一种来源于虎眼万年青的苯丙氨酸解氨酶，其核苷酸序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种苯丙氨酸解氨酶，其编码基因及其在催化底物L-苯丙氨酸为反 式肉桂酸，以及催化底物L-酪氨酸为对香豆酸反应中的应用，属于基因工程领域。特别涉 及虎眼万年青苯丙氨酸解氨酶，其编码基因及其在催化底物L-苯丙氨酸为反式肉桂酸，以 及催化底物L-酪氨酸为对香豆酸反应中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 苯丙氛酸解氛酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC4. 3. 1. 5)作为苯丙烧类 代谢途径的关键酶，在自然界中通过参与苯丙氨酸和酪氨酸等氨基酸的降解，形成反式肉 桂酸和对香豆酸等代谢中间产物，这些中间产物在香豆酰辅酶A连接酶的作用下转化为硫 酯化合物，再通过多条途径进一步转化为黄酮和异黄酮等次生代谢产物。其中黄酮类化合 物在自然界中种类众多，已有超过9000多种被发现，它们不仅赋予了花朵美丽的颜色，也 同人类健康息息相关。黄酮类化合物具有多种药理活性：抗氧化消除体内的氧负离子；降 低血小板、抑制体内低密度脂蛋白氧化保护心血管；抑制纤维母细胞生长从而发挥抗炎作 用；此外还具有雌激素样作用从而在抗肿瘤，抗骨质疏松等中发挥疗效。一些黄酮类药物 已经上市，如黄芩苷，银杏黄素和葛根素等。因此，克隆PAL基因并对其进行功能鉴定对于 通过合成生物学技术规模化制备黄酮类天然产物，减少由于化学合成以及植物提取黄酮类 天然产物等传统方法对环境和物种造成的压力，从而促进社会可持续发展具有很重要的意 义。
[0004] 迄今为止，已在多种植物，真菌，细菌等生物中发现并克隆得到苯丙氨酸解氨酶基 因，而尚没有从虎眼万年青（Ornithogalum saundersiae)中分离得到该蛋白的报道。本发 明根据转录组测序结果，通过提取虎眼万年青RNA，利用RT-PCR，从虎眼万年青无菌鳞茎中 克隆得到一个完整的PAL基因，命名为0saPAL2基因，并对其进行了功能鉴定，这是首次从 虎眼万年青植物中克隆得到这个基因。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的是提供一种苯丙氨酸解氨酶。
[0006] 本发明的第二目的是提供编码该酶的核苷酸序列。
[0007] 本发明的第三目的是提供含有该核苷酸序列的表达载体。
[0008] 本发明的第四目的是提供含有该表达载体的宿主细胞。
[0009] 本发明的第五目的是提供苯丙氨酸解氨酶的应用。
[0010] 为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：
[0011] 本发明提供一种来源于虎眼万年青的苯丙氨酸解氨酶，其特征在于：
[0012] a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0013] b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经替换，缺失或添加1-71个氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。
[0014] 本发明还提供一种编码所述苯丙氨酸解氨酶的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 本发明还提供一种含有所述核苷酸序列的表达载体。
[0016] 本发明还提供一种所述表达载体的宿主细胞。其中所选宿主细胞优选大肠杆菌， 酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌和植物细胞，更优选的宿主细胞选自大肠杆菌。
[0017] 本发明还提供了苯丙氨酸解氨酶或含有苯丙氨酸解氨酶的细胞在催化底物L-苯 丙氨酸为反式肉桂酸以及L-酪氨酸为对香豆酸反应中的应用。其中苯丙氨酸解氨酶的底 物包括L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，形成的产物分别为反式肉桂酸和对香豆酸。
【附图说明】
[0018] 图I :0saPAL2基因的PCR分析结果，其中M是DNA分子量标准；1是0saPAL2基因 PCR结果。
[0019] 图2 :重组质粒pET28a_0saPAL2示意图。
[0020] 图3 :0saPAL2重组蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中M为蛋白分子量标准；1为 0saPAL2 ;2为空载体对照。
[0021] 图4 :0saPAL2重组蛋白免疫印迹结果，其中CK为对照；1，2为0saPAL2。
[0022] 图5 :咪唑洗脱纯化后0saPAL2蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中1为目的蛋白； M为蛋白分子量标准。
[0023] 图6 :0saPAL2重组酶催化L-苯丙氨酸HPLC-UV检测结果，其中1为底物L-苯丙 氨酸标准品；2为反式肉桂酸标准品；3为对照组(空载体）；4为实验组。
[0024] 图7 :0saPAL2重组酶催化L-酪氨酸HPLC-UV检测结果，其中1为香豆酸标准品； 2为底物L-酪氨酸；3为对照组(空载体）；4为实验组。
[0025] 图8 :0saPAL2催化L-苯丙氨酸产物及反式肉桂酸标准品HPLC-MS结果，其中1为 反式肉桂酸标准品；2为PAL2-L-Phe-p。
[0026] 图 9 :化合物 PAI^-L-Phe-P1H NMR 图。
[0027] 图 10 :化合物 PAL2-L-Phe_p13C NMR 图。
[0028] 图 11 :化合物 PAL2-L-Phe_p HSQC 图。
[0029] 图 12 :化合物 PAL2-L-Phe_p HMBC 图。
[0030] 图 13 :化合物 PAL2-L-Tyr_p ESI-MS 图。
[0031] 图 14 :化合物 PAI^-L-Tyr-P1H NMR 图。
[0032] 图 15 :化合物 PAL2-L-Tyr_p13C NMR 图。
[0033] 图 16 :化合物 PAL2-L-Tyr_p HSQC 图。
[0034] 图 17 :化合物 PAL2-L-Tyr_p HMBC 图。
[0035] 图18 :温度对0saPAL2催化L-苯丙氨酸活性的影响。
[0036] 图19 :pH对0saPAL2催化L-苯丙氨酸活性的影响。
[0037] 图20 :0saPAL2催化L-苯丙氨酸酶活曲线图。
[0038] 图 21 :0saPAL2 催化 L-苯丙氨酸 Lineweaver-Burk 双倒数图。
[0039] 图22 :温度对0saPAL2催化L-酪氨酸活性影响。
[0040] 图23 :pH对0saPAL2催化L-酪氨酸活性影响。
[0041] 图24 :0saPAL2催化L-酪氨酸酶活曲线。
[0042] 图 25 :0saPAL2 催化 L-酪氨酸 Lineweaver-Burk 双倒数图。
[0043] 图26 :0saPAL2同其余物种PAL氨基酸序列系统进化树分析图。
[0044] 图27 :0saPAL2催化L-苯丙氨酸产物PAL2-L-Phe_p结构。
[0045] 图 28 :0saPAL2 催化 L-酪氨酸产物 PAL2-L-Tyr_p 结构。
【具体实施方式】
[0046] 本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是 以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0047] 实施例1虎眼万年青转录组测序及序列分析
[0048] 提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA后，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合 成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱之后做末端修复、 加 poly (A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩 增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。
[0049] 测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。对raw reads进行数据过滤，去掉带接头的，重复的，测序质量很低的reads,得到 clean reads。使用短reads组装软件Trinity将具有一定长度overlap的clean reads连 成更长的片段，即Contig。然后，将clean reads比对回Contig，通过paired-end reads能 确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，Trinity将这些Contig 连在一起，得到两端不能再延长的序列，这些序列称之为Unigene。通过blastx将Unigene 序列比对到蛋白数据库nr、Swiss_Prot、KEGG和COG (evalue〈0. 00001)，并通过blastn将 Unigene比对到核酸数据库nt (evalue〈0. 00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似 性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。
[0050] 通过功能注释，获得了两个和苯丙氨酸解氨酶具有很高相似性的Unigene，即 Unigene26221 (SEQ ID N0.3)和 Unigene25031 (SEQ ID N0.4)。通过 Blast X 对上述两个 Unigene进行比对，推断这两个Unigene属于同一个基因，而且Unigene26221含有苯丙氨 酸解氨酶编码基因的5'端，Unigene25031含有苯丙氨酸解氨酶基因的3'端。根据这两个 Unigene 设计两对特异性的引物，FPALl (5'-CATCATAATCTGACGGTTTTC-3，）（SEQ ID NO. 5)， FPAL2(5 '-ATGGAGAACGGCAACGGTAAC-3) (SEQ ID NO. 6)，RPAL3(5 '-CAGAATTATGAAATTCCAGC C-3'）（SEQ ID N0.7)和 RPAL4(5' -TCAACATATTGGCAGCGGTGC-3'）（SEQ ID N0.8)。
[0051] 实施例20saPAL2基因克隆
[0052] 取IOOmg虎眼万年青无菌鳞茎于液氮中速冻，研钵研成细粉状，按RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)使用说明，提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA。使用RT-PCR Kit (ReverTra-Plus-，Τ0Υ0Β0)将虎眼万年青无菌鳞莖总RNA反转录成cDNA。反转录体系和 程序如下：在 20 μ L 体系中加入总 RNAl μ g，RNase Free H2CM μ L，01ig(dT)2(lly L，65 °C 保温5min后，立刻置于冰上冷却，然后在上述管中再依次加入5XRT buffer4yL，RNase Inhibitor (10U/μι) 1 μ L，dNTP Mixture (IOmM)和 ReverTra Acel μ L，3CTC 保温 10min， 42°C温育60min，85°C变性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20°C备用。
[0053] 以虎眼万年青无菌鳞茎cDNA为模板，通过巢式PCR的方法扩增0saPAL2基因。
[0054] 第一轮 PCR，50y L 体系中含 10XPCR buffer5y L，2mM dNTPs5y L，25mM MgS043 μ L，10 μ M 的引物 FPALl 和 RPAL3 各 I. 5 μ L，KOD-Plus-Neol μ L，CDNA2 μ L，ddH20 补足。PCR程序：94°C预变性5min ;98°C变性30s，53°C复性45s，每一个循环递减1°C，68°C 延伸12〇8，共15循环；981：变性3〇8,381：复性458,681：延伸12〇8，共15循环；681：延伸 711^11，41：保温。第二轮？〇?，5(^1^体系中含10\?〇?131^€615 4 1^，21111(1阶1^5 4 1^，251111 MgS043 μ L，10 μ M 的引物 FPAL2 和 RPAL4 各 1. 5 μ L，KOD-Plus-Neol μ L，第一轮 PCR 产物 2μ