专利名称：生物转化l-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，具 体地说涉及一种以十六(四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化L-苯丙氨酸生 产2-苯乙醇的方法。
背景技术：
2-苯乙醇，又名β _苯乙醇，常温下是无色透明的液体，天然存在于一些花和植物 比如玫瑰、茉莉等的精油中。2-苯乙醇具有的玫瑰香味深受人们欢迎，是所有玫瑰香型香气 的基本组分，使其在食品、化妆品、日用品、烟草和药品中有广泛的应用。天然2-苯乙醇一般直接从植物中直接提取，而目前广泛应用于生产的则是化学 合成法，采用的原料是甲苯。1907年Ehrlich发现在一些酵母细胞中，L-苯丙氨酸通过转 氨作用生成苯丙酮酸、再脱羧形成苯乙醛，苯乙醛经氧化脱氢酶作用生成2-苯乙醇，这条 途径后来以Ehrlich的名字命名(Ehrlich,Ber Dtsch Chem Ges 1907)。利用这条途径通 过生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇是目前生物合成法制备2-苯乙醇的主要方法。研究发现，高浓度的2-苯乙醇对酵母细胞有一定的毒性，会抑制的酵母的生产， 同时，酿酒酵母在生长过程中积累的乙醇和2-苯乙醇的联合作用比起单独2-苯乙醇的毒 性要大得多，因此影响了生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的产量。要解决这个问题， 一种方法是通过菌株改造来提高生产菌株对2-苯乙醇的耐受能力，另一种则是采用原位 产物分离的生物转化方法，一般是采用添加萃取剂的两相生物转化，即是在生物转化过程 中添加萃取剂形成油水两相，产生的2-苯乙醇被不断的萃取到有机相中，减小了水相中 2-苯乙醇的浓度，从而减少对菌株的毒性。因此不仅提高了产物2-苯乙醇的浓度，又可 以实现了产物的分离，简化了生产中2-苯乙醇的分离提取步骤，目前报道较多的萃取剂是 油酸、油醇和聚丙二醇等。Stark等人以油酸作为萃取剂，采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)进行两相补料分批转化，最终2_苯乙醇浓度可达到12. 6克/升 (Stark et al.，Biotechnol Prog2002)。Etschmann等人以油醇为萃取剂，以克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianusCBS 600)为生产菌株，在摇瓶培养体系中加入50毫升水相培 养基和50毫升油醇，最终从9克/升L-苯丙氨酸获得5. 6克/升2-苯乙醇，摩尔转化率为 84% (Etschmannet al.，J Mol Catal B :Enzymatic，2004)。虽然这些工艺明显的提高了 2-苯乙醇的产量，但萃取剂的加入也给产物的分离提取带来了一定的困难，尤其是油酸，在 高温减压蒸馏过程中会与2-苯乙醇发生酯化反应，给2-苯乙醇的提取带来较大困难，影响 了其产业化应用。
发明内容
本发明的目的在于针对目前生物法生产2-苯乙醇的过程中，产物对微生物细胞 的毒性以及产物浓度较低、而使用油酸的原位产物分离生物转化方法产物提取困难等问 题，提供了一种以十六(四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法。本发明使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株进行 生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇时，添加十六酸异丙酯或者十四酸异丙酯作为萃取剂 进行原位产物分离生物转化以提高产物的浓度，其步骤如下 (1)斜面培养将 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株接种到固 体斜面培养基上，在35 °C条件下，静置培养24小时；(2)制备种子培养液用步骤(1)所得的斜面培养物，刮取一环菌体接种到液体种 子培养基中，在35°C条件下，180转/分钟振荡培养24小时，制得种子培养液；(3)生物转化使用步骤(2)所得的种子培养液，以6% (体积比)的接种量接种 MPK培养基，35°C条件下，180转/分钟振荡培养。在生物转化开始0 10小时加入十六酸 异丙酯或十四酸异丙酯，加入量为体积比1 1 1 10(油水)。在上述以十六(四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化L-苯丙氨酸生 产2-苯乙醇的方法中，种子培养使用的液体种子培养基配方为1升蒸馏水中含葡萄糖20 克，酵母粉2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化钠5克。固体斜面培养基配方为在液体种子培养基 基础上添加质量体积比1. 6%的琼脂。在上述以十六(四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化L-苯丙氨酸生 产2-苯乙醇的方法中，MPK培养基配方为1升蒸馏水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷 酸二氢钾0.5克。本发明的优点是使用以十六(四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化 L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，不仅有效解决了 2-苯乙醇对酵母细胞的毒性问题，提高 了 2-苯乙醇产量，也简化了产物的分离提取步骤，降低了 2-苯乙醇的提取难度，可以较好 的代替目前应用较多的油酸或油醇。本发明属于生物技术领域，该方法可应用于2-苯乙醇 的生物法生产，具有很大的应用前景。
具体实施例方式实施例一在利用Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株生物转化 L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的过程中，不添加萃取剂直接进行生物转化。其详细步骤如下(1)斜面培养将 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 接种到固体斜 面培养基上，在35 °C条件下，静置培养24小时；(2)制备种子培养液用步骤(1)所得的斜面培养物，刮取一环菌体接种到液体种 子培养基中，在35°C条件下，180转/分钟振荡培养24小时，制得种子培养液；(3)生物转化使用步骤(2)所得的种子培养液，以6% (体积比)的接种量接种 到MPK培养基中，35°C条件下，180转/分钟振荡培养。40小时后发酵液中2-苯乙醇浓度 为3.4克/升。在上述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法中，种子培养使用的液体种 子培养基配方为1升蒸馏水中含葡萄糖20克，酵母粉2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化钠5克。 固体斜面培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1. 6%的琼脂。在上述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法中，MPK培养基配方为1升 蒸馏水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷酸二氢钾0. 5克。
实施例二在利用Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株以十六 (四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的过程中，在 生物转化开始后加入萃取剂十六酸异丙酯或十四酸异丙酯。其详细步骤如下(1)斜面培养将 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 接种到固体斜 面培养基上，在35 °C条件下，静置培养24小时；(2)制备种子培养液用步骤(1)所得的斜面培养物，刮取一环菌体接种到液体种 子培养基中，在35°C条件下，180转/分钟振荡培养24小时，制得种子培养液；(3)生物转化使用步骤(2)所得的种子培养液，以6% (体积比)的接种量接种 MPK培养基，35°C条件下，180转/分钟振荡培养。在生物转化开始0小时加入十六酸异丙酯 或十四酸异丙酯，加入量为体积比1 10(油水)。40小时后水相2-苯乙醇浓度为3. 7 克/升，有机相2-苯乙醇浓度为14. 18克/升。在上述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法中，种子培养使用的液体种 子培养基配方为1升蒸馏水中含葡萄糖20克，酵母粉2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化钠5克。 115°C条件下灭菌20分钟。固体斜面培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积 比1.6%的琼脂。在上述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法中，MPK培养基配方为1升 蒸馏水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷酸二氢钾0. 5克。115°C条件下灭菌20分钟。实施例三与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)中加入萃取剂 十六酸异丙酯，加入量为体积比1 5(油水)。40小时后水相2-苯乙醇浓度为3. 09克 /升，有机相2-苯乙醇浓度为11克/升。实施例四与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)加入萃取剂 十六酸异丙酯，加入量为体积比1 3(油水)。40小时后水相2-苯乙醇浓度为2. 6克 /升，有机相2-苯乙醇浓度为8. 86克/升。实施例五与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)加入萃取剂 十六酸异丙酯，加入量为体积比1 2(油水)。40小时后水相2-苯乙醇浓度为1.93克 /升，有机相2-苯乙醇浓度为6. 3克/升。实施例六与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)加入萃取剂 十六酸异丙酯，加入量为体积比1 1 (油水)。40小时后水相2-苯乙醇浓度为1. 31克 /升，有机相2-苯乙醇浓度为4. 58克/升。
实施例七与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)在生物转化开 始4小时加入萃取剂十六酸异丙酯，加入量为体积比1 2(油水)。40小时后水相2-苯 乙醇浓度为1. 8克/升，有机相2-苯乙醇浓度为6. 15克/升。实施例八
与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)在生物转化开始8小时加入萃取剂十六酸异丙酯，加入量为体积比1 2(油水)。40小时后水相2-苯 乙醇浓度为1. 95克/升，有机相2-苯乙醇浓度为6. 1克/升。实施例九与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)在生物转化开 始10小时加入萃取剂十六酸异丙酯，加入量为体积比1 2(油水)。40小时后水相2-苯 乙醇浓度为2克/升，有机相2-苯乙醇浓度为5. 88克/升。实施例十与上述实施例二的步骤及培养基成分相同，所不同的只是步骤(3)加入的萃取剂 为十四酸异丙酯，加入量为体积比1 1(油水)。40小时后水相2-苯乙醇浓度为1.25 克/升，有机相2-苯乙醇浓度为4. 49克/升。
权利要求
一种生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其特征在于使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株进行生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇时，添加萃取剂进行原位产物分离生物转化，所添加的萃取剂为十六酸异丙酯或者十四酸异丙酯，其步骤如下(1)斜面培养将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株接种到固体斜面培养基上，在35℃条件下，静置培养24小时；(2)制备种子培养液用步骤(1)所得的斜面培养物，刮取一环菌体接种到液体种子培养基中，在35℃条件下，180转/分钟振荡培养24小时，制得种子培养液；(3)生物转化使用步骤(2)所得的种子培养液，以体积比6％的接种量接种MPK培养基，35℃条件下，180转/分钟振荡培养，在生物转化开始后添加萃取剂十六酸异丙酯或十四酸异丙酯。
2.根据权利要求1所述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步骤(2)种子培养使用的液体种子培养基配方为1升蒸馏水中含葡萄糖20克，酵母粉 2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化钠5克。
3.根据权利要求1或2所述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其特征在 于其中步骤(1)固体斜面培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.6%的 琼脂。
4.根据权利要求1所述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步骤(3)添加萃取剂的时间为生物转化开始后0 10小时。
5.根据权利要求1所述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步骤(3)添加萃取剂的量为体积比油水1 1 1 10。
6.根据权利要求1所述的生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步骤(3)MPK培养基配方为1升蒸馏水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷酸二氢钾0. 5 克。
全文摘要
本发明公开了一种生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，以十六(四)酸异丙酯为萃取剂的原位产物分离生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇。在使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的过程中，添加十六(四)酸异丙酯作为萃取剂进行原位产物分离生物转化，可代替目前常用的萃取剂油酸或者油醇，降低产物2-苯乙醇对细胞的毒性，简化了产物的分离提取步骤，降低了2-苯乙醇的提取难度，有利于2-苯乙醇的分离提取，提高产物产量。
文档编号C12P7/22GK101864456SQ20091004956
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者华栋梁, 张兆斌, 杜毅, 甘霖, 许平, 魏中浩 申请人:上海凯信生物科技有限公司