一种微生物生产间苯甲氨酸的方法
【专利摘要】一种微生物生产间苯甲氨酸的方法，具体是一种黑曲霉生物催化制备医药中间体间苯甲氨酸的方法，微生物发酵液中加入底物，进行生物催化反应，产品收率高，反应条件温和，常温、常压操作，解决了现有方法生产条件苛刻的困难。
【专利说明】
-种微生物生产间苯甲氨酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别设及到黑曲霉生物催化制备医药中间体间苯 甲氨酸的技术。
【背景技术】
[0002] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件溫和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸 引力的应用领域之一，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。
[0003] 芳控的簇化反应是一类重要的反应，其产物为芳控径基簇酸，是重要的药物合成 起始原料。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳控与C〇2反应，反应压力高达lOMPa， 溫度高达140-380°C，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变运种状况。采 用微生物催化，可W在常溫、常压下反应生产芳控径基簇酸，条件溫和，选择性高，副反应 少，产率高。
[0004] 本发明将采用微生物催化反应，生产芳控径基簇酸:间苯甲氨酸。
【发明内容】
[0005] 本发明采用黑曲霉催化制备间苯甲氨酸，反应式如下：
底物苯酷胺（1)经黑曲霉催化反应，得到产物间苯甲氨酸(2)。有多种微生物可W催化 此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用黑曲霉作为催化剂，因为其催化反应的效果最 好，副产物极少，反应收率高。
[0006] 许多霉菌都可W进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发 明选用黑曲霉菌株为DSM-22593,其催化反应效果最佳。
[0007] 由于底物溶解度较低，所W，加入表面活性剂W增加底物的溶解度。尽管表面活性 剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质 为反应的限制环节，所W，还需采取措施，W提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是 提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后，在强烈揽拌下，反应液成为乳液，使 得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须 生物相容，不抑制微生物的催化活性，所W，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。 大量实验表明，对于本反应，加入支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙締酸21-23g/L是最佳的。
[0008] 反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可W破乳，包括盐析法： 加入氯化钢、硫酸锭或氯化巧、氯化儀、硫酸巧、硫酸儀;凝聚法:加入聚合氯化侣、明抓等； 或者将上述2类混合加入;加热等。不同产物，所用的方法不同，实验表明，对于本反应，加入 1.1%的氯化钢+0.1%的聚合氯化侣是最佳的。
[0009] 簇化反应中，采用化肥化提供C〇2,实际上，有多种物质可W提供C〇2,但是，通过大 量实验，结果表明，对于本发明，使用化肥化是最佳的。由于加入化肥化会使反应液的pH升 高，而适宜的抑，对微生物催化反应致关重要，所W，不能一次加入，必须采用流加方式加入 Na肥化。然而，即使流加化肥化，反应液的抑仍然升高，所W，还必须采取措施，维持反应液处 于适宜的抑，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液是 适宜的方法，调节化肥化与盐酸水溶液的流加速率，可W使溶液的抑处于最佳范围，使生物 催化反应正常进行。
[0010] 可W明显看出，本发明所设及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、 〇化供体选择，还有反应溫度，反应时间，反应抑，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众 多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反 应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所W，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催 化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。
[0011] 培养介质： 1、种子培养基成份为：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白腺20 g/L，麦芽浸膏 25-30 g，硫酸锭0.5-0.7g/l;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0012] 2、培养液成份:玉米浆（W干物质计)含量为20-22g/L，酵母浸膏9-10 g/L，葡萄 糖20-22 g/L，麦芽浸膏15-18g、小麦教皮粉17-20g/L，硫酸锭0.5-0.7g/L，硫酸儀0.3- 0.4g/L，憐酸二氧钟1.8-2.3g/L，碳酸巧0.7 g/L，硫酸亚铁0.18 g/L，硫酸儘0.025 g/ L;pH 6.5O
[0013] 3、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0014] 微生物发酵液制备。黑曲霉DSM-22593经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵 罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，12rC高压灭菌30分钟，冷却至29-30°C，将黑曲霉菌种 子液接种至发酵罐，接种比例为7-8%，通气比为1.，2 -1.4V/V?分钟，29-30°C培养46-49小 时，发酵液中湿酵母细胞浓度为91-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
[0015] 用HPLC测产品收率及纯度，C18柱，紫外检测器，波长254皿，流动相为抑3的憐酸缓 冲液：甲醇=90:10。
[0016] 生物催化反应:发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物苯酷 胺，使浓度为85-90g/L，补加 W下成份，使浓度为:支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙締酸21- 23g/L，木糖22-24g/L、麦芽糖26-28g/L、燕麦粉22-24g/L，12 rC高压灭菌30分钟；冷却至 33-35 °C时，揽拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为50-55小时;反应开始时，立即流加浓 度为4.5 %的N址CO冰溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节Na肥化与盐酸水溶液 的流加速率，维持P册.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.45V/V ?分钟， 即每分钟通气量为0.4-0.45倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙 醋萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙醋，得到产物间苯甲氨酸，反应转化 率98.2-99.5%，产品收率96.1-97.6%。
[0017]实施例1 培养液成份:玉米浆（W干物质计)含量为20-22g/L，酵母浸膏9-10 g/L，葡萄糖20- 22 g/L，麦芽浸膏15-18g、小麦教皮粉17-20g/L，硫酸锭0.5-0.7g/L，硫酸儀0.3-0.4g/L，憐 酸二氧钟1.8-2.3g/L，碳酸巧0.7旨/1，硫酸亚铁0.18 g/l，硫酸儘0.025 g/L;pH 6.5。
[0018] 微生物发酵液制备。黑曲霉DSM-22593经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵 罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，12rC高压灭菌30分钟，冷却至29-30°C，将黑曲霉菌种 子液接种至发酵罐，接种比例为7-8%，通气比为1.，2 -1.4V/V?分钟，29-30°C培养46-49小 时，发酵液中湿酵母细胞浓度为91-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
[0019] 生物催化反应：1化发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 苯酷胺，使浓度为85-90g/L，补加W下成份，使浓度为:支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙締酸 21-23g/L，木糖22-24g/L、麦芽糖26-28g/L、燕麦粉22-24g/L，12rC高压灭菌30分钟;冷却 至33-35°C时，揽拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为50-55小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的化HC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC〇3与盐酸水溶 液的流加速率，维持抑6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.45V/V ?分 钟，即每分钟通气量为0.4-0.45倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸 乙醋萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙醋，得到产物间苯甲氨酸，反应转 化率98.2-99.5 %，产品收率96.1 -97.6 %。
[0020] 实施例2 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0021] 生物催化反应:150L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 苯酷胺，使浓度为85-90g/L，补加W下成份，使浓度为:支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙締酸 21-23g/L，木糖22-24g/L、麦芽糖26-28g/L、燕麦粉22-24g/L，12rC高压灭菌30分钟;冷却 至33-35°C时，揽拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为50-55小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的化HC03水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC〇3与盐酸水溶 液的流加速率，维持抑6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.45V/V ?分 钟，即每分钟通气量为0.4-0.45倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、 0.1倍反应液体积的乙酸乙醋萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙醋，得到产物 间苯甲氨酸，反应转化率98.2 %，产品收率96.1 %。
[0022]实施例3 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0023]生物催化反应：100化发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底 物苯酷胺，使浓度为85-90g/L，补加W下成份，使浓度为:支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙締 酸21-23g/L，木糖22-24g/L、麦芽糖26-28g/L、燕麦粉22-24g/L，12rC高压灭菌30分钟;冷 却至33-35°C时，揽拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为50-55小时;反应开始时，立即流 加浓度为4.5 %的NaHC〇3水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC〇3与盐酸水 溶液的流加速率，维持抑6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.45V/V ? 分钟，即每分钟通气量为0.4-0.45倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、 0.1倍反应液体积的乙酸乙醋萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙醋，得到产物 间苯甲氨酸，反应转化率99 %，产品收率96.8 %。
[0024] 实施例4 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0025]生物催化反应:15000L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底 物苯酷胺，使浓度为85-90g/L，补加 W下成份，使浓度为:支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙締 酸21-23g/L，木糖22-24g/L、麦芽糖26-28g/L、燕麦粉22-24g/L，12rC高压灭菌30分钟;冷 却至33-35°C时，揽拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为50-55小时;反应开始时，立即流 加浓度为4.5 %的NaHC〇3水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHC〇3与盐酸水 溶液的流加速率，维持抑6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.45V/V ? 分钟，即每分钟通气量为0.4-0.45倍反应液体积，反应结束后，破乳，用逆流萃取机萃取，萃 取液为乙酸乙醋，蒸出有机相的乙酸乙醋，蒸出乙酸乙醋，得到产物间苯甲氨酸，反应转化 率99.5%，产品收率97.6%。
【主权项】
1. 一种黑曲霉生物催化制备间苯甲氨酸的方法，其特征在于黑曲霉发酵液中加入底物 苯酰胺，使浓度为85-90g/L，补加以下成份，使浓度为:支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚 21-23g/L，木糖22-24g/L、麦芽糖26-28g/L、燕麦粉22-24g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却 至33-35 °C时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为50-55小时;反应开始时，立即流加 浓度为4.5 %的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为0.9 %的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶 液的流加速率，维持PH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.45V/V ·分 钟，即每分钟通气量为〇. 4-0.45倍反应液体积，反应结束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反应液， 有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物间苯甲氨酸，反应转化率98.2-99.5%，产品收率96.1_ 97.6 % ;所述发酵液由培养液发酵微生物得到。2. 权利要求1所述的方法，其特征在于黑曲霉发酵液制备过程如下：黑曲霉经斜面、摇 瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121°C高压灭菌30分 钟，冷却至29-30Γ，将黑曲霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为7-8%，通气比为1.，2 -1.4V/V.分钟，29-30 °C培养46-49小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为9l-95g/L，此发酵液用 作生物催化反应催化剂;培养液成份:玉米浆含量为20-22g/L，酵母浸膏9-10 g/L，葡萄糖 20-22 g/L，麦芽浸膏15-18g、小麦麸皮粉17-20g/L，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/ 1^，磷酸二氧钾1.8-2.38/1，碳酸钙0.7 8/1，硫酸亚铁0.18 8/1，硫酸锰0.025 8/1;?!1 6.5〇
【文档编号】C12R1/685GK105925630SQ201610464878
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】彭伟, 张媛媛, 刘均洪
【申请人】青岛科技大学