域一起被称 为"恒定区"，而可变域也可以被称为"可变区"。Υ的臂被称为片段，抗原结合(Fab)区，每个 臂被称为Fab片段。每个Fab片段由来自重链的一个恒定域和一个可变域，以及来自轻链的 一个恒定域和一个可变域组成。Y的基部称为Fc区，由来自每个重链的两个或三个恒定域组 成。在Fab区中的重链和轻链的可变域是抗体的结合GIP的部分。更具体地，可变域的互补决 定区（CDR)结合它们的抗原（即，GIP)。在每个可变域的氨基酸序列中，设置有非连续的三个 ⑶R。术语"完整"在本文中用于指包含Fab区和Fc区的抗体。
[0066] 根据本公开的"GIP的拮抗剂"是结合GIP并干扰GIP的生物作用的分子。
[0067] 本公开涉及利用拮抗GIP的分子（即与GIP结合)来治疗患者的方法。在这方面，葡 萄糖依赖性促胰岛素多肽(也被称为抑胃肽或GIP)是在餐后由肠 K-细胞释放的促胰岛素 肽。作为肠降血糖素，GIP通过响应于食物摄入来刺激胰腺细胞从而刺激胰岛素的分泌。 GIP(本文中也记载为GIP(l-42))主要作为42个氨基酸的多肽进行循环，但也也缺乏前2个Ν 端氨基酸的形式存在(61?(3-42))。61?(1-30)-順2或61?(1-30)-€1-酰胺是61?(1-42)的合 成衍生物，其缺少最后12个C端氨基酸。GIP(l-30)-NH 2具有与GIP(l-42)相同的生物学功 能。已经推测有天然存在的GIP( 1-30)-NH2，但还没有在任何生物物种中被确定。
[0068] GIP通过结合靶细胞表面上的其同源受体(GIPR)来发挥作用。GIPR是具有七次跨 膜域的G-蛋白偶联受体(GPCR)的胰高血糖素分泌素家族中的一员。天然GIP(l-42)和合成 衍生物GIP(l-30)-NH 2以高亲和力结合至GIPR并且其具有激动剂性质。GIP受体也在脂肪细 胞中表达，其响应于由于葡萄糖摄取的增加、脂肪酸合成以及脂肪酸进入到脂肪细胞内的 脂质中而导致的GIP水平升高。天然GIP(l-42)和合成衍生物GIP(l-30)-NH：dil抑制由胰高 血糖素和β肾上腺素受体激动剂(包括异丙基肾上腺素)所诱导的脂肪细胞内脂解作用。 [0069] GIP在人（智人）（SEQ ID Ν0:1)、小鼠（小家鼠 ）（SEQ ID Ν0:2)、大鼠（褐家鼠 ）（SEQ ID N0:3)和猪(野猪）（SEQ ID N0:4)之间是高度保守的。在这四个序列之间仅存在四个置 换，所有这些都是保守的。来自这四个物种的42个氨基酸的序列如下所示：
[0074]本申请涉及利用包含结合GIP的分子拮抗剂的组合物来治疗脂肪肝疾病(FLD)的 方法，还涉及治疗与脂肪组织积聚有关的其他疾病的方法。在特定的实施方案中，所述分子 拮抗剂是完整单克隆抗体（即，GIP mAb)。在脂肪肝中，脂肪变性导致甘油三酯脂肪在肝细 胞内积聚。已知的是口服葡萄糖后，血清GIP水平增加5至6倍，其刺激胰岛素释放，这促进了 葡萄糖摄取。GIP还激活Akt/PKB，促进葡萄糖转运体4的膜易位，从而导致增强葡萄糖的脂 肪细胞摄取，导致脂肪的生产与储存。其结果是，据推测，诘抗GIP并降低其生物活性将抑制 葡萄糖吸收，由此导致脂肪生产和储存降低。本公开示出了可以通过向患者施用包含GIP单 克隆抗体拮抗剂的组合物，来减少在肝脏、网膜或皮下组织中的脂肪滞留。其他的分子拮抗 剂(它们在单克隆抗体的CDR上存在变化)也可以有效地减少脂肪组织积聚。
[0075] 本文描述的GIP分子拮抗剂也可以用于改善可以通过降低GIP表达或通过减少热 量摄取或减肥来治疗的其他疾病或病症，如肥胖症、代谢综合征、高脂血症、II型糖尿病和 食物诱导的库欣综合征。
[0076] 本公开的GIP单克隆抗体拮抗剂可以通过以下方式产生和分泌。具有以下氨基酸 序列的两种肽是经由化学合成的：
[0079] GIP(1_17)+C的氨基酸序列对应于通常由发育成熟的人、小鼠、大鼠和猪GIP所共 享的前17个氨基酸。该序列还包含在N-末端的额外半胱氨酸残基以促进与钥孔血蓝蛋白 (KLH)的缀合。C+mGIP(26-42)的氨基酸序列对应于成熟小鼠 GIP的最后17个氨基酸，当分别 与壬GIP或者猪GIP相比是，仅由两个氨基酸置换，当与大鼠 GIP相比时仅有三个氨基酸置 换。该序列还包含在C-末端的额外半胱氨酸残基以促进于KLH的缀合。两种肽被缀合到KLH。 然后各缀合物分别用于在四个不同场合下注入一组(4只）小鼠中。在第1周、第4周、第7周、 第10周和第24周注入，随后收集脾脏。
[0080] 从经免疫的小鼠中取出脾脏，并分离脾细胞，之后在体外用无限增殖的骨髓瘤细 胞融合B细胞。在该融合过程中加入聚乙二醇(PEG)，以提高效率。融合细胞或杂交瘤在次黄 嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基中培育14天，以杀死不与B细胞融合的骨髓瘤细胞。然后 用培养介质稀释杂交瘤细胞，并转移到一系列96孔板。稀释的程度为每孔大约包含一个细 胞。使杂交瘤细胞生长数天，之后收集用于筛选的调理培养液或上清液。
[0081 ] 利用50μ1的4μg/ml合成小鼠 GIP(l-42)(菲尼克斯制药公司）的PBS溶液覆盖96孔 板。然后收集杂交瘤的上清液，并加入到含有小鼠 GIP(l-42)的孔中，在37°C下保持4小时。 然后将上清液除去并洗涤以除去未结合小鼠 GIP任何抗体。接着，将用辣根过氧化物酶 (HRP)缀合的山羊抗小鼠 lgG的溶液加入到该孔中。山羊抗小鼠 IgG-HRP是从Jackson实验室 获得的，并以1: 5000稀释，在37°C下培育1小时后，除去抗体溶液，然后用0.4mg/ml BSA的 PBS溶液洗涤该孔2次。
[0082]然后将溶液加入到各孔中，所述溶液包含在0.4mg/ml的过氧化氢脲中的HRP底物 4mg/ml的邻苯二胺二盐酸盐(0P0)以及0.05M的磷酸盐-柠檬酸盐，pH为5.0。为了量化HRP活 性，使用ELISA板读数器测量各孔在波长为490nm的光下的吸光度。这能够由杂交瘤鉴定出 孔内所产生的将结合小鼠 GIP的单克隆抗体。
[0083]接着，在37°C下，将来自鉴定的杂交瘤的上清液随后用4μg/ml的小鼠 GIP溶液混合 30分钟，然后加入到如上所述覆盖有小鼠 GIP的孔中。在37°C培育1小时后，洗涤各孔，并将 山羊抗小鼠 IgG-HRP加入到孔中。培育1小时后，洗涤样品并向各孔中添加溶液，所述溶液包 含在0.4mg/ml的过氧化氢脲中的HRP底物4mg/ml的0P0以及0.05M的磷酸盐-柠檬酸盐，pH为 5.0。对各孔中的HPR活性进行定量。在此筛选中，结合悬浮液中GIP的单克隆抗体将会是"中 性的"并且不能与固定在孔中的GIP结合。因此，具有低HPR活性的孔对应于更有效地结合悬 浮液中GIP的单克隆抗体。使用这些标准，鉴定出五个杂交瘤，这些杂交瘤能够最佳地产生 会与悬浮液中小鼠 GIP结合的单克隆抗体(mAb)。由于在小鼠 GIP和人GIP之间的同一"性高度 对应，预期这些结合于小鼠 GIP的单克隆抗体也将结合人GIP。
[0084]接着，使用细胞培养系统对杂交瘤上清液中和GIP并抑制配体-受体相互作用、受 体激活和受体依赖的信号转导的能力进行测试。该系统中使用了报道细胞(LGIPR2细胞）， 其具有受环磷酸腺苷（cAMP-)响应启动子控制的lacZ基因，并且在细胞表面上表达大鼠 GIPR。向这些细胞中添加 GIP导致GIPR的活化，诱导致使cAMP积聚的信号级联，诱导lacZ基 因并合成β半乳糖苷酶。在添加试样并培育4小时后，用比色测定法来测量细胞裂解物中β半 乳糖苷酶含量。色度的改变与β半乳糖苷酶的活性水平成正比。β半乳糖苷酶的活性水平是 取决于试样中游离的具有生物活性的GIP的量。
[0085]利用小鼠或人GIP以1:1和1:20分别稀释来自培养物中生长的五个杂交瘤克隆（它 们在悬浮测定中被评分为阳性)的上清液，然后将混合物加入到LGIPR2细胞并培育，之后洗 涤并对β半乳糖苷酶进行测定。当以1:1稀释时，五个上清液中的三个显示出对于小鼠 GIP的 显著抑制，当以1:20稀释时，三个上清液中的两个显示出对于小鼠 GIP的显著抑制。
[0086]为了证明单克隆抗体对GIP具有特异性，用O.lnM的人类胰高血糖素样肽-1(GLP-1)溶液以1:1稀释五个杂交瘤(它们在悬浮测定中被评分为阳性）的上清液。然后将混合物 加入到LGLP-1R细胞。LGLP-1R细胞类似于LGIPR2细胞，不同之处在于它们表达GLP-1受体， 而不是GIPR。将细胞在37°C下培育4小时，之后去除混合物，将细胞洗涤，并测定β半乳糖苷 酶含量。没有上清液抑制天然GLP-1，表明单克隆抗体对GIP具有特异性。
[0087] 接着，将两个杂交瘤扩增，并收集~5Χ 105个细胞，利用购自41]113；[011(1^^91160118- 4PCR，Life Technologies)的试剂盒制备总RNA，其中所述两个杂交瘤产生当以1:20稀释时 显示出对小鼠 GIP显著抑制的上清液。用2微克的总RNA，利用购自Life Technologies的 cDNA合成用Suprscript III第一链系统来制作第一链cDNA。所得的cDNA用于在两个单独的 聚合酶链反应(PCR)中扩增编码重链和轻链可变序列的cDNA。
[0088] 为了扩增重链可变序列，将具有序列CAGTCGAAGC TTTGAGGAGA CGGTGACCGTG GTCCCTTGGC CCCAG(SEQ ID如:43)的寡核苷酸用作反向引物，并将具有序列0六六(^六66八丁 CCAGGTSMAR CTGCAGSAGT CWGG(SEQ ID N0:44)的寡核苷酸序列作为正向引物。反向引物在 其5 '端含有序列AAGCTT (SEQ ID N0:45)，这是限制性内切酶Hindm的识别序列。正向引物 在其5'端含有序列GGATCC(SEQ ID N0:46)，这是限制性内切酶BamHI的识别序列。PCR的所 得产物用限制性内切酶Hindll I和BamHI消化，然后连接到也用限制性内切酶Hindll I和 BamHI消化的质粒pUC18中。使用购自Epicentre的Fast-Link试剂盒进行连接反应。连接反 应用于转化大肠杆菌DH5a细菌细胞(Life Technologies)。在含有50微克/毫升(μg/ml)羧 苄青霉素的琼脂板上筛选携带质粒的细菌。挑取在羧苄青霉素琼脂板上生长的菌落并使其 在2ml培养基中生长16小时。收集细菌并用碱裂解小量制备法分离质粒DNA。用限制性内切 酶BamHI和HindllI消化纯化的质粒DNA，之后通过在Tris-硼酸盐缓冲液中的1.2%琼脂糖 凝胶中，通过电泳将DNA解析(re so 1 ve)。在凝胶中的DNA片段用溴化乙锭染色，并使用紫外 灯观察。使用购自Eurofins MWG Operon(Huntsville，AL)的装置，对产生了具有大约374个 碱基对分子大小的限制性片段的质粒进行测序。
[0089] 为了扩增轻链可变序列，大体按照如上所述进行了相同的步骤。主要的不同点在 于，将具有序列：CAGTCGAAGC TTGTTAGATC TCCAGCTTG GTCCC(SEQ ID N0:47)的寡核苷酸用 作正向向引物，并将具有序列CAACTAGGAT CCGACATTCA GCTGACCCAG TCTCCA(SEQ ID NO: 48)的寡核苷酸用作反向引物。正向引物仍然包含HindIII的识别序列（SEQ ID NO:45)，反 向引物包含BamHI的识别序列（SEQ ID N0:46)。使用购自Eurofins MWG Operon (HuntSVille，AL)的装置，对产生了具有大约355个碱基对分子大小的限制性片段的质粒进 行测序。
[0090] 使用上述步骤鉴定而得到的mAb为小鼠抗体。通过形成嵌合抗体，从而将这些小鼠 抗体部分地人源化，该嵌合抗体具有分别融合到人重链恒定区和轻链恒定区的小鼠重链可 变域和轻链可变域。这是通过利用聚合酶链式反应(PCR)扩增重链和轻链可变序列来完成 的。PCR中使用的模板是pUC18衍生物，其包含对应的可变重链cDNA序列或可变轻链cDNA序 列。使用具有序列TCACGAATTC TCAGGTCCAG CTGCAGGAGT(SEQ ID N0:49)的寡核苷酸作为正 向引物，具有序列TTGGTGCTAG CTGAGGAGAC GGTGACCGT(SEQ ID N0:50)的寡核苷酸作为反 向引物，扩增重链可变区。正向引物在其5 '端含有序列GAATTC(SEQ ID NO: 51)，这是限制性 内切酶EcoRI的识别序列。反向引物在其5 '端含有序列GCTAGC(SEQ ID N0:52)，这是限制内 切酶Nhel的识别序列。PCR扩增后，将DNA片段用EcoRI和Nhel消化并连接到也用限制性内切 酶EcoRI和Nhel消化的质粒pFUSEss-CHIg-hGl 中。质粒pFUSEss-CHIg-hGl是购自 InvivoGen (San Diego，CA)的哺乳动物表达载体。将可变重链cDNA序列克隆到该质粒中，从而产生编 码由小鼠可变区和人可变区构成的嵌合重链的基因。使用购自Epicentre的Fast-Link试剂 盒进行连接反应。连接反应用于转化大肠杆菌DH5a细菌细胞(Life Technologies)。在含有 50μg/ml博来霉素的琼脂板上筛选携带质粒的细菌。挑取在博来霉素琼脂板上生长的菌落 并使其在2ml培养基中生长16小时。收集细菌并用碱裂解小量制备法分离质粒DNA。用限制 性内切酶EcoRII和Nhel消化纯化的质粒DNA，之后通过在Tri s-硼酸盐缓冲液中的1.2 %琼 脂糖凝胶中，通过电泳将DNA解析。在凝胶中的DNA片段用溴化乙锭染色，并使用紫外灯观 察。通过鉴定出具有373个碱基对分子大小的DNA片段，从而确认克隆成功。
[0091] 使用具有序列GTCACGAATTCAGACATTCAGCTGACCCAG(SEQ ID N0:55)的寡核苷酸作 为正向引物，使用具有序列AGCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCA(SEQIDN0 :53)作 为反向引物扩增轻链可变区，正向引物序列含有限制性内切酶EcoRI的识别序列（SEQ ID NO: 51)。反向引物在其5 '端含有序列CGTACG(SEQ ID NO: 54)，这是限制内切酶BsiWI的识别 序列。PCR扩增后，将DNA片段用EcoRI和BswiI消化，并连接到也用限制性内切酶EcoRI和 BswiI消化的质粒pFUSE2ss_CLIg-hK中。质pFUSE2ss_CLIg-hK是购自 InvivoGen( San Diego，CA)的哺乳动物表达载体。将可变轻链cDNA序列克隆到该质粒中，从而产生编码由小 鼠可变区和人恒定区构成的嵌合轻链的基因。使用购自Epicentre的Fast-Link试剂盒进行 连接反应。连接反应用于转化大肠杆菌DH5a细菌细胞(Life Technologies)。在含有50yg/ ml杀稻痕素(blastocidin)的琼脂板上筛选携带质粒的细菌。挑取在杀稻痕素琼脂板上生 长的菌落并使其在2ml培养基中生长16小时。收集细菌并用碱裂解小量制备法分离质粒 DNA。用限制性内切酶EcoRII和BsiWI消化纯化的质粒DNA，之后通过在Tris-硼酸盐缓冲液 中的1.2%琼脂糖凝胶中，通过电泳将DNA分离。在凝胶中的DNA片段用溴化乙锭染色，并使 用紫外灯观察。通过鉴定出具有353个碱基对分子大小的DNA片段，从而确认克隆成功。
[0092] 为了表达含有克隆自杂交瘤的可变区和人恒定区的嵌合载体，将分别包含可变重 链和可变轻链序列的pFUSEss-CHIg-hGl和pFUSE2ss-CLIg-hK衍生物引入到中国仓鼠卵巢 (CH0-1)细胞中培养。质粒DNA通过使用阳离子脂质试剂Turbofect(Thermo Scientific， Pittsburgh，PA)转染引入，从而有利于DNA进入到培养的细胞中。转染后两天，收集细胞上 清液并对GIP中和活性进行分析。为了证明嵌合mAb中和GIP的能力，将细胞上清液与等体积 的2X 10、hGIP混合，之后在培养中添加 LGIPR2细胞。在37°C下培育4小时后，将细胞裂解 并测定β半乳糖苷酶活性。在该测定中，包含来自指定为l〇gl〇杂交瘤的可变轻链序列和可 变重链序列的质粒组合在基于细胞的报道分析中具有中和GIP的活性。
[0093] 保留使用上述公开的步骤制作并鉴定的mAb的可变区，并用人恒定区替换上述恒 定区。可选地，可以使用转基因小鼠来制造 GIP mAb拮抗剂，从而产生"全"人mAb，或者也可 以使用其他技术。例如，可以用在人抗体中保守的氨基酸来替换在小鼠抗体中保守的可变 域的氨基酸。
[0094] 由此得到的单克隆抗体拮抗剂与GIP结合。在特定的实施方案，在本公开的组合物 中使用的分子拮抗剂可以结合到选自由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID NO :4构成的组中的氨基酸序列。换句话说，拮抗剂(例如单克隆抗体)结合包含在这四个序 列中的表位。
[0095] 在各种实施方案中，该分子拮抗剂的分子量为约30kDa至约500kDa，包括约120kDa 至500kDa。在其他实施方案中，该分子拮抗剂具有对GIP的结合亲和力，特征在于IC5Q为约 O.lnM 至约 7nM。
[0096] 如前所述，结合GIP的单克隆抗体拮抗剂具有结合GIP的轻链可变域以及重链可变 域，或者更具体地说是结合GIP的轻链可变域的CDR以及重链可变域的CDR。通常设想的是， 本公开的分子拮抗剂包含至少一个结合GIP的互补决定区（CDR)。更具体地，分子拮抗剂包 含至少一个与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少 80%同一性的⑶R。通过在上述提到的10gl0杂交瘤中识别的轻链和重链中的可变域的各种 修改，从而识别这些⑶R。这些修改都将在下面的实施例部分更详细地进行讨论。更理想的 是，所述（多个)CDR与这些氨基酸序列有/具有至少85%、或至少90%、或至少95%或至少 100%的同一性。在更具体的实施方案中，分子拮抗剂包含两个、三个、四个、五个或六个 ⑶R，这些⑶R与上述组中的两个、三个、四个、五个或六个不同氨基酸具有必要同一性。
[0097] 在更具体的实施方案中，分子拮抗剂包括具有第一CDR和第二CDR的轻链可变域， 各CDR与选自由SEQIDN0:20、SEQIDN0 :21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23和SEQIDN0: 24构成的组中的氨基酸序列具有至少95%同一性。在轻链的可变域中识别出这些⑶R。更理 想的是，所述⑶R与这些氨基酸序列具有100 %的同一性。
[0098]在其他特定的实施方案中，分子拮抗剂包括轻链可变域，其具有与SEQ ID N0:20 的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID N0:21的氨基酸序列具有至少 80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:22的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。含 有这三个CDR的组合的可变域被鉴定为具有非常高的GIP结合亲和力。更理想的是，所述三 个⑶R与这些氨基酸序列具有至少85%、或至少90%、或至少95%的同一性、或100%的同一 性。
[0099]在另外的实施方案中，分子拮抗剂包括重链可变域，其具有与SEQ ID N0:31的氨 基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少80%同 一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。含有这三 个CDR的组合的可变域被鉴定为具有非常高的GIP结合亲和力。更理想的是，所述三个CDR与 这些氨基酸序列具有至少85%、或至少90%、或至少95%的同一性、或100%的同一性。
[0100] 通常设想的是，这些可变域包含两个或三个如上规定的⑶R，并且⑶R通过连接基 团相互接合。连接基团通常可以是允许CDR结合GIP的任意基团。例如，所述连接基团可以是 氨基酸链，如存在于抗体的天然可变域内的那样。氨基酸可以具有任何所需的长度。
[0101]在特定的实施方案中，分子拮抗剂包括轻链可变域，其与选自由SEQ ID N0:16、 SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:19构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一 性。更理想地，轻链可变域与这些氨基酸序列之一具有至少85%、或至少90%、或至少95% 或者100%的同一性。这些可变域包含与氨基酸连接在一起的SEQ ID N0:20、SEQ ID N0: 21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24的轻链CDR的各种组合。
[0102] 在其他实施方案中，分子拮抗剂包括重链可变域，其与选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。 更理想地，重链可变域与这些氨基酸序列之一具有至少85 %、或至少90 %、或至少95 %或者 100%的同一性。这些可变域包含与氨基酸连接在一起的SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的重链CDR的各种组合。
[0103] 还考虑了具有上述公开的轻链可变域和重链可变域的任何组合的分子拮抗剂。更 具体地，一些分子拮抗剂仅包含一个轻链可变域和一个重链可变域。其他分子拮抗剂包含 多个轻链可变域和重链可变域;在这些实施方案中，通常而言，多个轻链可变域是相同的， 并且多个重链可变域是相同的。
[0104] 在一些具体的实施方案中，分子拮抗剂包含一个轻链可变域和重链可变域。所述 轻链可变域包括第一CDR和第二CDR，各CDR与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24构成的组中的氨基酸序列具有至少95%同一性;并且 所述重链可变域包括与SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80 %同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨基酸序列具 有至少80%同一性的第三⑶R。轻链可变域可以与所列出的氨基酸序列之一具有100%的同 一性。更具体地，重链可变域与所列出的氨基酸序列之一具有至少85%、或至少90%、或至 少95%或者具有100%的同一性。
[0105] 在一些其他具体的实施方案中，分子拮抗剂包括轻链可变域和重链可变域。所述 轻链可变域与选自由SEQIDN0:16、SEQIDN0 :17、SEQIDN0:18和SEQIDN0:19构成的 组中的氨基酸序列具有至少80%同一性;并且所述重链可变域与选自由SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。 更具体地，所述轻链可变域和/或所述重链可变域与它们列出的氨基酸序列之一具有至少 85%、或至少90%、或至少95%或者具有100%的同一性。
[0106] 在还一些更具体的实施方案中，分子拮抗剂包括与SEQ ID N0:18具有至少80%同 一性的轻链可变域，以及与选自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组 中的氨基酸序列具有至少80%同一性的重链可变域。此外，这些可变域能够与它们列出的 氨基酸序列之一具有至少85%、或至少90%、或至少95%或者具有100%的同一性。
[0107]在特别有利的实施方案中，分子拮抗剂包括与SEQ ID N0:18具有至少90%同一性 的轻链可变域，以及与SEQ ID N0:29具有至少90%同一性的重链可变域。在更具体的实施 方案中，这些可变域能够与它们列出的氨基酸序列之一具有至少95%或者能够具有100% 的同一性。
[0108] 在一些不同的实施方案中，本公开的分子拮抗剂具有如上所述的轻链可变域和重 链可变域。特别预期的是，分子拮抗剂可以是单链可变片段（scFv)、F(ab'） 2片段、Fab或 Fab '片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体或单克隆抗体，这些可变域为上述这些的一部分。
[0109] 单链可变片段(scFv)包括轻链可变域和重链可变域，通常通过连接基团接合在一 起，该连接基团通常的长度为约10至约25个氨基酸（虽然它不必一定在此范围内）。一个可 变域的N-末端被连接到其他可变域的C末端。如果需要的话，所述scFv可以被PEG化(用聚乙 二醇），以增加其大小，如利用certolizumab单抗那样。两个scFv可以利用另一连接基团接 合在一起，以产生串联scFv。
[0110] 如果轻链可变域和重链可变域通过短的连接基团接合在一起以形成scFv，那么这 两个可变域不能折叠在一起，scFv将发生二聚化以形成二价抗体。甚至更短的连接基团也 可能导致形成三聚体(即，三价抗体)和四聚体(即，四价抗体）。
[0111] 完整单克隆抗体由两条重链和两条轻链形成。再次，每个轻链和每个重链包含一 个可变域。每条轻链与重链结合。两个重链在铰链区接合在一起。如果去除铰链区以下的重 链恒定区，则产生了包含总共四个可变域的F(ab'）2片段。该F(ab'）2片段可以被分成两个 Fab'片段。Fab'片段包含来自铰链区的巯基。当去除铰链区以上的重链恒定区时，形成Fab 片段，并且不包含来自铰链区的巯基。然而，所有这些片段都包含轻链可变域和重链可变 域。
[0112] 在下面描述的实验中探讨的所期望的实施方案中，分子拮抗剂是由上述具有可变 区/域的轻链和重链与人恒定区一起形成的完整单克隆抗体。重链恒定区可以是任何人类 同种型，包括IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。人轻链恒定区可以是κ或λ 同种型。在具体的实施方案中，重链恒定区是IgGl同种型，且轻链恒定区是κ同种型。
[0113]在特定的实施方案中，分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变域的单克隆抗 体，所述轻链可变域与SEQ ID N0:18具有至少80 %同一性，并且所述重链可变域与选自由 SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一 性。这些可变域能够与它们列出的氨基酸序列之一具有至少85%、至少90%、至少95%或者 能够具有100%的同一性。
[0114] 在其他特定的实施方案中，分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变域的完整单 克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID N0:18具有至少90%同一性，并且所述重链可变域与 SEQ ID N0:29具有至少90%同一性。这些可变域能够与它们列出的氨基酸序列之一具有至 少95 %或者能够具有100 %的同一性。
[0115] 然后，能够将GIP的分子拮抗剂(其特定形式为单克隆抗体）用在向患者施用的组 合物中。该组合物包含药学上有效量的GIP的分子拮抗剂。在特定实施方案中，组合物的分 子拮抗剂的量为约0.1至约1000毫克/毫升组合物(w/V)。
[0116] 包含GIP的分子拮抗剂的药物组合物通常是通过胃肠外（即皮下、肌内、，静脉内、 腹膜内、胸腔内、囊内或鞘内）途径施用，根据药物和疾病需要进行选择。在特定的制剂或应 用中使用的剂量将由疾病特定状态的要求，并通过载体材料的能力特性所带来的限制因素 来确定。预期的是在最有利的形式中，组合物将以静脉内、腹膜内或皮下施用。
[0117] 药物组合物可以包括药学上可接受的载体。该载体充当用于递送分子拮抗剂的媒 介。药学上可接受的载体的实例包括分子拮抗剂可以溶解或悬浮于其中的液体载体(如水、 油和醇）。
[0118] 药物组合物还可以包括赋形剂。具体的赋形剂包括缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、 填充剂、聚合物和稳定剂，它们对于这些分子的拮抗剂而言是有用的。缓冲剂用于控制组合 物的pH值。表面活性剂用于稳定蛋白质、抑制蛋白质聚集、抑制蛋白质吸附到表面上，并协 助蛋白质重折叠。示例性的表面活性剂包括吐温80、吐温20、Brij 35、Triton X-10、 PlUr〇nicF127和十二烷基硫酸钠。防腐剂用于抑制微生物生长。防腐剂的实例包括苯甲醇、 间甲酚和苯酚。在冻干过程中使用填充剂，从而增加体积。亲水性聚合物(如葡聚糖、羟乙基 淀粉、聚乙二醇、明胶)可用于稳定蛋白质。具有非极性部分的聚合物(如聚乙二醇聚合物） 也可以用作表面活性剂。蛋白稳定剂可包括多元醇类、糖类、氨基酸类、胺类和盐类。合适的 糖类包括蔗糖和海藻糖。氨基酸类包括组氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷 氨酸，以及它们的混合物。如人血清白蛋白之类的蛋白质也可以竞争性地吸附到表面上，并 且降低蛋白质样分子拮抗剂的聚集。应当注意的是，特定的分子可用于多种目的。例如，组 氨酸可作为缓冲剂和抗氧化剂。甘氨酸可以用作缓冲剂和填充剂。
[0119] 药物组合物可以是粉末、注射剂、溶液、悬浮液或乳液的形式。可以设想的是该组 合物将通过注射递送。有时，GIP的分子拮抗剂可以使用本领域已知的那些标准技术冻干。 然后可以利用（例如)合适的稀释剂(如生理盐水、无菌水、冰醋酸、醋酸钠，它们的组合和类 似物)将冻干的拮抗剂重构。
[0120] 剂量将取决于多种因素，包括药物的治疗指数、疾病类型、患者年龄、患者体重和 耐受性。通常选择的剂量为达到患者体内约〇. lμg/ml至1000μg/ml的血清浓度。对于具体患 者的剂量可以由有经验的临床医生通过使用鉴于上述因素的标准药理学方法来确定。对治 疗的反应可通过葡萄糖或胰岛素水平的血液或体液水平分析进行监测，或者通过在患者中 监测脂肪水平。有经验的临床医生将基于这些测量结果所揭示的对于治疗的响应效果从而 调整剂量。单独施用通常可足以产生治疗效果，但可以预期的可以进行多次施用，从而确保 在长时间内的持续响应。由于本文所公开的分子拮抗剂的蛋白样性质，所以据信，该在体内 拮抗剂将具有长的半衰期，所以组合物将仅需要一月施用一次或两次，或可能地一周一次。 分子拮抗剂的循环浓度应足以中在进食过程中以及进食后生成的GIP。
[0121] 可以使用含有本公开的GIP分子拮抗剂的药物组合物来治疗脂肪肝病或涉及脂肪 在组织中积聚的其他疾病。术语"治疗"用于指减缓疾病的进程、使疾病消退、和/或预防性 地用于减少疾病出现的可能性。这可以以几种不同的方式，诸如经由肝脏脂肪份数、网膜脂 肪份数或皮下脂肪份数来测定。
[0122] 对于肥胖者，据信，GIP分子拮抗剂会抑制GIP结合其肠上皮细胞内受体，通过抑制 GIP-诱导的钠/葡萄糖由细胞质向管腔膜的转运(SGLT1)，从而降低餐后葡萄糖吸收。GIP诱 导的来自胰腺辟田胞的胰岛素分泌也将衰减，降低了与升高的胰岛素响应相关的养分存储。 抑制GIP与其脂肪细胞中受体的结合应当也降低了 GIP诱导的葡萄糖摄取进入脂肪细胞，并 且阻止了 GIP抑制脂解的作用。总体来说，这将导致低效率的养分吸收和存储，促进体重减 轻。这些效果也有益于代谢综合征或高脂血症患者。
[0123] 对于患有II型糖尿病的患者，抑制GIP与其肠上皮细胞内受体结合将降低餐后葡 萄糖吸收并降低血糖。吃得过饱的患者也将受益于中和GIP所带来的体重降低的效果。
[0124] 对于患者易患或罹患脂肪肝病的患者，抑制GIP与其细胞内的受体结合将降低餐 后胰岛素分泌，从而降低在肝脏中由胰岛素诱导的脂肪积聚。
[0125] 对于罹患由食物诱导的库欣综合征患者，抑制GIP与其肾上腺细胞内的受体结合 将减少或防止食物摄入后的GIP诱导的皮质醇分泌增加。
[0126] 本发明将进一步在以下非限制性的三组工作实施例中进行说明，应当理解，这些 实施例仅用于解释本发明而不是用于限制在本文中所引用的材料、条件、工艺参数等。除非 另有说明，否则所有比例都是基于重量计算的。 实施例
[0127] 实施例1
[0128] 如上所述，使用杂交瘤产生并筛选单克隆抗体，以在悬浮液中鉴定对于抑胃肽 (GIP)具有高亲和性的单克隆抗体。由此鉴定出10gl0单克隆抗体。
[0129] 10gl0轻链可变域具有SEQ ID N0:16的氨基酸序列。轻链可变域的第一⑶R具有 SEQ ID N0:25的氨基酸序列。轻链可变域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:26的氨基酸序列。轻 链可变域的第三⑶R具有SEQ ID ^):22的氨基酸序列。编码1(^10轻链可变域的(^嫩具有 SEQ ID N0:35的核苷酸序列。
[0130] 10gl0重链可变域具有SEQ ID N0: 27的氨基酸序列。重链可变域的第一⑶R具有 SEQ ID N0:31的氨基酸序列。重可变域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:34的氨基酸序列。重链 可变域的第三⑶R具有SEQ ID N0:33的氨基酸序列。编码10gl0重链可变域的cDNA具有SEQ ID N0:39的核苷酸序列。
[0131] 为了进行比较，鉴定出对于GIP没有结合亲和性的14B9抗体。10gl0轻链可变域具 有SEQ ID N0:16的氨基酸序列。14B9轻链可变域的第一⑶R具有SEQ ID N0:7的氨基酸序 列。该轻链可变域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:26的氨基酸序列。该轻链可变域的第三⑶R 具有SEQIDN0:10的氨基酸序列。编码14B9轻链可变域的cDNA具有SEQIDN0:8的核苷酸 序列。
[0132] 14B9重链可变域具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列。该重链可变域的第一⑶R具有 SEQ ID N0:13的氨基酸序列。该重链可变域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:14的氨基酸序列。 该重链可变域的第三⑶R具有SEQ ID勵：15的氨基酸序列。编码1489重链可变域的(^嫩具 有SEQ ID N0:12的核苷酸序列。
[0133] 实施例2
[0134] 材料和方法
[0135] 30只九周龄的雄性C57BL/6小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。在研究的 第一天，每只小鼠的称重结果为19至25克之间。随后将小鼠随机分成三组，每组10只小鼠。
[0136] 所有小鼠在整个研究过程中自由获取食物和水。将小鼠全部安置在动物笼中，该 动物笼保持在22 ± 2 °C下，进行12小时光照/12小时黑暗循环。饲养在每个笼子中的小鼠五 只为一组，直到它们各自的体重达到25克。然后按照每笼两只到三只动物进行饲养。
[0137] 高脂肪饮食(HFD)(目录号TD.06414)和低脂肪等热量饮食（目录号TD.08806)购自 Harlan-Teklad(Indianapolis，IN)。以重量计，HFD由约23 · 5% 的蛋白质、27 · 3% 的碳水化 合物和34.3 %的脂肪组成。ΗΠ )提供的总热量18.4%来自蛋白质，21.3 %来自碳水化合物， 并且60.3%来自脂肪，且该总热量为5.1千卡/克。以重量计，等热量饮食由约18.6%的蛋白 质、62.6 %的碳水化合物和4.2 %的脂肪组成。等热量饮食提供的总热量20.5%来自蛋白 质，69.1 %来自碳水化合物，并且10.4 %来自脂肪，且该总热量为3.6千卡/克。
[0138] 一组10只小鼠（HFD-对照组)喂食HFD 17周并通过腹膜内（i.p.)每周注射5次施用 0. lmL磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
[0139] 第二组10只小鼠（HFD-mAb组）喂食HFD 17周并且每周施用在PBS中的lOglOGIP mAb五次。在星期一至星期四，通过通过腹膜内注射，从而施用包含在PBS中的0.2mg/mL mAb 的0 . lmL溶液。在每个星期五，通过腹膜内注射，从而施用包含在PBS中的0.4mg/mL mAb的 O.lmL溶液。这使得对于研究的每周来说，一周中有四天施用了 10mg/kg BW的GIP mAb，并且 有一天施用了20mg/kg BW的GIP mAb。在整个研究过程中持续使用该给药方案。
[0140]第三组10只小鼠（等热量饮食组)喂食等热量饮食17周。对该组不进行注射。
[0141] 在研究的持续过程中，每个星期一的晚上测量每个小鼠的重量并进行记录。另外， 在整个研究过程中，还测量了各组小鼠对于食物的消耗量并进行记录。
[0142] 结果
[0143] HFD-对照组的体重增加接近HFD-mAb组或等热量饮食组的体重增加率的2倍。
[0144] 在图1A中示出了总体重随时间变化的图。在图1B中示出了每周的重量增量百分 比。特殊饮食一周后，两个高脂肪食物(HFD)组(施用和没施用GIPmAb)获得了大约为其体重 10%的增重。两个HFD组的重量增量直到第4周前的重量增量基本保持相等，在第4周，HFD-mAb 的重量增量开始缓慢下降 ，而 HFD-对照组的重量稳定增加。在第 7 周，重量增量的差异变 得非常显著(P〈〇.001)。在整个研究周期中，等热量饮食组的小鼠体重以较慢的速率增加。 HFD-mAb组和等热量饮食组在17周之后具有几乎相同的重量增量。GIP mAb拮抗剂的使用对 于小鼠的重量增加具有显而易见的效果。
[0145] 基于图1B，看起来GIP mAb的影响不是即刻的，而是需要持续给药一段时间。在第1 至4周的实验中，两组喂食ΗΠ )的小鼠经历了几乎相同的重量增加。仅在第5周，相比于HFD-对照组而言，HFD-mAb组的重量增量开始以较慢的速率增加。
[0146] MRI
[0147] 材料和方法
[0148] 特殊饮食17周之后，将从ΗΠ )对照组随机选择六只小鼠以及从HFD-mAb组随机选择 的六只小鼠用于磁共振成像(MRI)。在凯斯西储大学(Case Western Reserve University) 的成像研究核心设施中成像之前，将所有小鼠麻醉。
[0149] 在Bruker Biospec 7T小动物MRI扫描仪（Bruker Biospin，Billerica，MA)上通过 弛豫增强(aRARE)序列快速采集二维T1-加权的非对称回波(TR=1087ms，TE = 9.1ms，F0V = lOOx 50mm，512x 256矩阵，4个平均，回波串长度=4,切片厚度= lmm)。该aRARE序列提供给 用户可选择的回声延迟，从而实现脂肪和水之间V6、5jt/6和3V2弧度的变化(在7T下，79、 396和714微秒的回波变化）。
[0150] aRARE采集获得的MR图像通过更改的7T a用IDEAL图像重构技术产生单独的脂肪 像和水像，并能够用于确定小鼠体内的脂质生物分布。在这方面，肥胖症、代谢综合征和 NAFLD不只是依赖于总体重，它们也取决于过量的脂肪储存的位置。
[0151] 结果
[0152] 图3示出了来自HFD-对照小鼠（左)和HFD-mAb小鼠（右）的代表性的磁共振图像。图 像描绘了小鼠的侧视图，其中小鼠的前部在图像的上部，小鼠的后部在图像的下部。白色或 明亮区域代表脂肪含量高的区域。相比于HFD-mAb小鼠，HFD-对照小鼠具有更多的脂肪。
[0153] 图4示出了由弛豫补偿脂肪份数(RCFF)MRI得到的肝脏脂肪份数。与HFD-mAb组的 小鼠相比，HFD-对照组肝脏内积聚了 2倍的脂肪量。
[0154] 图5示出了弛豫补偿脂肪份数(RCFF)MRI得到的网膜脂肪份数。与HFD-mAb组的小 鼠相比，HFD-对照组的动物积聚了几乎3.5倍多的网膜脂肪量。
[0155] 图6示出了弛豫补偿脂肪份数(RCFF)MRI得到的皮下脂肪份数。与HFD-mAb组的小 鼠相比，HFD-对照组积聚了大约2倍多的皮下脂肪量。
[0156] 图7示出了来自被处死小鼠肝脏的染色组织横截面的代表性照片。取出肝脏并固 定在福尔马林中。然后，将固定的组织切片，并用油红〇染色，脂溶性偶氮（lysochrome diazo)染料用于中性甘油三酯和脂质的染色。HFD-对照组肝脏在左侧，HFD-mAb组肝脏在右 侦L与HFD-mAb组肝脏相比，HFD-对照组的肝脏中具有更多红色染色(深色）的脂肪滴。此外， 在HFD-对照组肝脏中的脂肪滴尺寸大于HFD-mAb组肝脏的脂肪滴。这表明当施用GIP mAb 时，在肝脏中积聚的脂肪减少。这些结果与图4的肝脏脂肪份数量相一致。
[0157] 图8是在HFD-对照小鼠（左）中与HFD-mAb小鼠（右）中找到的网膜脂肪的两张（一 组)比较图片。脂肪是白色的，在HFD对照鼠中可见到更多的脂肪。
[0158] 综上所述，这些数据表明，结合GIP的单克隆抗体拮抗剂的施用显著降低了喂食高 脂肪饮食小鼠的体内储存的脂肪量。这包括储存在肝脏、网膜和皮肤下的脂肪。
[0159] 葡萄糖耐量试验
[0160] 材料和方法
[0161] 特殊饮食17周之后，从每个饮食组随机选择六只小鼠用于腹腔葡萄糖耐量试验 (IPGTT)。所有动物最初禁食6小时，之后从各小鼠的尾静脉采集约2yL的血液。在IPGTT曲线 上，这些第一样品表示基线血糖水平或时间为零。使用Truetest?血糖仪（NIPR0 Diagnostics，Fort Lauderdale，FL)测定血糖。
[0162 ]然后对各小鼠通过腹膜内注射施用约2毫克/千克体重的葡萄糖。葡萄糖以20 %的 水溶液被递送。施用后，在第10、30、60和120分钟从各小鼠的尾静脉采集约2yL的血液。测定 血糖浓度水平并进行记录。
[0163] 结果
[0164] 结果示于图2中。相比于HFD-mAb小鼠和等热量饮食小鼠，HFD-对照小鼠中的血清 葡萄糖水平升高至高得多的浓度。另外，在HFD-mAb小鼠和等热量饮食小鼠中的血清葡萄糖 水平更早开始下降。这与在HFD-对照小鼠中的葡萄糖耐量的进展相一致，但与HFD-mAb小鼠 或等热量饮食小鼠不同。
[0165] 血清测定
[0166] 材料和方法
[0167] 特殊饮食17周后，将三组小鼠处死。收集全血，制备血清，测定许多不同组分的水 平。
[0168] 结果
[0169] 图9示出了各组小鼠的血清中测得的甘油三酯（TG)水平。在HFD-对照组小鼠中的 TG水平是HFD-mAb小鼠中的TG水平的1.44倍。较高的TG水平与肥胖和代谢综合征相关。
[0170] 图10示出了各组小鼠的血清中测得的总胆固醇(TC)水平。HFD-对照组小鼠中的TC 水平是HFD-mAb小鼠中TC水平的1.55倍。较高的TC水平与肥胖和代谢综合征相关。
[0171] 图11示出了各组小鼠的血清中测得的高密度脂蛋白（HDL)占总胆固醇(TC)的平均 比例。在HFD-对照小鼠中HDL占总胆固醇的比例比HFD-mAb小鼠中HDL占总胆固醇的比例低 20% ADL占总胆固醇的比例低与肥胖和代谢综合征相关。
[0172] 图12出了在各组小鼠的血清中测得的平均低密度脂蛋白（HDL)水平。在HFD-对照 小鼠中LDL是HFD-mAb小鼠中LDL的1.95倍。较高的LDL( "坏"胆固醇)水平与肥胖和代谢综合 征相关。
[0173] 图13示出了在各组小鼠的血清中测得的平均胰岛素水平。在HFD-对照小鼠中的胰 岛素水平是HFD-mAb小鼠中胰岛素水平的2.6倍。较高的胰岛素水平与肥胖、胰岛素抵抗和 代谢综合征相关。
[0174] 图14示出了在各组小鼠的血清中测得的平均脂连蛋白水平。在HFD-对照小鼠中的 脂连蛋白水平是HFD-mAb小鼠中脂连蛋白水平的1.35倍。较高的脂连蛋白水平与总体内脂 肪增加有关。
[0175] 图15示出了在各组小鼠的血清中测得的平均瘦素水平。在HFD-对照小鼠中的瘦素 水平是HFD-mAb小鼠中瘦素水平的5.73倍。较高的瘦素水平与总体内脂肪增加有关。
[0176] 图16示出了在各组小鼠的血清中测得的胰高血糖素水平。各组之间的血清胰高血 糖素水平没有显著差异。
[0177] 图17示出了在各组小鼠的血清中测得的胰高血糖素样肽l(GLP-l)水平。各组之间 的血清GLP-1水平没有显著差异。
[0178] 综上所述，这些数据表明，结合GIP的单克隆抗体拮抗剂的施用显著改善了与肥胖 和代谢综合症相关的所有标志物。该数据表明，mAb的施用可以减少与肥胖和代谢综合症相 关的并发症。在血清胰高血糖素或GLP-1水平没有变化的事实表明，mAb是特异于GIP的，并 且表明对于胰高血糖素或GLP-1的抑制而言仅有很小副作用（如果有副作用的话），胰高血 糖素或GLP-1与GIP共享一些共同的生物途径，但是它们还具有不与GIP共有的一些其他生 物效果。
[0179] 讨论
[0180]这些实验的结果表明，腹膜内递送的结合GIP的单克隆抗体可以显著降低脂肪组 织积聚以及肝脏中的脂肪积聚。喂食高脂肪食物(HFD)，同时接受GIP mAb的小鼠明显比HFD 对照小鼠的脂肪含量少。脂肪含量的减少可见于在肝脏、网膜和皮下脂肪部分中。这表明， 适量的GIP mAb拮抗剂可通过抑制GIP减少或防止组织中的脂肪积聚。GIP的抑制降低肠的 葡萄糖摄取，降低肠肽的吸收，降低餐后胰岛素分泌，降低脂肪细胞的葡萄糖摄取，增加脂 肪分解，并抑制营养吸收。与肥胖和代谢综合症相关的标记物的血清水平的变化也表明GIP mAb拮抗剂能够用于抵抗这些病症获得健康结果。
[0181] 实施例3:抗体的修饰
[0182] 通过用在人抗体中保守的特定氨基酸置换在小鼠抗体中保守的特定氨基酸，从而 对lOglOmAb的轻链可变区进行进一步修饰。在这样做是为了使轻链可变区"人源化"，以使 其与更加相似于人的可变区，并增加了人免疫系统不将"人源化"单克隆抗体识别为异源物 质的概率。为了使轻链可变区人源化，化学合成了寡核苷酸。除了特定的碱基改变之外，该 寡核苷酸的序列类似于lOglOmAb轻链可变区的序列。据推测，可当序列被翻译成蛋白质时， 碱基对改变将改变轻链可变变区的特定氨基酸。使用DNA合成反应以产生双链(ds)DNA。合 成三种不同的双链寡核苷酸，然后用限制性核酸内切酶Hindm和Notl进行消化，之后连接 入哺乳动物表达载体中。哺乳动物表达载体包含信号序列和人轻链的恒定区。Ds-寡核苷酸 以这样的方式连入载体，当可变区和恒定区表达为mRNA并随后翻译成蛋白质时，将产生抗 体轻链。
[0183] 在此，三个所得的人源化轻链被称为LC1、LC2和LCSICI的氨基酸序列是SEQ ID N0:17，并且LCl的cDNA序列是SEQIDN0:36。LC2的氨基酸序列SEQIDN0 :18，并且LCl的 cDNA序列是SEQ ID如：37。1^：3的氨基酸序列是SEQ ID N0:19，并且LCl的cDNA序列是SEQ ID N0：38〇
[0184] 还可以同样的方式对lOglOmAb的重链可变区进行进一步修饰。再次推测，当序列 被翻译成蛋白质时，碱基对改变将改变重链可变变区的特定氨基酸。合成三种不同的ds-寡 核苷酸链，然后连入哺乳动物表达载体中。哺乳动物表达载体包含信号序列和人重链的恒 定区。Ds-寡核苷酸以这样的方式连入载体，当可变区和恒定区表达为mRNA并随后翻译成蛋 白质时，将产生抗体重链。
[0185] 在此，三个所得的人源化重链被称为HC1、HC2和HC3AC1的氨基酸序列是SEQ ID N0:28,并且HC1的cDNA序列是SEQ ID ^):40。此2的氨基酸序列SEQ ID N0:29,并且HC1的 cDNA序列是SEQ ID如:41。此3的氨基酸序列是SEQ ID N0:30,并且HC1的cDNA序列是SEQ ID N0：42〇
[0186] 在CH0细胞中产生含有人源化轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体(mAb)。利用 具有编码抗体重链的序列的哺乳动物载体共转染具有编码抗体轻链的序列的哺乳动物载 体。将共9个独特组合转染到CH0细胞中：LC1/HC1、LC1/HC2、LC1/HC3、LC2/HC1、LC2/HC2、 LC2/HC3、LC3/HC1、LC3/HC2和LC3/HC3。将从这些组合衍生的单克隆抗体与lOglOmAb进行了 比较。
[0187] 利用哺乳动物表达载体共转染的CH0细胞在培养基中生长，并收集上清液。通过直 接结合ELISA，从而对上清液中是否存在结合GIP的mAb进行评价。人GIP被固定到96孔板的 孔的底部。将上清液的一系列稀释液加入到96孔板的不同孔中。一小时的培育后，用PBS洗 涤孔两次，之后将与人IgG特异性结合的二级抗体加入到各孔中。用辣根过氧化物酶(HRP) 缀合特异性结合人I gG的抗体。培育1小时后，用PBS洗涤孔，之后加入HRP底物。如果在孔中 存在HRP，则底物被转化为有色化合物。使用分光光度计读取颜色强度的量。产生的颜色量 与各孔残留的HRP抗体缀合物的量成正比。产生的颜色的量也与各孔中结合hGIP的mAb的量 成正比。
[0188] 该评价的结果表明，轻链/重链载体的各种组合遵循以下顺序（由最高亲和性到最 低亲和性）结合人 GIP:LC2/HC1、LC2/HC2、LC3/HC2、LC1/HC2、LC2/HC3、LC3/HC1、LC1/HC1、 10gl0、LCl/HC3和LC3/HC3。
[0189] 使用蛋白A琼脂糖，对利用LC2/HC1、LC2/HC2和LC2/HC3的表达载体组合共转染的 100ml的CH0细胞的悬浮培养物中产生的抗体进行纯化。
[0190]接着，使用细胞培养系统对这三个纯化的mAb中和hGIP并防止配体-受体相互作 用，受体激活和受体依赖的信号转导能力进行测试。该系统中使用了报道细胞(LGIPR3a细 胞），其具有受环磷酸腺苷(cAMP)响应启动子控制的lacZ基因，并且在细胞表面上表达大鼠 GIPR。向这些细胞中添加 GIP导致GIPR的活化，诱导致使cAMP积聚的信号级联，诱导lacZ基 因并合成β半乳糖苷酶。在添加试样并培育4小时后，用比色测定法来测量细胞裂解物中β半 乳糖苷酶含量。色度的改变与β半乳糖苷酶的活性水平成正比。β半乳糖苷酶的活性水平取 决于试样中游离的具有生物活性的GIP的量。
[0191] 将mAb与DMEM培养基中的人GIP(hGIP)溶液混合，在该培养基中mAb的终浓度为 25g/ml，hGIP的终浓度为0.1 nM。然后将混合物加入到LGIPR3a细胞中并培育，之后洗涤用于 β半乳糖苷酶分析。结果示于图18中。10gl0代表原始小鼠 mAb AIP充当阳性对照。Fc表示纯 化的人Fc片段，其充当阴性对照。
[0192] 结果表明，人源化抗体在体外中和hGIP类似于10gl0小鼠人源化抗体 是三种人源化mAb中最有效的。它也比原始小鼠 mAb更有效。在此需要的是较低的相对活性， 而LC2/HC2具有0.0035的相对活性，而10gl0小鼠 mAb的相对活性为0.0055。
[0193] 也确定了六种人源化轻链(LC1、LC2、LC3)和重链(HC1、HC2、HC3)的可变区互补决 定区（CDRhLCl具有SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:22的031^1X2具有SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和SEQ ID N0:22的031^1X3具有SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:22的CDILHCUHC2和HC3具有相同的CDR，它们是SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0：33〇
[0194] 尽管具体的实施方案已被描述，然而对于
【申请人】或其他本领技术人员而言，可能 存在或目前无法预见上述实施方案的替代、修改、变化、改进和实质等效物。因此，提交的所 附的权利要求以及可能被修改的权利要求旨在涵盖所有这样的替代、修改、变化、改进和实 质等效物。
【主权项】
1. 一种治疗肥胖的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括轻链可变域和重链可变域； 其中所述轻链可变域具有第一⑶R，其与SEQ ID N0:20的氨基酸序列具有至少80%同 一性;第二⑶R，其与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少80%同一性；以及第三⑶R，其与 SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85%同一性;并且 其中所述重链可变域具有第一⑶R，其与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少80%同 一性;第二⑶R，其与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80%同一性；以及第三⑶R，其与 SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少80%同一性。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述轻链可变域的第一⑶R、第二⑶R和第三CDR通 过连接基团相互接合。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述连接基团独立地为氨基酸链。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重链可变域的所述第一 CDR、所述第二CDR和所 述第三⑶R通过连接基团相互接合。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述连接基团独立地为氨基酸链。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述分子拮抗剂是单链可变片段(scFv)、F(ab'）2片 段、Fab或Fab '片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体或单克隆抗体。7. 根据权利要求1所述的方法，所述分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变域的单 克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 18具有至少80%同一性，并且所述重链可变域与 选自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至少 80 %同一性。8. 根据权利要求1所述的方法，所述分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变域的完 整单克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性，并且所述重链可变 域与SEQ ID NO:29具有至少90%同一性。9. 一种治疗肥胖的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。10. -种治疗II型糖尿病的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。11. 一种治疗食物诱导的库欣综合征的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。12. -种治疗代谢综合征的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。13. -种减少肝脏中脂肪组织积聚的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。14. 一种减少网膜中脂肪组织积聚的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。15. -种减少皮下脂肪组织积聚的方法，包括： 向患者施用包含药学上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗剂的组合物， 其中所述分子拮抗剂包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。16. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括具有第一 CDR 和第二CDR的轻链可变域，各CDR与选自由 SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24构成的组中的氨基酸序列具有至少95%同一性。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述分子拮抗剂的第一 CDR和第二CDR通过连接 基团相互接合。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述连接基团是氨基酸链。19. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括轻链可变域， 该轻链可变域具有与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID N0:21的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:22的氨基酸序列具 有至少85 %同一性的第三⑶R。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述分子拮抗剂的所述第一 CDR、所述第二CDR和 所述第三⑶R通过连接基团相互接合。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述连接基团独立地为氨基酸链。22. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括轻链可变域， 该轻链可变域与选自由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19构成 的组中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。23. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括重链可变域， 该重链可变域具有与SEQ ID NO: 31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具 有至少80 %同一性的第三⑶R。24. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括重链可变域， 该重链可变域与选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30构成 的组中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。25. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括轻链可变域和 重链可变域； 其中所述轻链可变域包括第一⑶R和第二⑶R，各⑶R与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24构成的组中的氨基酸序列具有至少 95 %同一性;并且 其中所述重链可变域包括与SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一 ⑶R、与SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨 基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。26. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂包括轻链可变域和 重链可变域； 其中所述轻链可变域与选自由SEQIDN0:16、SEQIDN0:17、SEQIDN0 :18和SEQID NO: 19构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性;并且 其中所述重链可变域与选自由SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0 :29和SEQID NO: 30构成的组中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。27. 根据权利要求25至26中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂是单链可变片段 (scFv)、F(ab '）2片段、Fab或Fab '片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体或单克隆抗体。28. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂是具有轻链可变域 和重链可变域的单克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 18具有至少80%同一性，并且 所述重链可变域与选自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基 酸序列具有至少80 %同一性。29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述分子拮抗剂是具有轻链可变域和重链可变 域的完整单克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性，并且所述重 链可变域与SEQ ID NO:29具有至少90%同一性。30. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂会结合GIP的氨基 酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQIDN0 :1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4构 成的组中。31. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂是包括人恒定区的 单克隆抗体。32. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂的分子量为约 30kDa 至约 500kDa。33. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述分子拮抗剂具有对GIP的结合 亲和力，特征在于IC5Q为约0· InM至约7nM。34. 根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述组合物是静脉内、腹膜内或皮 下施用的。35. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含选自缓冲剂、表 面活性剂、防腐剂、填充剂、聚合物和稳定剂组成的组中的药物赋形剂。36. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物是粉末、注射剂、溶液、 悬浮液或乳液的形式。37. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物包含的单克隆抗体拮抗 剂的量为每升所述组合物约〇. lmg至约lOOOmg。38. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物是冻干的。39. -种抑胃多肽(GIP)的分子拮抗剂，包括至少一个互补决定区（CDR)，该互补决定区 与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性。40. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括具有第一 CDR和第二CDR的轻链可变域，各 CDR与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24 构成的组中的氨基酸序列具有至少95 %同一性。41. 根据权利要求40所述的分子拮抗剂，其中所述第一 CDR和所述第二CDR通过连接基 团相互接合。42. 根据权利要求41所述的分子拮抗剂，其中所述连接基团是氨基酸链。43. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括轻链可变域，该轻链可变域具有与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至 少80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:22的氨基酸序列具有至少85%同一性的第三⑶R。44. 根据权利要求43所述的分子拮抗剂，其中所述第一 CDR、所述第二CDR和所述第三 ⑶R通过连接基团相互接合。45. 根据权利要求44所述的分子拮抗剂，其中所述连接基团独立地为氨基酸链。46. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括轻链可变域，该轻链可变域与选自由SEQ IDN0:16、SEQIDN0 :17、SEQIDN0:18和SEQIDN0:19构成的组中的氨基酸序列具有至 少80 %同一'性。47. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括重链可变域，该重链可变域具有与SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、与SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至 少80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。48. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括重链可变域，该重链可变域与选自由SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具有至 少80 %同一'性。49. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括轻链可变域和重链可变域； 其中所述轻链可变域包括第一⑶R和第二⑶R，各⑶R与选自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24构成的组中的氨基酸序列具有至少 95 %同一性;并且 其中所述重链可变域包括与SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一 ⑶R、与SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和与SEQ ID N0:33的氨 基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。50. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，包括轻链可变域和重链可变域； 其中所述轻链可变域与选自由SEQIDN0:16、SEQIDN0:17、SEQIDN0 :18和SEQID NO: 19构成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性;并且 其中所述重链可变域与选自由SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0 :29和SEQID NO: 30构成的组中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。51. 根据权利要求49至50中任一项所述的分子拮抗剂，其中所述轻链可变域和重链可 变域是单链可变片段(80?￥)、？(&13'）2片段、？313或?313'片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体 或单克隆抗体的一部分。52. 根据权利要求39所述的分子拮抗剂，其中所述拮抗剂是具有轻链可变域和重链可 变域的单克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 18具有至少80%同一性，并且所述重链 可变域与选自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30构成的组中的氨基酸序列具 有至少80 %同一性。53. 根据权利要求52所述的分子拮抗剂，其中所述拮抗剂是具有轻链可变域和重链可 变域的完整单克隆抗体，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性，并且所述 重链可变域与SEQ ID NO:29具有至少90%同一性。54. 根据权利要求39至53中任一项所述的分子拮抗剂，其中所述分子拮抗剂结合GIP的 氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID NO :4构成的组中。55. 根据权利要求39至53中任一项所述的分子拮抗剂，其中所述拮抗剂是包括人恒定 区的完整单克隆抗体。56. 根据权利要求39至53中任一项所述的分子拮抗剂，其中所述拮抗剂的分子量为约 30kDa 至约 500kDa。57. 根据权利要求39至53中任一项所述的分子拮抗剂，其中所述拮抗剂具有对GIP的结 合亲和力，特征在于IC5Q为约0· InM至约7nM。58· -种互补DNA序列，其与选自由SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:41 和SEQ ID N0:42构成的组中的DNA 序列具有至少85 %同一性。
【文档编号】A61P3/10GK106068125SQ201480075779
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2014年12月17日 公开号201480075779.1, CN 106068125 A, CN 106068125A, CN 201480075779, CN-A-106068125, CN106068125 A, CN106068125A, CN201480075779, CN201480075779.1, PCT/2014/70901, PCT/US/14/070901, PCT/US/14/70901, PCT/US/2014/070901, PCT/US/2014/70901, PCT/US14/070901, PCT/US14/70901, PCT/US14070901, PCT/US1470901, PCT/US2014/070901, PCT/US2014/70901, PCT/US2014070901, PCT/US201470901
【发明人】M·迈克尔·沃尔芬, 迈克尔·O·博伊兰
【申请人】Mhs克尔创新有限责任公司