专利名称：聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备及应用方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种具有缓释功能的 聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备及应用方法。
背景技术：
磁性纳米粒子由于具有超顺磁特性与良好的生物兼容性，在医学领域具有广 泛的应用前景。如作为核磁共振造影剂，GMR生物传感器，基因与药物的递送 载体，在外加磁场下热疗等。但是，大量研究发现，磁性纳米粒子穿越细胞膜效 率不高，而且易团聚，不易分散，如何在特定靶细胞或器官部位聚集，是一个挑 战性的难题。
树形分子是一种新型的树枝形聚合物，是一种单分散性的高分子材料，具有 球状立体结构，而且结构参数如尺寸、外形、表面化学都可以在合成的过程中获 得完全控制，制备方法简便，成本低。因此它常常被设计为基因载体。树形分子 表面经过修饰后可以递送大量的生物分子、配合基、抗体、治疗药物等进入细胞， 从而使树形分子成为基因治疗领域中性能优越的非病毒递送载体。如果把磁性纳 米粒子与树形分子结合起来，就具有双方面优势，拓展了应用范围。
经对现有技术的文献检索发现，Cancer Research (癌症研究)2007年67巻17 期第8156-63页上发表的Dendrimer-modified magnetic nanoparticles enhance efficiency of gene delivery system (树形分子修饰的磁性纳米粒子增强基因递送系 统的效率)，在Biotechnology Progress (生物技术的进展)2006年22巻第11期 1084-1089页上发表的"Expression of single-chain Fv gene specific for y-seminoprotein by RTS and its biological activity identification"(禾ll用快速番羽译系 统制备抗Y-精浆蛋白单链抗体与抗体生物活性鉴定)文章外，未见其它相关报道。 我们在此文章中，描述了不同代数树形分子修饰磁性纳米粒子技术过程，并证明 了树形分子修饰的磁性纳米粒子具有增强反义核酸进入肿瘤细胞的功能。但是， 树形分子修饰的磁性纳米粒子缓释随带基因或药物的功能，仍有效率限制难题， 通过与聚乳酸连接修饰后，缓释功能能够被显著增强。本发明是在上述技术基础上，制备出可控缓释的聚乳酸桥联树形分子包被的磁性纳米粒子。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，利用聚乳酸，聚酰胺胺树形分子与磁性纳米粒 子的各自优势，把三者结合起来，提供一种聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的 制备及应用方法。本发明是通过在磁性纳米粒子表面可控生长出第1代至第10 代聚酰胺胺树形分子，然后与聚乳酸连接，最后利用这些不同代数聚乳酸树形分 子包被的磁性纳米粒子，作为基因或药物的缓释递送系统，与各种肿瘤细胞培养， 筛选出高效率穿越肿瘤细胞膜，并能在细胞内高效率缓释所随带的基因或药物的 第5代聚乳酸树形分子包被的磁性纳米粒子。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明所涉及的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步
骤
第一步，采用常规共沉淀法制备磁性纳米粒子F,与F^+离子按照1: 2
比例混合，然后在氮气保护下，加入到4M氢氧化纳溶液中，在80。C反应60分 钟，获得的磁性纳米粒子，用水和乙醇反复清洗3次-5次后，备用。
第二步，氨基硅烷修饰磁性纳米粒子50ml5。/。磁性纳米粒子与150ml乙醇 混合，加入10mlNH2(CH2)Si(OCH3)3(APTS)溶液，在60°C搅动反应7小时。产 物用乙醇反复洗3-5次，然后用磁铁分离出产物，在室温抽真空干燥成粉末，这 就是氨基硅垸修饰磁性纳米粒子。
第三步，0.5代聚酰胺胺树形分子在磁性纳米粒子表面生长0.5g氨基硅垸 修饰的磁性纳米粒子，溶于50ml甲醇，然后加入到带有磁力搅拌子、回流冷凝 管和温度计的三口烧瓶中。然后加入20ml丙烯酸甲酯溶液，超声，在25。C搅 动反应7小时。然后加入4ml乙二胺，在超声并50°C搅动反应5小时。然后减 压蒸馏除去溶剂和单体，获得G0.5代聚酰胺胺树形分子修饰的磁性纳米粒子。 采用液相色谱分析产品的纯度，分析天平称重，可得产率达95%。
第四步，第1至10代树形分子在磁性粒子表面生长
将G0.5代树形分子修饰的磁性纳米粒子溶解于无水甲醇中，逐滴加入到10 倍体积的乙二胺甲醇溶液中，滴加速率为1滴/秒，不断搅拌，滴完后继续搅拌 48小时，减压蒸馏除去甲醇和过量的乙二胺，得到粘稠液体，获得G1.0代聚酰 胺胺树形分子。采用液相色谱分析产品的纯度，分析天平称重，得产率95%。第五步，聚乳酸与磁性粒子表面的树形分子联接 将得到的树形分子修饰的磁性纳米粒子，溶解于氯仿中，按照2: l比例加入 聚乳酸，不断搅拌，反应24小时，减压蒸馏除去氯仿，得到粘稠液体，获得聚 乳酸连接的聚酰胺胺树形分子包被的磁性纳米粒子。
重复上述反应过程，可以获得更第2代至第10代数的聚乳酸树形分子修饰 的磁性纳米粒子，采用液相色谱分析产品的纯度，分析天平称重，室温25。C保 存备用。
本发明所涉及的聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子的应用方法，包括以下 两种
第一种，第1代至第10代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸 或小干扰核糖核酸连接
第1至第10代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子所具备氨基基团数量能
够计算出，也可用Zeta电位仪测量出所随带的表面电荷，按照电荷比10:1加入 反义核酸或干扰小RNA，在室温反应30分钟，通过静电吸引作用，核酸可与树 形分子结合在一起，采用磁铁可分离出树形分子修饰的磁性纳米粒子-反义核酸， 以及树形分子修饰的磁性纳米粒子-小干扰核糖核酸纳米复合物，4°C保存备用。
第二种，聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸或小干扰核糖核酸 纳米复合物与肿瘤细胞共培养
第1代至第IO代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸或小干扰 核糖核酸的纳米复合物，分别加入到培养的肿瘤细胞如乳腺癌细胞株MCF-7与 MDA-MB-435细胞，以及白血病HL-60细胞中，共培养。采用共聚焦显微镜与 高分辨电镜证实第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子在15分钟内进入肿 瘤细胞，并能释放出反义核酸或小干扰核糖核酸，抑制肿瘤细胞的生长。其它代 数树形分子修饰的磁性纳米粒子由于代数低随带基因量少，代数太高，由于粘性 太强与体积太大，导致进入细胞的效率太低或随带基因太少，综合比较，第5代 树形分子修饰的磁性纳米粒子，既具有最佳的跨膜效率，又具有最佳的随带基因 量，是最佳的基因或药物递送载体。
按照本发明方法，树形分子同样可以在其它粒子表面生长，如金纳米粒子， 碳纳米管，银纳米粒子等。制备的聚乳酸树形分子修饰的纳米粒子，在水中及生 理条件下溶解性能好，表面拥有大量表面基团，可以与各种生物分子偶联，如反
6义核酸，抗体药物，蛋白质药物，治疗基因片段等，并随带它们快速进入肿瘤细 胞。
按照本发明方法，制备的聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子，既具有树形 分子优势，又具有磁性纳米粒子的优势，又具有聚乳酸缓释特性，如利用聚乳酸 树形分子能结合反义核酸、各种抗体、小干扰核糖核酸、蛋白质药物如干扰素、 转移因子，形成聚乳酸树形分子吸附的核酸、蛋白质等纳米复合物；利用磁性纳 米粒子的磁性能，在外加磁场条件下，可快速分离出聚乳酸树形分子包裹的磁性 纳米粒子；又可利用在外加强磁场条件下，磁性纳米粒子可产生热效应，可用于 增强聚乳酸树形分子随带药物的治疗效果。磁性粒子已经被用作核磁性共振造影 剂，树形分子修饰的磁性纳米粒子，水溶性更好，可随带抗体、核酸等到体内特 殊部位，因此具有比单纯磁性粒子造影剂更有优势。另外，我们也发现第5代树 形分子修饰的磁性纳米粒子，具有高效率穿越肿瘤细胞膜特性，利用此特点，可 随带更多的反义核酸、抗体或蛋白药物，进入肿瘤细胞内部，并缓慢释放，可增 强核磁性共振显像效果。因此，更具有应用前景。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。
实施例1
0.2g表面富含羟基的四氧化三铁磁性纳米粒子，在水中加入3ml的3-胺基-三乙氧基硅垸，70。C反应进行24小时，反应结束后，磁分离洗涤除去过量的3-胺基-三乙氧基硅垸，获得胺基表面的四氧化三铁磁性粒子。把产物分散于20ml 水中，加入0.2g酯端基PAMAM树形分子，50°C超声处理30min，通过磁分离 用水洗涤3次，获得第0.5代树形分子修饰的磁性纳米粒子，表面拥有大量的酯 基基团。将G0.5代树形分子修饰的磁性纳米粒子溶解于无水甲醇中，逐滴加入 到10倍体积的乙二胺甲醇溶液中，滴加速率为l滴/秒，不断搅拌，滴完后继续 搅拌48小时，减压蒸馏除去甲醇和过量的乙二胺，得到粘稠液体，获得G1.0代 聚酰胺胺树形分子。将得到的树形分子修饰的磁性纳米粒子，溶解于氯仿中，按 照2: 1比例加入聚乳酸，不断搅拌，反应24小时，减压蒸馏除去氯仿，得到粘 稠液体，获得聚乳酸连接的聚酰胺胺树形分子包被的磁性纳米粒子。采用液相色谱分析产品的纯度，分析天平称重，得产率95%。重复上述反应 过程，获得第1代至第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子，采用液相色谱 分析产品的纯度，分析天平称重，产率达90%，室温保存备用。
第1至第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子(dMNP)所具备的NH2+ 基团数量能够计算出，也可用Zeta电位仪测量出所随带的表面电荷。然后与随 带的anti-survivin反义核酸混合，混合按照电荷比10:l(dMNP/asODN )进行，在 室温反应30分钟，通过静电吸引作用，核酸可与树形分子结合在一起，采用磁 铁吸附法，可获取相应的聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸复合物 (dMNP陽anti-survivin-composites)。
然后，把这些纳米复合物按照剂量递增方法，加入到培养的肿瘤细胞如 MCF-7， MDA-MB-435， HL-60, LNCaP细胞中，共同培养1至4天，就会发现 随着剂量的逐渐增强，细胞生长抑制率也逐渐增加。纳米粒子进入细胞的量也能 被计算:uptake mte(%) = [l-(Itest/ Ic。ntrol)] x 100， Ic。rtrol是含有d固P-FITC-asODN 同样量的细胞培养基的荧光强度；Itest是dMNP-FITC-asODN与细胞培养后上清 中的荧光强度。测量结果表明，其中第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子 具有最佳的跨膜效率与基因递送效率，随带的基因或药物，能够在肿瘤细胞内释 放出来，发挥治疗作用。
实施例2:
取0.2g实施例1中制备的第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子，分 散于20ml水中，加入2.0ml的乙二胺，50°C超声处理30min，然后通过磁分离 用水洗涤3次，去除过量的乙二胺单体。获得胺基表面的树形分子修饰的磁性纳 米粒子，产率为95%。
实施例3:
取0.2g实施例1中的第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子，分散在 20ml水中，在碱性条件下(pH=9.0)，加热至10(TC回流2小时，进行水解反应。 反应完毕后，通过磁分离用水洗涤3次，获得羧基表面的磁性纳米粒子与树形分 子形成的复合材料，表面含有大量的羧基(-COOH)。可以与肽分子表面的NH+3 基团反应，形成CO-NH2肽键连接，产率达95%。然后与肿瘤细胞共培养，可以 用电镜或共聚焦显微镜证实聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子随带肽分子进 入肿瘤细胞。实施例4:
实施例3的产物(羧基修饰的磁性纳米粒子/树形分子复合材料)与生物分 子偶联的方法为碳化二亚胺縮合法在中性条件下，利用水溶性的EDC或油溶 性的DCC，使羧基与生物分子的氨基縮合生成酰胺键，从而实现偶联。为了提 高偶联效率，还可先利用琥珀酰亚胺对羧基进行活化，然后再通过EDC等縮合， 进而与生物分子偶联，最终产率可达90%。
实施例5:
实施例2中的产物(氨基表面的磁性粒子/树形分子复合材料)与生物分子
偶联的方法一般分为两种一种是先利用高碘酸钠将生物分子中的羟基或抗体中
的糖基氧化成醛，然后在弱碱性的条件下，与磁性纳米粒子表面的氨基反应生成
希夫碱，从而实现偶联的目的；另一种是卤化氰活化法，即在碱性条件下，卣化 氰与磁性纳米复合物的氨基反应，生成氰化胺的中间产物(R-NHCN),这种中 间产物能与生物分子中的氨基反应，生成胍基的衍生物(R-NH-CN-NH-Ab)。我 们把抗乙肝病毒抗体与之连接，最终产物率在90%，抗体生物活性被保持。此产 物可进一步作为免疫检测中捕获探针。 实施例6:
实施例1中的产物(酯端基磁性粒子/树形分子复合物)，分别在独立的容器 中与H2NCH2CH2NH2、NaBr、 H2NC(CH2OH)3、 N(CH2CH2NH2)3、 H2NCH2CH2OH、 H2N(CH2)2NH(CH2)2OH进行反应，分别获得表面功能基团为NH2、 Br、 CONHC-(CH2OH)3 、CONH(CH2)2-N((CH2)2NH2)2 、OH 、 CONH(CH2)2NH(CH2)2OH 。
实施例7:
实施例6中的产物(羟基修饰的磁性粒子/树形分子复合物)与生物分子的
偶联反应分为两类 一类即实施例5中所提到的高碘酸钠氧化法，即利用高碘酸 钠将磁性纳米复合物表面的羟基氧化成醛基，再与抗体中的氨基反应生成希夫 碱，最后用硼氢化钠还原稳定；另一类是卤化氰活化法，即在碱性条件下，卤化 氰与羟基反应生成异脲中间体，该中间体再与生物分子偶联。
权利要求
1、 一种聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤-第一步，采用共沉淀法制备磁性纳米粒子；第二步，氨基硅烷修饰磁性纳米粒子磁性纳米粒子与乙醇混合，加入 NH2(CH2)Si(OCH3)3(APTS)溶液，搅动反应，产物用乙醇反复洗，然后用磁铁分 离出产物，干燥成粉末，得到氨基硅烷修饰磁性纳米粒子；第三步，0.5代聚酰胺胺树形分子在磁性纳米粒子表面生长将氨基硅烷修 饰的磁性纳米粒子，溶于甲醇，加入到三口烧瓶中，然后加入丙烯酸甲酯溶液， 超声，搅动反应，再加入乙二胺，超声搅动反应，然后减压蒸熘除去溶剂和单体， 获得G0.5代聚酰胺胺树形分子修饰的磁性纳米粒子；第四步，第1至10代树形分子在磁性粒子表面生长将G0.5代树形分子修饰的磁性纳米粒子溶解于无水甲醇中，逐滴加入到乙二胺甲醇溶液中，不断搅拌，滴完后继续搅拌，减压蒸馏除去甲醇和过量的乙二胺，得到粘稠液体，获得Gl.O 代聚酰胺胺树形分子；重复上述反应过程，获得更第2代至第10代数的树形分 子修饰的磁性纳米粒子；第五步，聚乳酸与第1至10代树形分子修饰的磁性纳米粒子联接将得到 的树形分子修饰的磁性纳米粒子，溶解于氯仿中，按照2: 1比例加入聚乳酸， 不断搅拌，反应，减压蒸馏除去氯仿，得到粘稠液体，获得聚乳酸连接的聚酰胺 胺树形分子包被的磁性纳米粒子。
2、 根据权利要求1所述的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备方法， 其特征是，所述采用共沉淀法制备磁性纳米粒子，具体为F^+与F^+离子按照 1: 2比例混合，然后在氮气保护下，加入到4M氢氧化纳溶液中，在80。C反应 60分钟，获得的磁性纳米粒子，用水和乙醇反复清洗3次-5次后，备用。
3、 根据权利要求1所述的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备方法， 其特征是，所述氨基硅烷修饰磁性纳米粒子，具体参数为50ml5。/。磁性纳米粒 子与150ml乙醇混合，加入10mlNH2(CH2)Si(OCH3)3(APTS)溶液，在60°C搅动 反应7小时，产物用乙醇反复洗3-5次，然后用磁铁分离出产物，在室温抽真空 干燥成粉末，得到氨基硅垸修饰磁性纳米粒子。
4、 根据权利要求1所述的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子，其特征是， 所述0.5代聚酰胺胺树形分子在磁性纳米粒子表面生长，具体参数为0.5g氨基 硅垸修饰的磁性纳米粒子，溶于50ml甲醇，然后加入到带有磁力搅拌子、回流 冷凝管和温度计的三口烧瓶中，然后加入20ml丙烯酸甲酯溶液，超声，在25。C 搅动反应7小时，然后加入4ml乙二胺，在超声并50°C搅动反应5小时。
5、 根据权利要求1所述的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子，其特征是， 所述第1至10代树形分子在磁性粒子表面生长，具体参数为将G0.5代树形分 子修饰的磁性纳米粒子溶解于无水甲醇中，逐滴加入到IO倍体积的乙二胺甲醇 溶液中，滴加速率为l滴/秒，不断搅拌，滴完后继续搅拌48小时。
6、 根据权利要求1所述的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子，其特征是， 所述聚乳酸与第1至10代树形分子修饰的磁性纳米粒子联接，其中反应时间为 24小时。
7、 一种应用聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的方法，其特征在于，将第 1代至第10代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸或小干扰核糖核 酸连接，具体为计算出第1至第IO代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子所 具备的NH2+基团数量，或用Zeta电位仪测量出所随带的表面电荷，按照电荷比 10:1加入反义核酸或小干扰核糖核酸，在室温反应，通过静电吸引作用，核酸与 树形分子结合在一起，采用磁铁分离出树形分子修饰的磁性纳米粒子-反义核酸 纳米复合物，或树形分子修饰的磁性纳米粒子-小干扰核糖核酸纳米复合物，4°C 保存备用。
8、 根据权利要求7所述的应用聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的方法， 其特征是，所述在室温反应，其时间为30分钟。
9、 一种应用聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的方法，其特征在于，将树 形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸或小干扰核糖核酸纳米复合物与肿瘤细 胞共培养，具体为第1代至第10代树形分子修饰的磁性纳米粒子与反义核酸 或siRNA的纳米复合物，分别加入到培养的肿瘤细胞中，共培养。
10、 根据权利要求9所述的应用聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的方法， 其特征是，所述第5代聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子在15分钟内进入肿 瘤细胞，并能释放出反义核酸或小干扰核糖核酸，抑制肿瘤细胞的生长。
全文摘要
一种生物工程技术领域的聚乳酸树形分子修饰磁性纳米粒子的制备及应用方法。制备方法为采用共沉淀法制备磁性纳米粒子；氨基硅烷修饰磁性纳米粒子；0.5代聚酰胺胺树形分子在磁性纳米粒子表面生长；第1至10代树形分子在磁性粒子表面生长；将得到的树形分子修饰的磁性纳米粒子，溶解于氯仿中，按照2∶1比例加入聚乳酸，不断搅拌，反应，减压蒸馏除去氯仿，得到粘稠液体，获得聚乳酸连接的聚酰胺胺树形分子包被的磁性纳米粒子。本发明制备的聚乳酸树形分子修饰的磁性纳米粒子，既具有树形分子优势，又具有磁性纳米粒子的优势，又具有聚乳酸缓释特性，在基因或药物递送方面具有应用价值。
文档编号H01F1/00GK101310850SQ20081003398
公开日2008年11月26日 申请日期2008年2月28日 优先权日2008年2月28日
发明者崔大祥, 潘碧峰, 蓉 贺, 峰 高 申请人:上海交通大学