专利名称：人体外周血淋巴细胞培养基及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人体外周血淋巴细胞培养基及其应用。
背景技术：
人体外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在GI期(G0期)， 一般情况下是不再分裂的， 在培养液中加入植物凝血素PHA时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入 有丝分裂，这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得部分有丝分裂细 胞。这种方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒性学等方面广泛应用。研究证实， 许多因素与细胞培养产生密切相关，常见的原因有-
(1) 无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体 外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力， 一旦被污染或自身代谢 物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及 时清除等，是维持细胞生存的基本条件；
(2) 恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的 标准温度为36.5°C±0.5°C，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39'C时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-4CTC1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-4rCl小时，细 胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42°C1小时，细胞受到严重损伤，大部分细 胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43'C以上1小时，细胞全部死亡；
(3) 气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧 化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种 成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中；
(4) 恒定的PH值二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在 细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这 一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利 于细胞生长。细胞培养液pH浓度的调节最常用的为加NaHC03的方法，因为NaHC03可供C02， 但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止pH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优 点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值；
细胞培养基是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细 胞生长和繁殖的生存环境。
培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分 为合成培养基和天然培养基。
(1) 合成培养基如1640等合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格 配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因 子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
(2) 天然培养基使用最普遍的天然培养基是血清，基本以牛血清最普遍。由于血 清含有多种细胞因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞增殖生 长。常见使用量为5-20%。 .
将合成培养基能使细胞生存的特性和天然培养基能使细胞增殖生长的特性相结合，使 两种培养基的特性都能获得发挥。但现有的这种天然培养基与合成培养基配合使用的培养 基配方虽然能使部分细胞生存，但不能达到使淋巴细胞较好的生长增值并进行有丝分裂表 达，缺乏各组份间的合理有效配比，而天然培养基属于动物血清且存在多种干扰培养淋巴 细胞生长的不利因子,因此并不能直接有效模拟人体血液中环境，试剂的稳定性也不好。
发明内容
本发明的目的是提供一种人体外周血淋巴细胞培养基及其应用。本发明提供的细胞培 养基淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性好，可为染色体核型分析临床诊 断提供强有力的依据。
本发明的细胞培养基，是将合成培养基能使细胞生存的特性和天然培养基能使细胞顺 利增殖生长的特性相结合，使两种培养基的特性都能获得最大的发挥和最优化的组合。 本发明的人体外周血淋巴细胞培养基含下列原料成分及重量百分比
RPMI1640液体培养基 77-81.9% 牛血清 10-14.9%
PHA(植物凝血素)4-6% 非硫酸化糖胺聚糖 2-5%
4CPPs (酪蛋白磷酸肽) 2-5%
双抗(青霉素和链霉素) 0. 05-0. 1%。
本发明的人体外周血淋巴细胞培养基pH值为7.2±0.2。
上述非硫酸化糖胺聚糖选自HA(透明质酸Haluronic ac:id)。
上述培养基的制备方法为1.在无菌条件下将合成的RPMI1640干粉在电子天平上秤取 后置消毒容器内，添加重蒸水稀释后搅拌混匀获得RPMI1640液体培养基；2.采用 Pasteurization (巴氏消毒法)将牛血清溶解后低温处理；3.将PHA加入培养基中；4.将HA加 入培养基；5.将CPPs加入培养基;6.加入双抗充分混匀后置负压过滤灭菌.7.采用pH测量仪 测定pH值。
培养基配制完成后，需封口冷藏(-2(TC)备用。
本发明的人体外周血淋巴细胞培养基可用于哺乳动物外周血淋巴细胞的培养。 本发明配置生产的外周血淋巴细胞培养基能更加直接有效的模拟人体血液环境中淋巴 细胞生长的特点，填补了原有培养基所缺乏的有效成份，即在原有的基础上增加了细胞基质 中一种非硫酸化糖胺聚糖，将双糖单位N —乙酰葡萄糖胺和葡醛酸重复连接构成多糖,可有 效地增加细胞在体外培养液中卑解质扩散及运转，进一步增加细胞通透性，减少有关蛋白 质的丢失，改善营养代谢；有效稳定pH值；从而使细胞能达到有效生长并增加表达率。同 时还适量增加了CPPs，该物质是一类含有磷酸丝氨酰和谷氨酰族的短肽，将抵抗各种酶的 水解，有效防止钙离子在中性或偏硷性环境中形成磷酸钙沉淀，从而通过丝裂原最佳浓度的 选择,达到增加细胞培养后的分裂增值能力和更多的有丝分裂细胞。
本发明的外周血淋巴细胞培养基淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性 好，与常规培养基相比具有细胞生长旺盛，并有较高淋巴细胞转换率和有效的淋巴细胞分 裂指数，即》60%淋巴细胞转换率、淋巴细胞分裂指数》6%、配制后经一段时间，pH值仍 能稳定在7.2±0.2，具有增强缓冲效果更适用于开放式和封闭式的培养条件的优势。
具体实施例方式
以下列举具体实施例以进一步说明本发明，应理解实施例并非用于限制本发明的保护 范围。
实施例1 培养基的配制培养基按下表配方配制。
培养基的配制方法为1.在无菌条件下将合成的RPMI1640干粉在电子天平上秤取后置 消毒容器内，添加重蒸水稀释后搅拌混匀；2.采用Pasteurization(巴氏消毒法)将牛血清溶 解后低温处理；3.将PHA加入培养基中；4.将HA加入培养基；5.将CPPs加入培养基；6.加入 双抗充分混匀后置负压过滤灭菌.7.采用pH测量仪测定pH值。
1#2#3#4#5#6#
RPMI164077.0%77.0%80. 0%81.9%78%77.9%
小牛血清14.9%10.03%10. 95%10.0%10,0%10.0%
PHA4.0%6.0%5. 0%4.0%4.0%4.0%
HA2.0%3.0%2. 0%2.0%2.92%5%
CPPs2.0%3.9%2. 0%2.0%5%3%
青霉素0,07%0.04%0. 03%0.05%0.02%0.01%
链霉素0.03%0.03%0. 02%0.05%0.06%0.09%
配置完成4 小时之内PH 值的波动范 围7.2 ±0.27.2 ±0.27.2 士 0.27.2 士 0.27.2 ±0.27.2 ±0.2
培养基配制完成后，负压过滤方式灭菌，分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封 口冷藏(-20'C)备用。
实施例2细胞培养基淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数比较 采用实施例1制备的培养基。
对比培养基配方RPMI 1640或199 84.9 %,小牛血清10%， PHA 3%，肝素 2%， 双抗 0. 1%。
培养方法
6采血、接种和培养用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下 抽取患者外周血0.5-lml，每瓶培养基加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接 触；置36'C培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻摇1次，以促进细胞生长增殖；
细胞培养收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置 培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。从培养箱中取出培养瓶终止培养，摇匀后移 至10ml尖底离心管中，尽量收集培养细胞。2000rpm8分钟。
淋巴细胞转换率的检测与计算方法淋转率=转化淋巴细胞数/1000*100%。即每1000 个细胞中转化淋巴细胞的百分数。
淋巴细胞分裂指数检测与计算方法分裂指数=分裂细胞数/ (1000-分裂细胞数) *100%。即每IOOO个细胞中的分裂细胞数比上未分裂细胞数的百分数。
结果数据比较
检测指标本发明的培养基 一般培养基的
淋巴细胞转化率 ^ 60% 5-10%
分裂指数 》6% 0%
pH值范围 7.2 ±0.2 6.8-7.5 。
权利要求
1.一种人体外周血淋巴细胞培养基，含下列原料成分及重量百分比RPMI1640液体培养基77-81.9％牛血清10-14.9％PHA 4-6％非硫酸化糖胺聚糖 2-5％CPPs 2-5％双抗 0.05-0.1％。
2. 如权利要求l所述人体外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，所述人体外周血淋巴细胞 培养基pH值为7.2土0.2。
3. 如权利要求1所述人体外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，所述非硫酸化糖胺聚糖为 HA。
4. 如权利要求1所述人体外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，所述双抗为青霉素和链霉 素的混合物。
5. 如权利要求1-4中任一权利要求所述人体外周血淋巴细胞培养基用于哺乳动物外周血淋 巴细胞的培养。
全文摘要
本发明涉及一种人体外周血淋巴细胞培养基及其应用，本发明的人体外周血淋巴细胞培养基，包括RPMI1640液体培养基77-81.9％、牛血清10-14.9％、PHA 4-6％、非硫酸化糖胺聚糖2-5％、CPPs 2-5％和双抗0.05-0.1％。本发明提供的细胞培养基淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性好，得到的人体染色体图形可为染色体核型分析临床诊断提供强有力的依据。
文档编号C12N5/08GK101550408SQ200910050790
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者崔贻芬 申请人:上海尧浩生物技术有限公司