尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶的应用，具体为尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶在制备用于诊断或检测2型糖尿病的制剂中的应用。本发明通过研究证实与正常对照组相比，谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶在2型糖尿病组患者的尿液中特异表达下调，从而能够用于2型糖尿病的诊治。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用随机尿标本检测谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶。
【专利说明】尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶的新用途，具体涉及尿液谷氨酰-脯 氨酰tRNA合成酶在2型糖尿病诊治中的应用。
【背景技术】
[0002] 2型糖尿病（diabetes mellitus type2)是全球重要的公共卫生问题之一，近二十 年来，随着中国经济的发展，人们的生活方式发生了显著的改变，2型糖尿病的患病人数呈 急剧增加趋势。由于中国人口老龄化的趋势，60岁以上的2型糖尿病患者已接近50%，并 以每年0. 1 %的速度递增。2型糖尿病已成为威胁中国居民生命和健康的重要疾病之一，是 亟待解决的重大公共卫生问题。
[0003] 2型糖尿病主要是由于胰岛素分泌和（或）作用缺陷引起的慢性血糖增高，涉及全 身性的糖类、脂类和蛋白质代谢紊乱。由于血糖浓度容易受多种因素（例如兴奋、劳累、感 冒、发烧和感染）的影响而产生波动，所以2型糖尿病患者需要不断的监测血糖变化，以相 应的调整药物剂量。血糖控制不佳以及脂肪、蛋白质代谢紊乱可导致眼、肾、心脏、血管等组 织器官及神经系统的慢性进行性病变、功能减退及衰竭。因此对2型糖尿病进行高危人群 的筛查和早期诊断，以便进行早期治疗，提高患者的生存质量，是2型糖尿病研究的重要课 题。
[0004] 谷氨醜-脑氨醜tRNA合成酶（Bifunctional aminoacyl-tRNA synthetase，EPRS) 是一种双功能团氨酰基tRNA合成酶，在同一条肽段上同时具有谷氨酸受体和脯氨酸受体 的催化活性，负责将谷氨酸和脯氨酸分别接载到对应tRNA的3'末端参与蛋白质翻译，此为 EPRS的经典功能。在哺乳动物细胞中，存在着细胞质和线粒体两套EPRS及其对应的tRNA， 证据表明，哺乳动物的细胞质EPRS还具有抑制炎症相关蛋白质翻译的非经典功能。在γ 干扰素的诱导下，EPRS上丝氨酸（Ser)被磷酸化，从而导致EPRS从多合成酶复合体（MSC) 中游离出来；而一旦游离，EPRS则可与NSAP1蛋白（一种核内核糖核蛋白）、磷酸化L13a( - 种核糖体蛋白）以及GAPDH相互作用，形成IFN- γ激活的翻译抑制子（GAIT)，并通过EPRS 上的核酸结合位点结合在靶标mRNA3'端非翻译区上的GAIT识别元件，选择性地沉默相应 蛋白质的翻译，从而终止炎症反应，阻止由于氧化酶累积导致的损伤。目前已发现EPRS也 可以通过GAIT选择性地沉默铜蓝蛋白，血管内皮生长因子A、死亡相关蛋白激酶和趋化因 子及其受体。GAIT途径的主要生理学功能是防止可能导致机体组织损伤的炎症相关蛋白 质的过度积累，降低慢性炎症反应。因遗传突变或环境压力的刺激导致GAIT途径的功能缺 陷，可能会加剧慢性炎症引起的机体失调。本实验中与健康对照组尿液相比，EPRS在T2DM 尿液中的含量降低，这表明EPRS通过GAIT途径抑制炎症相关蛋白质翻译的功能下调，因此 可能导致了炎症相关蛋白质在T2DM体内积累，促进炎症反应，与氧化应激共同作用进一步 促进了糖尿病的发生发展。
[0005] 为了 了解疾病进展，及时治疗并发症，2型糖尿病患者需要监测血糖控制情况。在 现有的临床检查中，采集末梢血或静脉血作为血糖监测的最佳标本，但血液标本的获取有 仓|J，乳糜血或溶血会影响血糖检测的准确性，并且频繁采血会对患者造成心理负担，尤其是 老年人和肥胖人群。因此，如果能建立一种对2型糖尿病患者进行筛查、监测的无创性检查 方法，对2型糖尿病的早期筛查、诊断、预防及治疗均具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶（Bifunctional aminoacyl-tRNA synthetase，EPRS)在制备用于诊断或检测2型糖尿病的制剂中的应用。
[0007] 优选地，所述尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所 /_J、1 〇
[0008] 优选地，所述制剂为2型糖尿病患者尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶检测试剂 盒。所述试剂盒包括盒体以及设置在盒体内的酶标板和试剂。
[0009] 优选地，所述酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组 成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
[0010] 优选地，每个反应孔预包被兔抗人EPRS多克隆抗体。
[0011] 优选地，所述试剂为EPRS标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、显色液A、显色液B、 终止液和浓缩洗涤液。
[0012] 优选地，所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下凹瓶位以及自封袋。
[0013] 优选地，所述下凹瓶位共13个，由塑料泡沫制成。
[0014] 优选地，所述酶标板由聚苯乙烯制成。
[0015] 发明人首先收集了无并发症及其他合并症的2型糖尿病患者和正常对照的 随机尿液标本，尚心后取上清，利用弱阳尚子交换磁珠纯化和分尚尿液标本。将1 μ 1 标本与10 μ 1基质（0.3%的α-氰基-4-羟基肉桂酸，HCCA)混匀后，取Ιμ?点在 Anchorchip (Autoflex MALDI TOF，Bruker-Dalton)祀板上，标本离子化后进行质谱分析， 采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应 用ClinPr 〇T〇〇ls2. 1分析软件对2型糖尿病组和正常对照组的所有质谱图进行分析，筛 选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行基质辅助激光解吸电 离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-T0F-MS)鉴定，在 International Protein Index (IPI human v3. 45fasta with71983entries)数据库检索得到2型糖尿病组与正常对照组间差异表 达的 EPRS(Bifunctional aminoacyl-tRNA synthetase,蛋白号：ΙΡΙ00013452· 9，m/z : 1963. 5)蛋白，并且与正常对照相比，EPRS蛋白在2型糖尿病患者的尿液中呈低表达。
[0016] 本发明通过研究证实与正常对照组相比，谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶（EPRS)在 2型糖尿病组患者的尿液中特异表达下调，从而提出检测尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶 可用于2型糖尿病的诊治。
[0017] 本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用随机尿 标本检测谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶。
[0018] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是2型糖尿病组和正常对照组所有标本的尿液多肽谱。红色（箭头1)代表 2型糖尿病组，绿色（箭头2)代表正常对照组，X轴表示m/z，y轴表示相对强度。
[0020] 图2和图3是EPRS在所有尿液标本中的表达。红色（箭头1)代表2型糖尿病组， 绿色（箭头2)代表正常对照组。
[0021] 图4和图5是EPRS在正常对照和2型糖尿病组中的平均峰面积。红色（箭头1) 代表2型糖尿病组，绿色（箭头2)代表正常对照组。
[0022] 图6是EPRS蛋白的质谱图。
[0023] 图7是设置在本发明所述的试剂盒的盒体内的酶标板的示意图，其中1为酶标反 应微孔条，2为酶标板的外框支撑架，3为包被有EPRS融合蛋白多克隆抗体的孔。
[0024] 图8是Western Blot检测EPRS在正常对照和糖尿病患者尿液中的表达结果。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1尿液标本的收集与处理
[0026] 收集无并发症及其他合并症的病史5年以上的2型糖尿病患者28例（首都医科大 学附属北京世纪坛医院内分泌门诊）随机清洁中段尿液标本，2h内离心（1500rpm，5min)， 保留上清。分装后-80°C冰箱冻存。正常对照组为29例正常人（首都医科大学附属北京世 纪坛医院体检中心）。具体请参照下表1 :
[0027] 表1 :2型糖尿病组和正常对照组的临床资料
[0028]
【权利要求】
1. 尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶在制备用于诊断或检测2型糖尿病的制剂中的应 用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶的 氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为2型糖尿病患者尿液谷氨 酰-脯氨酰tRNA合成酶检测试剂盒。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括盒体以及设置在盒体内 的酶标板和试剂。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酶标板由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，每个反应孔预包被兔抗人EPRS多克隆抗 体。
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为EPRS标准品溶液、酶标二抗、 抗体浓缩液、显色液A、显色液B、终止液和浓缩洗涤液。
8. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下 凹瓶位以及自封袋。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述下凹瓶位共13个，由塑料泡沫制成。
10. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶标板由聚苯乙烯制成。
【文档编号】G01N33/66GK104297486SQ201310300524
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】张曼, 初丽娜, 雷婷 申请人:张曼