一种转氨酶的固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种转氨酶的固定化方法。
【背景技术】
[0002] 转氨酶可将化合物中的幾基转化为氨基。可W高效生产手性胺，因其底物相对廉 价、产物纯度高、反应条件温和的特点，应用价值巨大。
[0003] 固定化酶易于与产品分离并可回收重复使用，比游离酶具有更好的稳定性W及更 长的操作周期。酶或细胞的固定化方法很多，如物理吸附、亲和联结、共价交联、凝絮包埋 等。
[0004] CN201280031237使用树脂为载体固定转氨酶，但W树脂为载体，存在树脂价格昂 贵，载酶量低的缺点。W该专利实施例1~5为例，1克树脂载体仅能固载0. 125克转氨酶， 固定化转氨酶酶活单位低；且现有固定化方法无纯化过程，会将游离酶中的杂质蛋白也固 定于载体。
[0005] 聚己締醇海绵是由聚己締醇缩醒化而得，具有优异的吸水和力学性能，比表面积 大，有作为转氨酶固定化载体的潜质，但聚己締醇海绵仅含有哲基活性基团，不利于采用化 学键固定转氨酶。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种经济可行的，载酶量高、固定化酶酶活 高、有纯化作用的转氨酶的固定化方法。
[0007] 本发明提供了一种转氨酶的固定化方法，其特征包括如下步骤：
[000引 a、氧化；取聚己締醇海绵，在双氧水溶液中，加入铁盐为催化剂，将聚己締醇海绵 上部分哲基氧化为幾基；氧化后的聚己締醇海绵离屯、或挤压去除氧化溶液，加水，再离屯、或 挤压脱水。
[0009] b、转氨；将脱水海绵与转氨酶水溶液混合，加入辅酶、氨基供体，将海绵上的幾基 转化氨基；再离屯、或挤压去除海绵中溶液。
[0010] C、交联固定；加入絮凝剂使酶沉淀于海绵孔壁内，再离屯、或挤压去除海绵中溶液； 再将海绵与多元醒混合交联转氨酶，离屯、或挤压去除海绵中溶液。
[0011] t视需要重复步骤b至C数次，W增加酶或细胞在载体上的载量。水洗漆固定化 酶。
[0012] 其中，a步骤所述的双氧水溶液体积浓度为0.01~0.1%，双氧水溶液与聚己締醇 海绵重量比为20~100:1。
[0013] 其中，a步骤所述的铁盐选自硫酸亚铁、硫酸铁、氯化亚铁、氯化铁的一种或多种。
[0014] 其中，a步骤所述的氧化反应温度为20°C~70°C，进一步优选为55°C~65°C。
[0015] 其中，b步骤所述的氨基供体为2-丙胺。
[0016] 其中，b步骤所述的辅酶为B族维生素，进一步优选为化唉醒、化唉胺、磯酸化唉 醇、磯酸化唉胺、磯酸化唉醒的一种或多种。
[0017]其中，b步骤所述的转氨反应温度为20°C~60°C。
[001引其中，C步骤所述的絮凝剂选自壳聚糖、聚己締亚胺（PEI)、駿甲基聚己締亚胺 (CMPEI)0
[0019] 其中，C步骤所述的多元醒为戊二醒。
[0020] 本发明的有益技术效果：
[0021] 1、使用聚己締醇海绵为载体，聚己締醇海绵具有孔洞丰富，比较面积大，载酶量大 的特点；2、聚己締醇海绵中部分哲基氧化为幾基，幾基经转氨酶转化为氨基，氨基通过戊二 醒与转氨酶化学交联，化学键连接酶与载体更牢固，酶不易脱落，稳定性好；3、转氨过程中， 转氨酶进入海绵孔洞，催化海绵上的幾基转化为氨基，从而转氨酶"富集"于海绵中，加入絮 凝剂，转氨酶则沉淀于海绵孔壁内，其他杂质则无该"富集"现象，杂质在"离屯、或挤压去除 海绵中溶液"步骤中随溶液被除去，本发明对转氨酶有纯化作用，可在固定化酶应用过程中 消除部分杂酶引起的副反应。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
[0024]a、将聚己締醇海绵切成27mm3,取10. 0克海绵颗粒加入烧杯中，加入1000ml水，机 械揽拌，加入O.OlOg硫酸亚铁，加入1.00ml30%双氧水，升温至60°C，反应4小时。将反 应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，在将布袋浸泡于纯化水中5分钟，再将布袋 中的海绵颗粒挤压干脱水，得氧化聚己締醇海绵。
[002引 b、将氧化聚己締醇海绵，加入烧杯中，加入1000ml水，机械揽拌，加入10克 ATA-113转氨酶（Codex⑥），加入1克异丙胺盐酸盐，加入0. 50克磯酸化唉醒，用异丙胺调 节抑至7. 5,加热至40°C反应6小时，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干， 得氨基化聚己締醇海绵。
[0026] C、将氨基化聚己締醇海绵倒入烧杯中，加入0. 1 %壳聚糖溶液100ml，混合10 分钟，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干；将所得海绵倒入烧杯中，加入 0. 1 %戊二醒溶液100ml，混合，静置5分钟，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤 压干，得固定化酶。
[0027] 将所得固定化酶重复步骤b至c5次，W增加酶在载体上的载量。
[002引纯化水浸泡固定化酶，挤压脱水，40°C真空干燥8小时，得31. 7克固定化转氨酶。
[0029] 每1克聚己締醇海绵载体固载约2克转氨酶，远远优于CN2012800312371克树脂 载体仅能固载0. 125克转氨酶的水平；酶活收率高达96%，说明未固载损失的重量为去除 的杂质的重量。
[0030] 实施例2
[0031] 本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
[0032]a、将聚己締醇海绵切成27mm3。2000升反应蓋中，加入1000升水，开启揽拌，加入 10. 00千克海绵颗粒，加入加入10克硫酸亚铁，加入1. 00升30%双氧水，升温至55°C，反 应5小时。将反应液使用=足式离屯、机过滤，加入纯化水洗漆，离屯、脱水，得氧化聚己締醇 海绵。
[0033]b、2000升反应蓋中，加入1000升水，开启揽拌，加入氧化聚己締醇海绵，加入20千 克ATA-117转氨酶（Codex⑧），加入2. 00千克异丙胺盐酸盐，加入0. 75千克磯酸化唉醒， 用异丙胺调节抑至8. 0,加热至37°C反应8小时，将反应液离屯、过滤，脱除溶液，得氨基化 聚己締醇海绵。
[0034] C、将氨基化聚己締醇海绵倒入100升0. 3 %壳聚糖溶液中，混合10分钟，将混合液 离屯、过滤，脱除溶液；将所得海绵倒入烧杯中，加入100升0.2%戊二醒溶液中，混合，静置 10分钟，将将混合液离屯、过滤，脱除溶液，得固定化酶。
[0035] 将所得固定化酶重复步骤b至c3次，W增加酶在载体上的载量。
[0036] 纯化水洗漆，离屯、脱水，40°C真空干燥12小时，得35. 32千克固定化转氨酶。
[0037] 实施例3
[003引本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
[0039] a、将聚己締醇海绵切成27mm3。2000升反应蓋中，加入1000升水，开启揽拌，加入 10. 00千克海绵颗粒，加入加入10克氯化铁和5千克氯化亚铁，加入4. 00升10 %双氧水， 升温至60°C，反应5小时。将反应液使用=足式离屯、机过滤，加入纯化水洗漆，离屯、脱水，得 氧化聚己締醇海绵。
[0040] b、2000升反应蓋中，加入1000升水，开启揽拌，加入氧化聚己締醇海绵，加入5千 克ATA-117转氨酶（Codex⑧），加入2. 00千克异丙胺盐酸盐，加入0. 5千克磯酸化唉醇和 0. 5千克磯酸化唉胺，用异丙胺调节抑至8. 0,加热至30°C反应8小时，将反应液离屯、过滤， 脱除溶液，得氨基化聚己締醇海绵。
[0041] C、将氨基化聚己締醇海绵倒入100升0. 4%聚己締亚胺溶液中，混合10分钟，将混 合液离屯、过滤，脱除溶液；将所得海绵倒入烧杯中，加入100升0. 3%戊二醒溶液中，混合， 静置8分钟，将将混合液离屯、过滤，脱除溶液，得固定化酶。
[0042] 将所得固定化酶重复步骤b至C12次，W增加酶在载体上的载量。
[0043] 纯化水洗漆，离屯、脱水，40°C真空干燥14小时，得35. 87千克固定化转氨酶。
【主权项】
1. 一种转氨酶的固定化方法，其特征包括如下步骤： a、 氧化：取聚乙烯醇海绵，在双氧水溶液中，加入铁盐为催化剂，20°C~70°C反应，将 聚乙烯醇海绵上部分羟基氧化为羰基；氧化后的聚乙烯醇海绵离心或挤压去除氧化溶液， 加水，再离心或挤压脱水； b、 转氨：将脱水海绵与转氨酶水溶液混合，加入辅酶、氨基供体，将海绵上的羰基转化 氨基；再离心或挤压去除海绵中溶液； c、 交联固定：加入絮凝剂使酶沉淀于海绵孔壁内，再离心或挤压去除海绵中溶液；再 将海绵与多元醛混合交联转氨酶，离心或挤压去除海绵中溶液； d、 视需要重复步骤b至c步O~20次，以增加酶或细胞在载体上的载量，水洗涤固定 化酶。
2. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述的双氧水溶液体积浓度为 0.01~0. 1%，双氧水溶液与聚乙烯醇海绵重量比为20~100:1。
3. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述的铁盐为硫酸亚铁、硫酸 铁、氯化亚铁、氯化铁中的一种或多种。
4. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述反应温度为55°C~65°C。
5. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的氨基供体为2-丙胺。
6. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的辅酶为B族维生素。
7. 根据权利要求6所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的B族维生素为吡哆醛、 吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛中的一种或多种。
8. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的转氨反应温度为 20°C~60°C〇
9. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步骤所述的絮凝剂选自壳聚糖、聚 乙烯亚胺、羧甲基聚乙烯亚胺中的一种或多种。
10. 根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步骤所述的多元醛为戊二醛。
【专利摘要】本发明提供一种转氨酶的固定化方法。将聚乙烯醇海绵上的羟基氧化为羰基，加入转氨酶将羰基转化为氨基，絮凝后，再用多元醛交联固定化，得固定化转氨酶。该固定化方法，具有酶活单位为高，可纯化酶等优点。
【IPC分类】C12N11-08
【公开号】CN104774830
【申请号】CN201510140422
【发明人】黄清东, 张翔, 向世明
【申请人】成都百特万合医药科技有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月27日