专利名称：异肽间隙连接调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及能调节胞内间隙连接通讯的异肽。本发明进一步涉及利用该异肽维持或增强所述通讯的方法。
背景技术：
已对细胞间的通讯对细胞内环境的稳定、增殖和分化必不可少有了提高的认识。这种通讯被认为通过间隙连接得以促进。这些结构被认为是用于结合细胞并且允许″相互对话″(cross-talk)的路径。通常参见，Sperelakis，N.，(1989)Cell Interactions and Gap Junctions by N.Sperelakis，William C.Cole(Editor)。
对了解间隙连接的结构和功能做了很多努力。例如，已报道这种连接为相邻的细胞间形成的一种复合物。大多数间隙连接被认为是由聚集通道组成，其将相邻细胞的内部(胞质)直接连通。成年哺乳动物中，在除循环的血液成分外的大多数细胞类型中发现了间隙连接。
更具体地说，确认间隙连接为具有数百至数千密集组装的间隙连接通道(包括两个半通道或连接蛋白)簇的细胞膜的专门区域。许多被认为直接连接两个相邻细胞的胞质区室。间隙连接通道可在打开和关闭状态转换。在打开状态离子和小分子被认为通过间隙连接通道的孔。电脉冲的传导和信号分子的细胞间扩散穿过间隙连接而发生。
间隙连接间的″相互对话″已被称作间隙连接胞内通讯(GJIC)。其被认为在细胞的代谢、增殖、细胞-至-细胞的信号传导和组织完整性中起重要作用。
例如，GJIC被认为提供细胞间的养分、离子和液体的快速平衡。间隙连接还被认为在电应激细胞中用作电突触。在许多组织中，电结合被认为提供比化学突触更快速的细胞-至-细胞传输动作电位。例如在心肌细胞和平滑肌细胞中，此被认为帮助同步收缩。
已报道通过GJIC介导的其他功能。例如，GJIC被认为增强组织对外界刺激的应答。通常认为第二信使足以小到可以通过连接通道从激素活化的细胞达到休眠细胞并且激活后者。
另外，已报道间隙连接可提供用于化学和/或电发育信号的细胞间途径并且参与限定发育区室的边界。已公开GJIC在胚胎细胞中以特定的模式存在并且GJIC的损伤与发育异常和许多化学试剂的致畸效应相关。此外，GJIC被认为协助细胞活性的协调。
一些报道已建立了GJIC的异常和体外和体内大量疾病状态间的联系。例如，认为连接蛋自的异常和心脏病间存在联系。心脏中Cx43表达和分布的若干研究描述了Cx43表达的降低程度和该间隙连接蛋白分布的变化模式。参见Kaprielian，R.R.，等.(1998)Circulation 97651-660；和Saffitz，J.E.，等.，(1999)Cardiovasc Res.42309-317。
因此，在间隙连接的失常或缺乏与心律不齐提高的风险之间的关系方面有着公认。认为在改变的连接蛋白表达/分布和慢性心脏病之间存在更进一步的关系。
对许多抗心率失常肽积极影响GJIC，而常常不影响动作电位的时间或形状有了提高的认识。此外，许多所述肽被认为缺乏不良的前心律失常副作用。这种结果被认为限制了许多现行抗心律失常药的使用。此外，AAP以及某些AAP衍生物，被认为具有一些不想要的特征，例如低的稳定性和达到治疗效力前高剂量的需求。
拥有有效的GJIC异肽调节剂将是合乎需要的。本发明公开了这种异肽。
发明概述本发明涉及调节间隙连接细胞间通讯(GJIC)的异肽。本发明具有宽范围的有效用途，包括用于和受损的GJIC有关的病状的治疗或预防。
本发明的优选异肽由下列通式(I)表示 其中，如果a为1则b为0；如果a为0则b为1；x和y分别为1-7；R1为H或CH3，优选H。
R2为如下的任一氨基酸的侧链例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和肌氨酸。优选R2为丙氨酸或甘氨酸的侧链。优选，当a为0且b为1时R2为氨基酸甘氨酸的侧链，或当a为1且b为0时为丙氨酸的侧链；R3选自H、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、RO、RS、RSO、RSO2、COR、CSR、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、OCOR、SCOR(R＝烷基、烯基、芳基、芳烷基、环烷基等等)。优选R3为H或NH2；并且R4和R5独立地包括疏水基团，并且优选包括芳烃碳环，更优选包括6-或12-元芳烃碳环。在一个方面，芳环由至少一种如下所述的基团所取代低级烷基、烷氧基、羟基、羧基、胺、硫醇、酰肼、酰胺、卤化物、羟基、醚、胺、腈、亚胺、硝基、硫化物、亚砜、砜、硫醇、醛、酮、羧基、酯、酰胺基；包括其硒和硫的衍生物。任选的取代环还包括硫化物、亚砜、砜和有或没有硒基的硫醇衍生物。优选，芳环由至少一种如下基团所取代低级的烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基。更优选，芳环由烷氧基或硝基的至少一种所取代。低级的烷基优选为甲基。烷氧基优选为甲氧基。卤化物基团优选为氯化物或氟化物基团。腈基优选为氰基。在其中芳烃碳环被取代的实施方案中，所述取代通常数目小于约10处取代，更优选取代数目约为1至5，或1至2。
芳烃碳环可选自苯甲基、苯基和萘基，并且优选为苯甲基。
优选，R4和R5独立地包括由低级烷基、烷氧基、卤化物、腈或硝基的至少一种所取代的苯甲基。更优选，R4和R5独立地包括由硝基或烷氧基的至少一种所取代的苯甲基。低级烷基优选为甲基，烷氧基优选为甲氧基，卤化物基团优选为氯化物或氟化物基团，并且腈基优选为氰基。
本发明的异肽可由通式I表示，其中R1为H，R2为氨基酸丙氨酸或甘氨酸的侧链，R3为H或NH2，并且R4和R5包括由硝基或甲氧基的至少一种所取代的苯甲基。
优选，当R2为氨基酸甘氨酸的侧链时，a为0，b为1并且R1为H。
优选，当R2为氨基酸丙氨酸的侧链时，a为1，b为0并且R1为H。
优选，当a为0并且b为1时，y为4并且R1为H。更优选，当a为0并且b为1时，y为4，R1为H并且R5包括苯甲基。优选，当a为1并且b为0时，x为1或2并且R1为H。更优选，当a为1并且b为0时，x为1或2，R1为H并且R4包括苯甲基。
当R2为氨基酸甘氨酸的侧链并且a为0，b为1时，优选y为4并且R1为H。
当R2为氨基酸丙氨酸的侧链并且a为1，b为0时，优选x为1或2并且R1为H。
优选的异肽可由通式I表示，其中R1为H；当a为0，b为1并且y为4时R2为氨基酸甘氨酸的侧链，或当a为1，b为0并且x为1或2时为丙氨酸的侧链；R3为H或NH2；并且R4和R5包括苯甲基。此外，苯甲基优选由硝基或甲氧基所取代。
所述异肽还可包括烷基化的或另外经修饰以稳定异肽防止酶促降解的肽键和/或可包括D-氨基酸、氨基酸异构型或D-和氨基酸异构型的组合。
在另一个实施方案中，本发明涉及由下列通式(II)表示的更具体的异肽
其中，如果a＝1则b＝0；如果a＝0则b＝1；x和y独立地＝1-7；z＝1-6；q＝0-6；p＝0-1R1＝H或CH3，优选H。
R2＝如下所述任一氨基酸的侧链例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和肌氨酸。优选R2为丙氨酸或甘氨酸的侧链。优选，当a为0且b为1时R2为氨基酸甘氨酸的侧链，或当a为1且b为0时为丙氨酸的侧链；R3选自H、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、RO、RS、RSO、RSO2、COR、CSR、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、OCOR和SCOR，其中R＝烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。优选R3为H或NH2；并且R6和R7独立地选自H、烷基、烯基、芳基、芳烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硫烷氧基、硫代芳氧基、硫代芳烷氧基、+S(CH3)2、SO3H、SO2R、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CH2OH、NCO、NCOR、NHOH、NHNH2、NHNRH、CH2OCOR、CH2OCSR、COR、CSR、CSOR、CF3和CCl3，并且其中R为烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。优选，R6和R7独立地选自H、烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、CF3。更优选，R6和R7独立地选自H、NO2和烷氧基。烷基优选为甲基，卤素优选为氯或氟并且烷氧基优选为甲氧基。
本发明的异肽可由通式II表示，其中R1为H，为氨基酸丙氨酸或甘氨酸的侧链，R3为H或NH2，并且R6和R7独立地选自H、NO2和甲氧基。
优选，当R2为氨基酸甘氨酸的侧链时，a为0，b为1并且R1为H。
优选，当R2为氨基酸丙氨酸的侧链时，a为1，b为0并且R1为H。
优选，当a为0并且b为1时，y为4并且R1为H。更优选，当a为0并且b为1时，y为4，p为1，q为0并且R1为H。优选，当a为0并且b为0时，x为1或2并且R1为H。更优选，当a为1并且b为0时，x为1或2，z为1并且R1为H。
当R2为氨基酸甘氨酸的侧链并且a为0，b为1时，优选y为4并且R1为H。
当R2为氨基酸丙氨酸的侧链并且a为1，b为0时，优选x为1或2并且R1为H。
优选异肽可由通式II表示，其中R1为H；当a为0，b为1并且y为4，p为1，q为0时R2为氨基酸甘氨酸的侧链，或当a为1，b为0并且x为1或2，z为1时为丙氨酸的侧链；R3为H或NH2。此外，R6和R7独立地选自H、NO2和甲氧基。
芳烃碳环优选包括在4-位的取代基。该取代基可以是此处所列的任何基团，如其一种可以是芳环的取代基。优选，该取代基选自低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基。优选该取代基为硝基或烷氧基。烷氧基优选为甲氧基。通式II中，当R6或R7为H时，R7或R6分别可为硝基或甲氧基。
本发明的异肽可由通式II表示。本发明的异肽可具有通式
H-第一个氨基酸部分-第二个氨基酸部分-OH。
″氨基酸部分″定义为包括氨基酸的部分。氨基酸可以为任一氨基酸例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和肌氨酸。所述部分可此外包括另外的化学基或基团，例如疏水基团、例如芳烃碳环、例如6-元芳烃碳环。定义内包括的为不包括任一另外的化学基团的部分，使得其由氨基酸组成，即该氨基酸部分仅包括氨基酸，没有另外的化学基团的加入。
氨基酸部分可包括选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、丙氨酸和肌氨酸的氨基酸。氨基酸部分可包括选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和丙氨酸的氨基酸。氨基酸部分可选自甘氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丙氨酸。
第一个氨基酸部分可包括选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的氨基酸。第二个氨基酸部分可选自赖氨酸、丙氨酸和肌氨酸。优选，第一个氨基酸部分的氨基酸为甘氨酸或谷氨酰胺。优选，第二个氨基酸部分的氨基酸为赖氨酸或丙氨酸。
包括氨基酸的第一个或第二个氨基酸部分可另外包括疏水基团，例如芳烃碳环、例如6-或12-元芳烃碳环。芳环可选自苯甲基、苯甲酰基、苯基或萘基。优选，芳环为苯甲基或苯甲酰基。优选，第一个氨基酸部分或第二个氨基酸部分包括芳环。其中第一个氨基酸部分包括芳环，则芳环优选为苯甲基。其中第二个氨基酸部分包括芳环，则芳环优选为苯甲酰基。
芳环可由至少一种如下基团所取代低级烷基、烷氧基、羟基、羧基、胺、硫醇、酰肼、酰胺、卤化物、羟基、醚、胺、腈、亚胺、硝基、硫化物、亚砜、砜、硫醇、醛、酮、羧基、酯、酰胺基；包括其硒和硫的衍生物。任选的取代环还包括硫化物、亚砜、砜和有或没有硒基的硫醇衍生物。优选，芳环可由低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基的至少一种所取代，或可以是未被取代的。更优选，芳环由硝基和烷氧基的至少一种所取代。低级的烷基优选为甲基。烷氧基优选为甲氧基。卤化物基团优选为氯化物或氟化物基团。腈基优选为氰基。
芳环可由至少一种如下基团所取代H、烷基、烯基、芳基、芳烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硫烷氧基、硫代芳氧基、硫代芳烷氧基、+S(CH3)2、SO3H、SO2R、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CH2OH、NCO、NCOR、NHOH、NHNH2、NHNRH、CH2OCOR、CH2OCSR、COR、CSR、CSOR、CF3和CCl3，并且其中R为烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。优选，芳环可由至少一种如下基团所取代烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基和CF3，或可以是未被取代的。更优选，芳环由至少一种如下基团所取代NO2和烷氧基。烷基优选为甲基，卤素优选为氯或氟并且烷氧基优选为甲氧基。优选，芳环可由至少一种如下基团所取代甲基、氯、氟、三氟甲基、氰基、硝基和甲氧基，或可以是未被取代的。更优选，芳环由硝基和甲氧基的至少一种所取代。
优选，芳环在4-位被取代。
所述异肽还可包括烷基化的或另外经修饰以稳定异肽防止酶促降解的肽键和/或可包括D-氨基酸、氨基酸异构型或D-氨基酸和氨基酸异构型的组合。
第一个氨基酸部分可包括甘氨酸或可包括谷氨酰胺和芳环。第二个氨基酸部分可包括丙氨酸或可包括赖氨酸和芳环。优选，第一个氨基酸部分可包括甘氨酸或可包括谷氨酰胺和芳环，而第二个氨基酸部分可包括丙氨酸或可包括赖氨酸和芳环。更优选，第一个氨基酸部分可包括甘氨酸并且第二个氨基酸部分可包括赖氨酸和芳环，或第一个氨基酸部分可包括谷氨酰胺和芳环并且第二个氨基酸部分可包括丙氨酸。
其中第一个氨基酸部分包括芳环时，芳环优选由硝基或甲氧基，更优选甲氧基所取代。其中第二个氨基酸部分包括芳环时，芳环优选由硝基或甲氧基所取代。
本发明的异肽具有多种重要的用途和优点。
例如，本异肽可用于预防或治疗与受损的间隙连接功能有关的病症，所述受损的间隙连接功能产生减少的细胞间通讯或错误调控的细胞通讯。在一个方面，本发明提供了向具有、或处于发展为所述病症的风险中的个体给予治疗有效量的上述任何异肽的方法。优选，口服给药。在一个优选的方面，个体为人。优选，异肽选自表2中所示的异肽。
可治疗的病症的实例包括，但不限于心血管疾病、气管表皮炎症、肺泡组织的病症、膀胱失禁、由于耳蜗疾病而受损的听力、内皮损伤、糖尿病性视网膜病和糖尿病性神经病变、中枢神经系统和脊髓的局部缺血、包含牙周病的牙组织病症、肾脏疾病、骨髓移植的失败、创伤、勃起障碍、膀胱失禁、神经性疼痛、亚慢性和慢性炎症、癌症和骨髓和干细胞移植的失败、在细胞和组织移植期间或在医疗操作例如手术期间产生的病症；以及由活性氧类和/或自由基和/或氧化氮的过量引起的病症。
本发明另外提供适用于上述方法中的药物组合物，包括任一上述异肽和可药用的载体。优选，载体为无菌的、无热原的和无病毒的。此外，本发明涉及本异肽在制备用于上述医疗适应症治疗的药物中的应用。优选，异肽选自表2中所示的异肽。
附图简述
图1A+1B显示了用于产生通式(I)异肽的典型的合成方案。
图2A+B显示了用于产生通式(II)异肽的典型的合成方案。
发明详述如所讨论的，本发明涉及调节间隙连接细胞通讯(GJIC)的异肽。本发明具有宽范围的有效用途，包括用于和受损的GJIC有关的病状的治疗或预防。尤其是，本发明的异肽由以上通式I表示。
本发明更具体的异肽由下列通式II表示 其中，如果a＝1则b＝0；如果a＝0则b＝1；x和y独立地＝1-7；z＝1-6；q＝0-6；p＝0-1R1＝H或CH3，优选H。
R2＝如下所述任一氨基酸的侧链例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和肌氨酸。优选R2为丙氨酸或甘氨酸的侧链。优选，当a为0和b为1时R2为氨基酸甘氨酸的侧链，或当a为1和b为0时为丙氨酸的侧链；R3选自H、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、RO、RS、RSO、RSO2、COR、CSR、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、OCOR和SCOR，其中R＝烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。优选R3为H或NH2；并且R6和R7独立地选自H、烷基、烯基、芳基、芳烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硫烷氧基、硫代芳氧基、硫代芳烷氧基、+S(CH3)2、SO3H、SO2R、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CH2OH、NCO、NCOR、NHOH、NHNH2、NHNRH、CH2OCOR、CH2OCSR、COR、CSR、CSOR、CF3和CCl3，并且其中R为烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。优选，R6和R7独立地选自H、烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、CF3。更优选，R6和R7独立地选自H、NO2和烷氧基。烷基优选为甲基，卤素优选为氯或氟并且烷氧基优选为甲氧基。
本发明的异肽可由通式II表示，其中R1为H，R2为氨基酸丙氨酸或甘氨酸的侧链，R3为H或NH2，并且R6和R7独立地选自H、NO2和甲氧基。
优选，当R2为氨基酸甘氨酸的侧链时，a为0，b为1并且R1为H。
优选，当R2为氨基酸丙氨酸的侧链时，a为1，b为0并且R1为H。
优选，当a为0并且b为1时，y为4并且R1为H。更优选，当a为0并且b为1时，y为4，p为1，q为0并且R1为H。优选，当a为1并且b为0时，x为1或2并且R1为H。更优选，当a为1并且b为0时，x为1或2，z为1并且R1为H。
当R2为氨基酸甘氨酸的侧链并且a为0，b为1时，优选y为4并且R1为H。
当R2为氨基酸丙氨酸的侧链并且a为1，b为0时，优选x为1或2并且R1为H。
优选异肽可由通式II表示，其中R1为H；当a为0，b为1并且y为4，p为1，q为0时R2为氨基酸甘氨酸的侧链，或当a为1，b为0并且x为1或2，z为1时为丙氨酸的侧链；R3为H或NH2。此外，R6和R7独立地选自H、NO2和甲氧基。
芳烃碳环优选包括在4-位的取代基。该取代基可以是此处所列的任一基团，如其一种可以是芳环的取代基。优选，该取代基选自低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基。优选该取代基为硝基或烷氧基。烷氧基优选为甲氧基。通式II中，当R6或R7为H时，R7或R6分别可为硝基或甲氧基。
特别优选的本发明的异肽可由通式II表示，其中R1为H；R2为氨基酸甘氨酸的侧链；a为0，b为1并且y为4，p为1，q为0；R3为H或NH2；以及R6或R7为H并且R7或R6分别为硝基或甲氧基。特别优选的本发明的异肽可由通式II表示，其中R1为H；R2为氨基酸丙氨酸的侧链；a为1，b为0并且x为1或2，z为1；R3为H或NH2；以及R6或R7为H并且R7或R6分别为甲氧基。
本发明的异肽可由通式II表示。本发明的异肽可具有以下的通式结构H-第一个氨基酸部分-第二个氨基酸部分-OH。
″氨基酸部分″定义为包括氨基酸的部分。氨基酸可以为如下所述的任一氨基酸例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和肌氨酸。所述部分可此外包括另外的化学基或基团，例如疏水基团、例如芳烃碳环、例如6-或12-元芳烃碳环。定义内包括的为不包括任一另外的化学基团的部分，使得其由氨基酸组成，即该氨基酸部分只包括氨基酸，没有另外的化学基团的加入。
氨基酸部分可包括选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、丙氨酸和肌氨酸的氨基酸。氨基酸部分可包括选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和丙氨酸的氨基酸。氨基酸部分可选自甘氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丙氨酸。
第一个氨基酸部分可包括选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的氨基酸。第二个氨基酸部分可选自赖氨酸、丙氨酸和肌氨酸。优选，第一个氨基酸部分的氨基酸为甘氨酸或谷氨酰胺。优选，第二个氨基酸部分的氨基酸为赖氨酸或丙氨酸。
包括氨基酸的第一个或第二个氨基酸部分可另外包括疏水基团，例如芳烃碳环、例如6-或12-元芳烃碳环。芳环可选自苯甲基、苯甲酰基、苯基或萘基。优选，芳环为苯甲基或苯甲酰基。优选，第一个氨基酸部分或第二个氨基酸部分包括芳环。当第一个氨基酸部分包括芳环时，则芳环优选为苯甲基。当第二个氨基酸部分包括芳环时，则芳环优选为苯甲酰基。
芳环可由至少一种如下基团所替代低级烷基、烷氧基、羟基、羧基、胺、硫醇、酰肼、酰胺、卤化物、羟基、醚、胺、腈、亚胺、硝基、硫化物、亚砜、砜、硫醇、醛、酮、羧基、酯、酰胺基；包括其硒和硫的衍生物。任选的取代环还包括硫化物、亚砜、砜和有或没有硒基的硫醇衍生物。优选，芳环可由低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基的至少一种所取代，或可以是未被取代的。更优选，芳环由硝基和烷氧基的至少一种所取代。低级烷基优选为甲基。烷氧基优选为甲氧基。卤化物基团优选为氯化物或氟化物基团。腈基优选为氰基。
芳环可由至少一种如下基团所取代H、烷基、烯基、芳基、芳烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硫烷氧基、硫代芳氧基、硫代芳烷氧基、+S(CH3)2、SO3H、SO2R、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CH2OH、NCO、NCOR、NHOH、NHNH2、NHNRH、CH2OCOR、CH2OCSR、COR、CSR、CSOR、CF3和CCl3，并且其中R为烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。优选，芳环可由至少一种如下基团所取代烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基和CF3，或可以是未被取代的。更优选，芳环由至少一种如下基团所取代NO2和烷氧基。烷基优选为甲基，卤素优选为氯或氟并且烷氧基优选为甲氧基。优选，芳环可由至少一种如下基团所取代甲基、氯、氟、三氟甲基、氰基、硝基和甲氧基，或可以是未被取代的。更优选，芳环由硝基和甲氧基的至少一种所取代。
优选，芳环在4-位被取代。
所述异肽还可包括烷基化的或另外经修饰以稳定异肽防止酶促降解的肽键和/或可包括D-氨基酸、氨基酸异构型或D-氨基酸和氨基酸异构型的组合。
第一个氨基酸部分可包括甘氨酸，或可包括谷氨酰胺和芳环。第二个氨基酸部分可包括丙氨酸，或可包括赖氨酸和芳环。优选，第一个氨基酸部分包括甘氨酸，或包括谷氨酰胺和芳环，而第二个氨基酸部分包括丙氨酸，或包括赖氨酸和芳环。更优选，第一个氨基酸部分包括甘氨酸并且第二个氨基酸部分包括赖氨酸和芳环，或第一个氨基酸部分包括谷氨酰胺和芳环并且第二个氨基酸部分包括丙氨酸。
第一个氨基酸部分包括芳环时，芳环优选由硝基或甲氧基，更优选甲氧基所取代。第二个氨基酸部分包括芳环时，芳环优选由硝基或甲氧基所取代。
优选的异肽可由如下通式所示H-第一个氨基酸部分-第二个氨基酸部分-OH，其中第一个氨基酸部分包括选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的氨基酸；第二个氨基酸部分包括选自赖氨酸、丙氨酸和肌氨酸的氨基酸；第一个或第二个氨基酸部分包括6-元芳烃碳环。优选，第一个氨基酸部分可包括氨基酸甘氨酸或谷氨酰胺并且第二个氨基酸部分可包括氨基酸赖氨酸或丙氨酸。
第一个氨基酸部分包括芳烃碳环时，则氨基酸优选为谷氨酰胺。优选，第二个氨基酸部分包括氨基酸丙氨酸。当第二个氨基酸部分包括芳烃碳环时，则氨基酸优选为赖氨酸。优选，第一个氨基酸部分包括氨基酸甘氨酸。优选芳烃碳环为苯甲基或苯甲酰基基团。优选芳环由低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基的至少一种取代，更优选由烷氧基和硝基的至少一种所取代。优选，芳烃碳环在4-位被取代。
本发明的异肽具有多种重要的用途和优点。此处所述用于本发明的方法、用途和组合物的特别优选的异肽为表2中所示的那些。
如所讨论的，异肽可包含游离的N-末端，或游离的C-末端，或两者。本发明范围内的异肽此处常表示为具有游离的N-末端和/或C-末端基团。对于一些发明用途，这些基团可维持游离的。然而，在另外的实施方案中，异肽可以封闭的C-末端基团和游离的N-基团为特征。或者，这种异肽可具有封闭的N-基团和游离的C-末端基团，或封闭的N-和C-末端基团。
本发明范围内的并且具有通式II以及具有通式H-第一个氨基酸部分-第二个氨基酸部分-OH结构的更具体的异肽显示在表1中。本发明的并且具有通式II以及具有通式H-第一个氨基酸部分-第二个氨基酸部分-OH结构的特别优选的异肽显示在表2中。
表1
本发明更具体的异肽促进和/或维持由间隙连接介导的细胞间通讯。在一个方面，异肽为抗心率失常异肽，其靶向由AAP、AAP10、HP5和/或其功能类似物靶向的相同的细胞，即异肽能通过激动或拮抗AAP、AAP10、HP5和/或其功能类似物的功能而调节这些细胞的功能。与本异肽相比，本说明书中已知AAP的提及将被看作间隙连接调节化合物的一种实例。然而，本发明的范围不限于具有AAP激动或拮抗特性的异肽。
本发明还涉及用于与减弱的细胞间间隙连接通讯有关的病状治疗的药物组合物的制备和用途以及用于使用这些组合物的方法。
此外本发明优选的异肽在一种或多种下列测定法中显示良好的活性。虽然无需鉴定由以上通式I和II表示的适合口服的异肽，其可用于进一步证实和选择性地定量异肽的一种或其库的活性。
因此，在一个实施方案中，另外优选的异肽在此处所指的″标准AAP位点结合试验″中呈现结合，优选特异性结合至组织、细胞或细胞组分。该试验可检测和选择性地定量受试肽的结合，例如AAP、AAP10、HP5或其功能类似物。在一个优选实施方案中，本发明的异肽为所述组织、细胞或细胞组分(即，异肽激动或拮抗抗心率失常肽的功能)的功能调节剂。在另一个实施方案中，异肽为针对抗心率失常肽的受体调节剂(即，异肽为该受体的激动剂或拮抗剂)。
另外优选的以上通式I和II的异肽作为间隙连接通讯的调节剂(例如，作为AAP的激动剂或拮抗剂)显示良好的功能。在一个方面，异肽作为抗心律失常药物起作用。
本发明优选的激动剂异肽提供了胞内电导(Gj)，其在此处所指的″标准心肌细胞测定法″中基本上与AAP的Gj相同，更高。优选的拮抗剂异肽提供了低于AAP的Gj的Gj(例如，低于至少约10％，或至少约20％)和/或阻断了AAP正常化缺血性细胞Gj的能力，即恢复Gj至与非缺血性细胞中发现的基本相同的值。
另外本发明优选的异肽在此处所指的″标准钙-诱导心律不齐测定法″中提高了输注CaCl2后小鼠体内AV阻断的时间。优选，异肽提供了至少50％的AAP活性，优选至少约70％的AAP活性，更优选基本相同的AAP活性(即，显示近乎相同的持续时间的时间延迟)。
本发明的异肽在此处所指的″标准心室再发测定法″中可另外显示再发心律失常的发生率或所观测到的梗塞区域大小的降低。优选，在该测定法中异肽提供了至少50％的AAP活性，优选至少约70％的AAP活性，更优选基本相同的AAP活性(即，提供了类似的发生率的降低或类似或较小大小的梗塞区域)。
曾试图通过增强与称作PepT1的肠肽运输蛋白质的接触而改进某些化合物的口服有效性。关于PepT1运输系统已了解很多。参见Bailey，P.D.，等.(2000)Angew.Chem.Int.Ed.39506；和其中引用的参考文献。在本发明的一个方面中，可检验本异肽潜在的口服有效性。用以证实上述预示的栅(Bailey)测定法的一种实验测定法为″标准的体内口服有效性测定法″。该测定法中，异肽口服给药至哺乳动物并且随时间采血样。利用标准的蛋白质定量测定法例如LC/MS/MS在不同的时间间隔测定异肽的浓度以利用本领域已知的常规方法来计算来自血浆蛋白质浓度对比时间的曲线图的曲线下面积(AUC)。优选，不同剂量的异肽平行给药至多个动物以确定在最高的血浆浓度和AUC值中显示剂量-相对增长的那些异肽。作为对照，相同浓度的异肽可静脉内给药并且比较口服给药所获得的AUC下面积与静脉内给药所获得的AUC。参见，例如Milo Gibal(1991)Biopharmaceutics and Pharmacology，4thedition(Lea和Sediger)。具有良好口服有效性的异肽为给药后小于约30分钟内血浆中即可观察到异肽的异肽。
根据上述标准的体内口服有效性测定法，显示良好口服有效性的异肽可能或未必和Bailey测定法的基本一致。然而对于那些不显示上述一致性的异肽(以及对于那些显示的)，如通过标准的体内口服有效性测定法测定的，在口服后小于约30分钟内将在血浆中观察到该异肽。
hPepT1结合测定法可作为对随后用于标准的体内口服有效性测定法中筛选的异肽的初步筛选而进行，和/或可进行以证实标准的体内口服有效性测定法的结果；然而，标准的体内口服有效性测定法提供了异肽口服有效性最有意义的试验。
如以上通式I和II所示的另外优选的异肽在此处所指的″体外血浆稳定性测定法″或有关表达方式中呈现良好的半衰期。这种异肽可以与上述PepT1底物模板模型(Bailey测定法)基本一致。然而，对于一些异肽可能与该模型几乎不或不一致。在一个实施方案中，测定法中显示良好稳定性的异肽具有超过约48小时，如超过24小时，例如超过12小时，如超过6小时，例如超过3小时，如超过1小时，例如超过30分钟，如超过20分钟，例如超过15分钟，如超过10分钟，例如超过5分钟，如超过1分钟的半衰期。该实施方案中，本发明的异肽在血流中可显示增强的稳定性。
骨质疏松症已知GJIC在骨形成中是重要的。另外优选的异肽在此处所指的″标准成骨细胞活性测定法″中此外或另外提高成骨细胞的活性，其测定异肽存在时钙波的形成和/或成骨细胞细胞的碱性磷酸酶活性。优选，所述异肽提高钙波的活性，表现为涉及波的细胞数目的增加(如通过利用钙敏感的荧光染料，如fura-2并且计数发荧光的细胞数目而测定胞内Ca2+水平所测定的那样)。利用标准的比色测定法，碱性磷酸酶活性还可用于提供成骨细胞活性的测定。在所述测定法中本发明的激动剂异肽提供至少约10％的AAP活性，如至少约20％的活性，例如至少约30％的活性，如至少约40％的活性，例如至少约50％的AAP活性，优选至少约70％的活性，并且更优选100％或更大活性的AAP活性。
癌症本发明优选的异肽在此处所指的″标准的肿瘤促进剂测定法″中另外或此外降低由肿瘤促进剂如DTT介导的GJIC抑制。优选，异肽显示GJIC抑制的降低，相比对于AAP所观测到的降低，为至少50％，优选70％，且更优选100％或更大。
如所讨论的，本发明的一个目的为提供调节间隙连接细胞通讯(GJIC)的异肽。因此，本发明的许多异肽可包含一种或多种下列特征减少细胞分开、正常化动作电位持续时间的扩散和正常化传导速率的能力，控制正常化(根据所需上调或下调)连接蛋白表达的间隙连接的细胞量；正常化间隙连接的降解(抑制或提高)；正常化连接蛋白的细胞运输至质膜(增加或减少)；促进连接蛋白组装进入功能性的间隙连接；正常化现有间隙连接的打开的能力，例如，当其已关闭或通过抑制剂门控时(例如，如通过调节或增强一种或多种连接蛋白(例如，如Cx43)的胞质羧基末端结构域的过磷酸化作用)诱导或增强打开或当其异常打开时(例如，如在进行性腓骨肌萎缩(Charcot-Marie-Tooth disease)中那样)使之关闭。
本发明优选的异肽在此处所指的″标准的肿瘤促进剂测定法″中另外或此外降低由肿瘤促进剂如DTT介导的GJIC抑制。优选，异肽显示GJIC抑制的降低，相比对于AAP所观测到的降低，为至少50％，优选70％，且更优选100％或更大。
用于确定和选择性定量优选的本发明异肽活性的特定测定法如下所述。
A.标准的血浆稳定性测定法本发明还提供了具有体外或体内增强的稳定性的异肽。在一个方面，该肽包括烷基化或另外经修饰以稳定肽防止酶促降解的肽键。在另一个方面，该肽一种或多种D-氨基酸。在更进一步的方面，该肽在标准的稳定性测定法中具有增强的稳定性。
在一个方面，体外血浆稳定性测定法如2002年2月22日提交的PCT/US02/05773所述进行。
如PCT/US02/05773申请中所公开的，肽可在每隔一定间隔采集用于HPLC或LC/MS/MS分析的血浆或血清以及样品中温育，以定量未降解肽的量。评估用于该分析的合适的条件(柱、溶剂、梯度和温度)以确保肽峰和血浆峰不具有相同的保留时间。此通过连续的肽、血浆的注射以及肽和血浆的共同注射，随后为LC方法参数的优化直至获得满意的分离而完成。还可采集和评估以同样方式处理的无肽对照血浆样品。样品可包含，但不限于空白、合适浓度的肽(例如，0.1mg/mL)、无肽血浆、t＝0的一种或多种样品和每个固定时间间隔的一种或多种样品。优选，同时采集多个样品。样品浓度(mAU中的峰高或离子计数)可对时间作图并且设定为描述单指数式衰减的函数(例如，利用标准的Excel程序包)。优选，本发明的肽具有利用该测定法所测定的超过约48小时，如超过24小时，例如超过12小时，如超过6小时，例如超过3小时，如超过1小时，例如超过30分钟的半衰期。
可利用标准测定法在体内检验血浆稳定性。例如，异肽可通过以约1ml/kg i.v.和p.o.剂量的量弹丸注射而给药至哺乳动物，如大鼠。优选，异肽与对照样品如缓冲液或具有已知稳定性的抗心率失常肽同时检测。在不同的时间周期收集血样(例如，在B.D.5、15、30、60、90、120、180和240分钟，其中B.D.指给药前)。样品中异肽的量可利用本领域的常规方法定量，如LC/MS/MS。例如，血浆样品中异肽的浓度可根据覆盖1.00至1000nM肽范围的外标准曲线而计算。血浆浓度对比时间的数据可用于WinNonLin 3.5(Pharsight，Mountain view，CA)中利用非区隔分析的药物动力学模型并且可如本领域已知的那样测定所得到的AUC、Fpo、Clb、t1/2、Cmax和tmax的参数。
B.标准的口服有效性测定法本发明优选的一方面提供了具有体内增强的有效性的异肽。由于其经胃肠(GI)道中的酶或经肠细胞的胞内腔中的酶降解，口服给药后异肽的吸收常常很有限。此外，异肽的理化性质，尤其是其大的氢-键潜力使得这些分子难以经跨细胞的被动扩散渗透肠细胞。
因此本发明优选的异肽为对hPepT1转运蛋白或其类似物具有亲合力的异肽。结合PepT1转运蛋白的肽化合物的三维构象和关键结合部位由上述Bailey，P.D.，等.，2000所述，并且如上所述，所需的肽可定位于硅中以最优地适合该结合部位(参见，例如上述Bailey，P.D.，等.，(2000)，；Vinter，J.G.，(1996)J.Comput.Aided Des.10417)。
包括如通式I、通式II、表1所示或利用Bailey测定法通常所确定的肽的口服有效性可评估其结合PepT1转运蛋白优选hPepT1转运蛋白的能力。例如，PepT1 cDNA，优选hPepT1 cDNA(参见，例如Covitz，K.M.，等.，(1996)Pharm.Res.13(11)1631-34)可在蟾蜍卵母细胞表达系统中表达并且可如Temple，C.S.，等.(1996)J.Physio.(London)494795；Meredith，D.，等.，(1998)J.Physiol.(London)512629所述监测标记的肽进入卵母细胞的吸收达到近似Ki的值。
在本发明的一个方面，如上所述进行标准的体内有效性测定法以测定已塑造为最符合Bailey底物模板的异肽的口服有效性。该测定法中，异肽以口服给药的形式(例如，作为食物丸粒的一部分或者在水中)口服给药至哺乳动物，如大鼠，而同时，相同浓度的肽i.v给药(例如，通过插入股静脉和动脉的导管)。异肽可以以10-5-10-10浓度范围的1ml/kg体积的口服和i.v.剂量作为弹丸注射而给药。第一个血样采集5分钟之前动物i.v.给予500I.U.的肝素。对照血样，″给药之前″或B.D.样品，在异肽给药之前大约5分钟收集。保留剂量溶液的样本(例如，100μl包括10-5-10-10M肽的水)用于浓度测定。血样在t＝B.D.、5、15、30、60、90、120、180和240分钟时收集。
血液收集于贴标签的冰-冷却EDTA稳定血样的小管中并且储存于冰上直至在4℃快速离心5分钟(10,000xg)。收集血浆(100μl)，转入贴标签的聚丙烯微量离心管(例如，0.5ml的eppendorf)中，在冰上冷冻并且储存在-20℃直至进一步的分析。将大约40μl滤液注入HPLC柱上(XterraMS C18，3×50mm，3.5μm的颗粒)并且利用0至100％B的线性梯度在4.0分钟内洗脱。在下一个样本注入之前，柱在缓冲液B(乙腈中0.1％的甲酸或另外合适的缓冲液)中洗涤2.9分钟并且在缓冲液A(水中0.1％的甲酸或另外合适的缓冲液)中平衡5分钟。利用本领域常规方法以及如此外以下实施例1和2的所述进行质谱法。
血浆样品中化合物的浓度根据覆盖1.00至1000nM范围的外标准曲线计算。血浆浓度对比时间的数据利用非区隔分析用于WinNonLin3.5(Pharsight，Mountain view，CA)的药物动力学模型中并且如本领域已知的测定AUC值。优选，本发明口服有效的异肽在约30分钟或更少时间内在血浆中观察到显著的水平。接受肽i.v.给药的动物中观测到的AUC值用于评估如清除和半衰期的所述结果，其在两个系统中应该是相同的。
C.标准的心肌细胞测定法在一个方面，本发明的异肽给药至心脏细胞并且评估间隙连接的功能。在标准的心肌测定法中可确定用于所述方法的最适的异肽。在一个方面，根据Langendorf的方法从哺乳动物，如豚鼠的心脏通过用胶原酶灌注而分离心脏细胞。细胞暴露于异肽并且利用本领域已知的方法通过膜片钳评估GJIC。细胞间电导(Gj)使用如下通式计算Gj=ΔIpΔUj=Ip,pulse-Ip,restUp-Ua]]>
(公式1)其中Ip，pulse(脉冲)和Ip，rest(静置)分别表示脉冲期间和之前被动细胞中的电流，而Up和Ua表示被动和活动细胞的电压。Gj值依据异肽给药的变化通过比较Gj的相对变化而分析。例如，可测定用异肽刺激(例如，以约10-8M)之前和期间作为时间函数的相对Gj。优选，异肽提供Gj，其基本与抗心率失常肽如AAP、AAP10、HP5和其功能类似物的Gj相同(±10％)。在一个方面，细胞为缺血性细胞，并且异肽提供的Gj，其基本与非缺血性细胞的相同(±20％，优选，±10％)。
2002年2月22日提交的PCT/US02/05773提供了涉及进行心肌细胞测定法的另外的细节。
D.标准的钙-诱导的心律失常测定法适于给药至心脏细胞的异肽可在根据Lynch等.(1981)J Cardiovasc.Pharmacol.349-60模型的钙-诱导的心律失常体内模型中确定。小鼠(25-30g)用neurolept麻醉剂组合物麻醉并且i.v.插管插入尾部静脉中。通过将不锈钢ECG电极置于右前肢和左后肢而连续记录引导IIECG信号。接地电极置于右后肢。信号通过Hugo Sachs电子模型689 ECG模块放大(×5.000-10.000)并且过滤(0.1-150Hz)。模拟信号通过12比特的数据采集板(数据转换模型DT321)数字化并且在1000Hz利用用于Windows NT的Notocord HEM3.1软件采样。10-分钟的平衡时间后，肽的试验样品注射入尾部静脉。用缓冲液预处理的小鼠如未处理动物中对照水平的测定那样检测。所有试验中注射体积为100μl。
CaCl2的输液(30mg/ml，0.1ml/min～100mg/kg/min(氯化钙-2-水合物，Riedel-de Han，Germany))在药物或介质i.v.给药3分钟后开始。2nd程度AV-阻断开始的时间延迟测定作为CaCl2输液开始至第一个心律失常事件发生的时间。2nd程度AV-阻断的事件定义为由无伴随的QRS综合波的P波表征的AV传导的间歇障碍。
相对时间表示应答直至2nd程度的AV-阻断在赋形剂处理的小鼠中发生。测定化合物的(例如，异肽、AAP、AAP10或对照)的最大效果。优选，本发明的异肽相比化合物AAP、AAP10、HP5或其功能类似物具有抗心律失常药的活性，即，在CaCl2输液后的小鼠中肽提高了达到AV阻断的时间。优选，异肽提供至少约40％的AAP活性，例如至少约50％的AAP活性，如约60％的AAP活性，例如至少约70％的AAP活性，如至少约80％的AAP活性，例如至少约90％的AAP活性，例如至少约基本相同的AAP活性，如约110％的AAP活性，例如至少约120％的AAP活性，如至少约130％的AAP活性，例如至少约140％的AAP活性，如约150％的AAP活性，例如至少约160％的AAP活性，如至少约170％的AAP活性，例如至少约180％的AAP活性，优选至少约190％的AAP活性，更优选至少约200或更大％的AAP活性(即，肽显示大约相同于AAP诱导的持续时间的时间延迟)。
E.标准的成骨细胞活性测定法细胞间通讯的调节代表一种机理，成骨因子通过其调节造骨细胞的活性。因此，在一个方面，本发明的异肽用于通过提高骨细胞间的间隙连接通讯而提高成骨细胞的活性，由此增进体内的骨形成。
本发明异肽的效力可在人成骨细胞(hOB)中例如通过测定钙波活性和/或碱性磷酸酶活性而初步测定。
在一个方面，细胞分离自通过健康志愿者(年龄20-36)后髂棘的穿刺术而获得的人骨髓收集10-15ml骨髓材料于具有100U/ml肝素(Sigma，Cat.No.H-3149)的15ml PBS+Ca，Mg(Life Technologies，Cat.No.14040)中。骨髓的单核细胞组分通过在2200rpm离心30分钟用Lymphoprep梯度(Nycomed Pharma，Cat.No.1001967)分离。收集后，单核细胞组分用培养基洗涤一次并且在1800rpm离心10分钟。随后细胞计数并且以5×106细胞/100mm平皿接种于培养基中。hOB培养基(所有试剂获自Life Technologies)补充有10％热灭活胎牛血清(Cat.No.10106)和0.1％青霉素/链霉素(Cat.No.15140)的MEM w/o酚红w/Glutamax(Cat.No.041-93013)。随后的几天更换培养基并且细胞在每7天更换培养基、37℃下、5％CO2中培养。4-6周培养后，细胞达到70％的铺满培养。培养基随后用100nM地塞米松(Sigma，Cat.No.D-4902)补充7天。细胞随后接种用于视频成像实验使用之前25mm#1玻璃盖玻片置于35mm的平皿中(或6-孔多平皿的每个孔)，细胞以2.5×105细胞/盖玻片接种并且培养2-3天。ROS 17/2.8细胞在100mm的平皿中37℃、5％CO2培养并且每2-3天更换培养基。ROS培养基(所有试剂获自Life Technologies)MEM(Cat.No.31095)用10％热-灭活的小牛血清(Cat.No.16170)、1％NEAA(Cat.No.11140)、1％丙酮酸钠(Cat.No.11360)、1％L-谷氨酰胺(Cat.No.25030)和0.1％青霉素/链霉素(Cat.No.15140)补充。用于视频成像实验，使用之前细胞以2-3×105细胞/盖玻片接种于盖玻片上并且培养2-3天。
培养在盖玻片上的细胞用5μM的fura-2-AM(Molecular Probes，Cat.No.F-1221)37℃装载30分钟，并且在新鲜培养基中温育20分钟。在Zeiss Axiovert显微镜上，盖玻片随后附着于PDMI-2培养室(MedicalSystems Corp.)，用过冷的CO2维持在37℃。细胞间钙波通过利用附着于Eppendorf 5171显微操作器的硼硅酸玻璃微吸管的单细胞机械刺激而诱导。
利用MetaMorph成像系统(Universal Imaging)进行成像。通过单色仪(T.I.L.L.Photonics GmbH)提供激发光(340和380nm)。用增强型CCD摄像机(DageMTI)获得图像并且用Matrox MVP图像处理板数字化。肽存在和缺乏时参与钙波的细胞数目可用于提供GJIC增加的测定。
在一个方面，相比暴露于对照，如缓冲液的细胞，异肽的给药提高了参与波的细胞数目至少约两倍。在另一个方面，异肽的给药降低了参与波的细胞数目至少约两倍。在所述测定法中本发明的激动剂异肽提供至少约10％的AAP活性，如至少约20％的活性，例如至少约30％的活性，如至少约40％的活性，例如至少约50％的AAP活性，优选至少约70％的活性，并且更优选100％或更大活性的AAP活性。
细胞还可测定碱性磷酸酶活性的存在以提供成骨细胞活性的常规定量。在一个方面，细胞以200μl常规培养基中8000个细胞/孔(hOB)或3000个细胞/孔(ROS)的浓度接种于96-孔板。在第4天(或对于ROS细胞为第3天)，细胞用200μl MEM，0.1％BSA(Sigma，Cat.No.A-9418)洗涤。包括含有各种浓度的肽、对照、AAP或AAP10的合适的培养基(例如，200μl MEM，0.1％BSA)的样品添加至细胞，并且继续培养约4天(对于ROS细胞为2天)。
在约第8天(对于ROS细胞优选为第5天)，利用本领域已知的碱性磷酸酶(ALP)测定法测定细胞的碱性磷酸酶。ALP测定法通常为用于测定酶活性的比色终点方法，并且可利用碱性磷酸酶试剂盒(Sigma，Cat.No.104-LL)进行。优选，细胞用200μl PBS+Ca，Mg洗涤一次，100μl碱性缓冲液溶液添加至每个孔并且细胞在37℃温育10分钟。100μl底物溶液随后添加至每个孔并且在37℃温育板30分钟。将100μl2.0N的NaOH添加至每个孔以终止反应。利用板读数器在405nm测定吸光度。
本发明的激动剂异肽提供相对于等渗盐水至少约5％碱性磷酸酶产量的提高，优选，相对于等渗盐水至少约10％碱性磷酸酶产量的提高，并且更优选相对于等渗盐水15％或更高碱性磷酸酶产量的提高。碱性磷酸酶产量的提高为成骨细胞提高的活性的衡量并且因此为骨形成提高的衡量。
F.标准的肿瘤促进剂测定法化合物1，1-双(p-氯苯基)-2，2，2-三氯乙烷，亦称杀虫剂DDT，为间隙连接通讯的抑制剂，并且具有肿瘤促进的能力。其通过减少间隙连接数目和大小而抑制细胞-至-细胞的通讯，并且暴露于DDT与间隙连接蛋白Cx43磷酸化(有活性的)形式降低的细胞水平相关。这些作用认为对化合物的致癌特性是关键的(X.Guan，等.(1996)Carcinogenesis，171791-1798；R.J.Ruch，等.(1994)Carcinogenesis，15301-306)；B.V.Madhukar，等.(1996)Cancer Lett.106117-123)。作为监测异肽治疗效力的方法，可测定异肽对人成骨细胞中DDT-诱导的解结合的作用。因此，在一个方面，本发明的异肽用于抑制或预防肿瘤-促进剂诱导的GJIC的减少(W.K.Hong，等.(1997)Science，2781073-1077)。
在一种典型的测定法中，人成骨细胞分离自通过健康志愿者(年龄20-36)后髂棘的穿刺术获得的人骨髓。
收集大约10-15ml骨髓材料于含有100U/ml肝素(Sigma，Cat.No.H-3149)的15ml PBS+Ca，Mg(Life Technologies，Cat.No.14040)中。骨髓的单核细胞组分通过在2200rpm离心30分钟用Lymphoprep梯度(Nycomed Pharma，Cat.No.1001967)分离。
收集后，单核细胞组分用培养基洗涤一次并且在1800rpm离心10分钟。随后细胞计数并且以8×106细胞/100mm平皿接种于培养基中。随后的几天更换培养基并且细胞在每7天更换培养基、37℃下、5％CO2中培养。3-4周培养后，细胞一般达到70％的铺满培养。培养基随后用100nM地塞米松(Sigma，Cat.No.D-4902)补充7天。细胞随后接种用于视频成像实验。通常，细胞以2.5×105个细胞/盖玻片接种并且成像前培养2-3天。
培养后，在Zeiss Axiovert显微镜上，细胞随后附着于PDMI-2培养室(Medical Systems Corp.)，用过冷的CO2维持在37℃。利用装载10mM萤光黄溶液(Sigma，Cat.No.L-0259)的微量移液管进行显微注射。单细胞层中的细胞用LY小心注射30秒；从细胞移去微量移液管并且30秒后计数显示染料转移的细胞数目。对于细胞培养物的子集，DDT以13μM终浓度添加至培养基，并且保留60分钟。用加强型CCD摄像机(DageMTI)获得细胞图像并且利用MetaMorph成像软件(Universal Imaging)，用Matrox MVP图像处理板数字化。
对照条件下(无DDT处理)，染料通常达到14.5个细胞的中位数(n＝12)。DDT-暴露的细胞通常显示具有7中位数的减少的细胞结合(n＝13)。
异肽以10-8mol/l的终浓度添加至电解液，并且10分钟后进行另外的显微注射。优选，本发明的激动剂异肽显示细胞-至-细胞染料转移的提高。更优选，如利用常规统计检验，如Wilcoxon非参数的统计检验测定的，该提高显著不同于对照样品(无肽)(具有p＜0.05)。优选，异肽显示GJIC抑制的降低，相比对于AAP所观测到降低，其为至少约50％，优选约70％，且更优选约100％或更大。
该测定法可用于鉴定具有回复与肿瘤诱发有关的细胞间结合降低最高治疗效力的候选异肽，并且在一个方面，所述异肽给药至具有发展为癌症的风险或患有癌症的个体。异肽可单独或与其他异肽结合和/或在与其他抗-癌试剂的联合治疗中使用。
还可进行其他的测定法以鉴定引起如抗心率失常肽AAP、AAP10、HP和其功能类似物基本上相同的生理学应答的异肽(例如，以鉴定激动剂)或抑制或遏制这些生理学反应的异肽(例如，以鉴定拮抗剂)。合适的测定法包含，但不限于测定细胞中(例如，CHO细胞)cAMP生成的测定法；cAMP效力测定法(例如，测定CHO细胞中APP-样化合物forskoline-刺激的cAMP生成的抑制)；心肌细胞中磷酸肌醇的更新(Meier等.)(E.Meier，等.(1997)Drug Development Research，401-16)；和对除去葡萄糖和氧气的应答。
许多标准的测定法如上详述。2002年2月22日提交的PCT/US02/05773描述了另外的测定法，其整体此处引入作为参考。这些测定法仅是示范性的并且可能发展且成为标准化的其他合适的测定法包含在本发明的范围内。
药物组合物本发明还涉及包括一种或多种任何上述异肽，以及可药用的载体和/或稀释剂的药物组合物。
制剂/载体对于治疗用途，选择的本发明异肽与药物可接受的并且适于通过选择的给药途径递送异肽的载体一起配制。为了本发明的目的，外周的肠胃外途径包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内的给药途径。用于本发明的某些化合物还可以是易通过口服、直肠、鼻或下呼吸途径的给药。这些称为非肠胃外的途径。本药物组合物包括本发明的异肽或其盐和可药用的载体。合适的可药用载体为通常与基于肽的药物使用的那些，如稀释剂、赋形剂等等。用于治疗用途的可药用载体在药物技术中为大家所熟知，并且例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中描述。例如，可使用微酸性的或生理学pH的无菌盐和磷酸缓冲盐。Ph缓冲剂可以是组氨酸或乙酸钠。防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂可提供于药物组合物中。例如，苯甲酸钠、山梨酸和p-羟基苯甲酸酯可作为防腐剂添加。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂，例如SDS、抗坏血酸、甲硫氨酸、羧甲基纤维素、EDTA、聚乙二醇和Tween。
本发明的药物组合物可作为用于口服给药的片剂、胶囊剂或酏剂；用于直肠给药的栓剂；用于注射给药的无菌溶液和悬浮液等等而配制和使用。可调整给药的剂量和方法以达到最佳效力但是将取决于如体重、饮食、同时使用的药物的所述因素以及医学领域的技术人员公认的其他因素。
所用的药学载体或稀释剂可以是常规的固体或液体载体。固体载体的实例为乳糖、石膏粉、蔗糖、环糊精、滑石、凝胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸或纤维素低级烷基醚。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚环氧乙烷和水。
同样，载体或稀释剂可包括本领域已知的任何持续释放材料，如单独的单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯或与蜡的混合物。
肠胃外给药当给药为肠胃外时，如每日基础的皮下给药，可注射的药物组合物可以常规形式制备，如冻干的水溶液或悬浮液、适于在使用前立即重构的固体形式或注射前的液体悬浮液或乳剂。适合的赋形剂为，例如，水、盐水、葡萄糖、甘露糖醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠和盐酸半胱氨酸。此外，如果需要，可注射的药物组合物可包含少量的无毒助剂物质，如润湿剂或pH缓冲剂。可利用增强吸收的制剂(例如脂质体)。本发明的一个实施方案中，化合物配制用于输液给药，例如当在总肠胃外营养疗法(例如新生儿的)上用作用于个体的液体营养增补剂时，或注射给药，例如皮下、腹膜内或静脉内，以及因此用作无菌和无热原形式的水溶液和选择性地缓冲至生理学耐受的pH，例如偏酸性的或生理学pH。用于肌内给药的制剂可为基于植物油中的溶液或悬浮液，例如芸苔油、玉米油或大豆油。这些油即制剂可通过抗氧化剂例如BHA(丁基化羟基苯甲醚)和BHT(丁基化羟基甲苯)稳定。
因此，本异肽化合物可在赋形剂，如蒸馏水中或盐水、磷酸盐缓冲盐、5％右旋糖溶液或油剂中给药。如果需要，本异肽的溶解度可通过结合溶解度增强剂如去污剂和乳化剂而增强。
水相载体或赋形剂可用作注射的和用来储存注射位点处或附近异肽的适量凝胶一起添加，用于其缓释至所需的作用位点。可选的胶凝剂，如透明质酸也可用作储存试剂。
本发明的异肽还可配制为用于异肽延长和持续给药的缓释植入装置。所述的持续释放制剂可以是位于躯体上的膜片的形式。持续释放制剂的实例包括生物相容聚合物的复合物，如聚(乳酸)、聚(乳-共-羟基乙酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原、脂质体等。缓释制剂当需要用以提供本发明异肽的高局部浓度时具有特定的目的。
异肽可以包含亲小肠量肽，或单位剂量或多剂量的无菌管或安瓿瓶形式利用。管或安瓿瓶可包含异肽和所需的载体，作为预备给药的制剂。或者，管或安瓿瓶可包含如冻干形式、适于在合适的载体中，如无菌水或磷酸缓冲盐中重构形式的异肽。
非肠胃外给药作为注射制剂的选择，异肽可配制用于经其他途径的给药。可根据标准的药物操作配制口服形式，如片剂、胶囊剂等等。
可以理解的是用于既定疗法的活性物质实际优选的量将根据例如所用的具体化合物、配制的特定组合物、给药模式和受试者的特征，例如受试者的种类、性别、体重、健康状况和年龄而变化。用于既定给药方案的最佳给药速率可由本领域技术人员在上述指南的引导下利用常规的剂量测定试验很容易地确定。合适的剂量范围可包括约每天1mg/kg至约100mg/kg体重。
治疗方法在一个方面，本发明提供了向患有、或处于发展为与受损的GJIC有关的病症的风险中的个体给予治疗有效量的上述任何异肽的方法。可用本发明的异肽治疗的个体包括，但不限于，动物，优选哺乳动物，例如啮齿类(包括小鼠、大鼠、仓鼠和兔类动物，如兔)、狗、猪、山羊(通常为任何家畜)和灵长类。在一个优选的方面，个体为人。
可治疗的病症的实例包含，但不限于心血管疾病、气导表皮炎症、肺泡组织的病症、膀胱失禁、由于耳蜗疾病而受损的听力、内皮损伤、糖尿病性视网膜病和糖尿病性神经病变、中枢神经系统和脊髓的局部缺血、包含牙周病的牙组织病症、肾脏疾病、骨髓移植的失败、创伤、勃起障碍、膀胱失禁、神经性疼痛、亚慢性和慢性炎症、癌症和骨髓和干细胞移植的失败、在细胞和组织移植期间或在医疗操作例如手术期间产生的病症；以及由活性氧类和/或自由基和/或氧化氮的过量引起的病症。
在一个优选的方面，本发明提供了药学活性的抗心律失常异肽和其用于心血管病症期间产生的心律失常和血栓形成并发症治疗的用途，所述心血管病症如冠状血管再形成期间的急性缺血性心脏病(例如，稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞)、充血性心衰竭(例如，心脏收缩、心脏舒张、高-输出、低-输出、右或左侧心衰竭)、先天心脏病、肺原性心脏病、心肌病、心肌炎、高血压性心脏病等等。
在具体的实施方案中，本发明的抗心律失常异肽可单独或与其他抗心律失常化合物，如I类药剂(例如，利多卡因)、II类药剂(例如，美托洛尔或心得安)、III类药剂(例如，乙胺碘呋酮或甲磺胺心定)或IV类药剂(例如，异搏定)一起用于治疗和/或预防心动过缓(例如，由于静脉窦结节、AV结节、房室束、右或左束支中的病原引起的)、和与折返有关的心律加快(例如，心房过早综合症、AV连接综合症、心室过早综合症、心房纤维性颤动、心房扑动、阵发性室上性心动过速、静脉窦结节折返性心动过速、AV结节的折返性心动过速和非持续的室性心动过速)。
另外或可选择地，本发明的异肽用于治疗一种或多种下述疾病折返心律失常、室性折返(例如，如急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛期间产生的)；传染性的或自主的心肌病；心房纤维性颤动；复极化交替；单形的室性心动过速；T-波交替；心动过缓和通常心脏组织降低的收缩性，血栓形成等等。
骨质疏松症在另一方面，本发明的异肽用于预防和/或治疗骨质疏松症或影响骨形成、生长或维持的其他病状。能正常化在氧不足期间人成骨细胞间受损的GJIC的异肽尤其适于骨形成相对骨吸收削弱的骨疾病的治疗。用于所述方法的最佳异肽可在用于成骨细胞中增强的碱性磷酸酶(ALP)活性的测定法中选择，其提供了监测细胞由于GJIC适当的维持的生存能力和生长的方法。在一个方面，人成骨细胞用1×10-13至1×10-6mol/l不同浓度的异肽刺激，并且与未处理的对照比较。在正常培养条件下，异肽优选增强ALP活性。更优选，异肽以10-11至10-8mol/l的浓度在含氧量低的条件下促进ALP的活性。该测定法因此能用于优化用于和骨组织中不良的血管形成、氧不足和局部缺血有关的骨疾病治疗和/或预防的异肽组合物。
关节疾病在另一个方面，本发明的异肽用于涉及削弱的细胞-至-细胞结合的关节疾病的预防和/或治疗。例如，异肽能用于涉及代谢应激的关节疾病的预防和/或治疗。这些包括和减少的血管形成或骨折软骨组织的痊愈相关的任何形式的关节炎。
癌症仍然在另一个方面，本发明的异肽用于治疗癌症。致癌作用以生长调控机理的渐进性损伤为特征，其中涉及生长因子、致癌基因和肿瘤抑制基因。致癌作用和肿瘤发生中的常规主题为GJIC的下调。利用染料-转移测定法的肿瘤细胞中间隙连接的渗透性通常比外围组织中的GJIC低。此外，已知间隙连接的开启受肿瘤促进剂的影响，其减少GJIC。因此，在一个方面，本发明的异肽用作单独或和传统的抗-癌疗法一起用于癌症治疗的药物。
伤口愈合另外一方面，本发明的异肽用于治疗创伤并且尤其，用于加速伤口愈合。伤口愈合涉及许多细胞类型的相互作用，并且由间隙连接介导的细胞间通讯被认为在参与组织修复和再生的细胞生长发育期间细胞代谢的协同作用中起重要作用(K.M.Abdullah，等.(1999)Endocrine，1035-41；M.Saitoh，等.(1997)Carcinogenesis，181319-1328；J.A.Goliger，等.(1995)Mol.Biol.Cell，61491-1501)。异肽可通过利用本领域熟知的载体(例如，油膏、乳膏剂等等)的局部给药而给药至伤口位置或可全身给药，例如，用于治疗内部组织的创伤，如在慢性胃溃疡损伤的治疗中。
局部缺血其中涉及内皮间隙-连接细胞间通讯的另外的功能为损伤、血管生成、内皮生长和衰老后内皮细胞的迁移性能以及血管舒缩反应的协同作用(G.J.Christ，等.(2000)Braz.J Med Biol.Res，33423-429)。因此，在一个方面，本发明的异肽用于在具有增强的代谢需求状况时(例如，体育活动、心动过速)和局部缺血时增强引导的血管应答以及用于改进血液供给。
间隙连接还被认为提供在神经胶质区室单独部分中用于共排列远程信号的分子连接。同样，星形细胞由于其由接触血管床的末端和另一个靠近神经元实质细胞的电极功能性地极化而非常适于神经元的代谢供给(R.Dermietzel(1998)Brain Res.Brain Res.Rev.，26176-183)。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的异肽通过增强胶质细胞和神经元间的代谢供给而给药至需要预防脑中缺血性损伤的个体。所述个体可包括患有器质性精神病的个体，其可具有症状如沮丧、忧虑、学习和记忆力缺乏、恐惧和幻觉或患有外伤性脑损伤的个体。优选，选择或配制所述异肽以使其对中枢神经系统是有效的(即，用促进转运通过血脑屏障的载体提供或结合)。
本发明的异肽还可用于例如，如在神经外伤、脑局部缺血和慢性神经退行性疾病，如帕金森氏症或亨廷顿氏症的个体中促进神经损伤后或未成熟细胞(祖细胞)移植入脑组织时的修复(H.Aldskogius，等.(1998)Prog.Neurobiol，551-26)。
在具体的实施方案中，由于对细胞间间隙连接通道的作用，本发明的异肽可用于治疗和/或预防白内障(D.Mackay，等.(1999)Am JHum.Genet，641357-1364)、治疗和/或预防患有角膜营养不良疾病状态的角膜的血管形成以及增强角膜损伤的痊愈(S.G.Spanakis，等.(1998)Invest Ophthalmol.Vis.Sci.，391320-1328)和/或预防高血压。
对于本领域技术人员显而易见的是本发明的异肽和药物组合物可用于治疗与削弱的(异常降低或提高)间隙连接通讯相关的任何病症或病状。优选，包括一种或多种异肽的一种或多种异肽或药物组合物以治疗有效量给药至需要其的个体。如此处使用的，″治疗有效量″为缓解既定病症或病状的症状和优选在患有该病症或病状的个体中正常化生理学反应的量。症状的缓解或生理学反应的正常化可利用本领域的常规方法测定并且可随既定的病症或病状而变化。在一个方面，包括一种或多种异肽的一种或多种异肽或药物组合物的治疗有效量为恢复可测量的生理参数至基本上和无该病症或病状的个体中参数相同值(优选至该值的±30％以内，更优选至±20％以内，且更优选至±10％)的量。
实验本发明将参考下列实施例进一步说明。可以理解的是下列所述仅是举例的方式并且在仍落入本发明范围内时可进行对细节的改进。
实施例1.异肽的合成优选的常规流程描述如下。然而，在此整体引入的W098/11125中可找到固相异肽合成的更详细的描述。
a.常规的异肽合成装置和合成策略异肽在配备有用于过滤的聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中利用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)作为N-α-氨基保护基以及用于侧-链功能的合适的常规保护基分批合成。
溶剂溶剂DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel de-Haen，Germany)通过流过装载强阳离子交换树脂(Lewatit S 100MB/H强酸，Bayer AGLeverkusen，Germany)的柱纯化并且在使用前通过如果游离胺存在时产生黄颜色(Dhbt-O-阴离子)的3，4-二氢-3-羟基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)的加入而分析游离的胺。不经纯化而直接使用溶剂DCM(二氯甲烷，分析纯级，Riedel de-Hen，Germany)。不经纯化直接使用乙腈(HPLC-级，Lab-Scan，Dublin Ireland)。
氨基酸Fmoc-和Boc-保护的氨基酸购自Advanced Chem Tech(ACT)，Bachem，NovaBiochem和Neosystem。
苯甲酸和苯甲胺衍生物苯甲酸和苯甲胺衍生物购自Aldrich并且不经另外的纯化而使用。
偶联试剂偶联试剂二异丙基碳二亚胺(DIC)购自来自Advanced Chem Tech的(Riedel de-Haen，Germany)，PyBop。
接头(4-羟甲基苯氧基)乙酸(HMPA)购自Novabiochem，Switzerland；并且作为通过DIC方法产生的预先形成的1-羟基苯并三唑(HOBt)酯结合至树脂。
固相支持物根据Fmoc-策略在TentaGel S树脂0.22-0.31mmol/g(TentaGel-S-NH2；TentaGel S-Ram，Rapp polymere，Germany)上合成异肽催化剂和其他试剂二异丙基乙胺(DIEA)购自Aldrich，Germany，而乙二胺购自Fluka，哌啶和吡啶购自Riedel-de Hen，Frankfurt，Germany。4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)购自Fluka，Switzerland并且用作参与对称酸酐的结合反应中的催化剂。乙二硫醇购自Riedel-de Hen，Frankfurt，Germany。3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(HOAt)获自Fluka，Switzerland。
偶联方法第一个氨基酸作为产生自合适的n-α-保护的氨基酸和dic的dmf中对称的酸酐而结合。紧接的氨基酸通过dmf中dic的方法作为产自合适的n-α-保护氨基酸和hobt或hoat的原位产生的hobt或hoat酯而结合。检验期间通过在80℃进行的茚三酮试验验证酰基化作用以防止Fmoc的脱保护(B.D.Larsen，A.Holm，int.j pept.Protein res.1994，431-9)。
N-α-氨基保护基(Fmoc)的脱保护Fmoc基团的脱保护通过用DMF中20％的哌啶处理而进行(1×5和1×10分钟)，随后在Dhbt-OH添加至耗尽的DMF后用DMF(5×15ml，每次5分钟)洗涤直至检测不到黄颜色。
烯丙基/Aloc的脱保护溶于15-20ml CHCl3、AcOH、NMM(37∶2∶1)中的3eq.Pd(PPh3)4溶液添加至肽树脂。处理在室温下持续三小时，伴随有N2通过混合物的气泡流。
HOBt-酯的结合
3eq.N-α-氨基保护氨基酸与3eq.HOBt和3eq.DIC一起溶于DMF且随后添加至树脂。
预先形成的对称酸酐6eq.N-α-氨基保护氨基酸溶于DCM并且冷却至0℃。添加DIC(3eq.)并且反应持续10分钟。在真空中除去溶剂并且剩余物溶于DMF。溶液立即加至树脂随后添加DMAP的0.1eq.。
来自树脂的异肽用酸的裂解通过用95％的三氟乙酸(TFA，Riedel-de Hen，Frankfurt，Germany)-水v/v或用95％的TFA和5％的乙二硫醇v/v在室温处理2h而从树脂裂解异肽。过滤的树脂用95％的TFA-水洗涤并且滤液和洗液在降低的压力下蒸发。残留物用醚洗涤并且从乙酸-水冻干。粗制的冻干产物通过高效液相色谱(HPLC)分析并且通过电喷射电离质谱法(ESMS)鉴定。
在TentaGel树脂上(PEG-PS)分批合成异肽TentaGel树脂(1g，0.22-0.31mmol/g)置于配备有用于过滤的聚丙烯过滤器的聚乙烯容器中。树脂在DMF(15ml)中溶胀，并且用DMF中20％的哌啶处理以确保树脂上非质子氨基的存在。Dhbt-OH添加至排干的DMF后排干树脂并且用DMF洗涤直至检测不到黄颜色。如上所述HMPA(3eq.)作为预先形成的HOBt-酯结合并且结合持续24h。排干树脂且用DMF(5×5ml，每次5min)洗涤并且通过茚三酮试验验证酰基化作用。如上所述第一个氨基酸作为预先形成的对称酸酐结合。如上所述，根据序列紧随的氨基酸作为预先形成的Fmoc-保护HOBt酯(3eq.)结合。除非另作说明，结合持续2h。排干树脂且用DMF洗涤(5×15ml，每次5min)以除去过量的试剂。所有的酰基化作用通过在80℃进行的茚三酮试验验证。合成完成后异肽-树脂用DMF(3×15ml，每次5min)、DCM(3×15ml，每次1min)和最后二乙醚(3×15ml，每次1min)洗涤并且在真空中干燥。
制备HPLC的条件利用配备有AFC2000自动馏份收集器/自动进样器的VISION工作站(PerSeptive Biosystem)进行制备色谱。VISION-3软件用于仪器控制和数据获取。对于制备HPLC，使用不同的柱如Kromasil(EKAChemicals)KR100-10-C8 100，C-8，10μM；CER2230，250×50，8mm或VYDAC 218TP101550，300，C-18，10-15μM，250×50mm。缓冲体系包括AMQV中0.1％的TFA；B0.085％的TFA、10％的MQV、90％的MeCN。流速为35-40ml/min。优选的柱温为25℃。在215nm和280nm进行UV检测。合适的梯度用于单个异肽。
分析HPLC的条件梯度HPLC分析利用由HP1100 Quaternary泵、HP1100自动进样器HP1100柱恒温箱和HP1100多波长检波器组成的Hewlett Packard HP1100 HPLC系统完成。用于LC软件(rev.A.06.01)的Hewlett PackardChemstation用于仪器控制和数据获取。
对于分析的HPLC，使用不同的柱如VYDAC 238TP5415，C-18，5μM，300或Jupiter，Phenomenex 00F-4053-E0；5μM C-18，300150×4，6mm等等。缓冲体系包括AMQV中0.1％的TFA；B0.085％的TFA、10％的MQV、90％的MeCN。流速为1ml/min。优选的柱温为40℃。在215nm进行UV检测。如上，合适的梯度用于单个异肽。
质谱法异肽溶于超纯度的甲醇(Labscan，Dublin，Ireland)、Milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)和甲酸(Merck，Damstadt，Germany)(50∶50∶0.1v/v/v)中以产生1和10μg/ml之间的浓度。异肽溶液(20μl)通过ESI-TOF-MS利用+/-0.1m/z精确度的LCT质谱仪(Micromass，Manchester，UK)以阳极性模式分析。
典型的合成方案显示在图1A和1B中
b.单个异肽的合成H-Gly-异-Lys(4-硝基苯甲酰基)-OH(化合物1)的合成在这，此处描述了所有连续的合成，干的TentaGel-S-NH2(0.23mmol/g，1g)置于配备有对于过滤的聚丙烯过滤器的聚乙烯容器中并且如底下″在TentaGel树脂上分批的异肽合成″所述而处理。赖氨酸作为Fmoc-Lys(Aloc)-OH结合而甘氨酸作为Boc衍生物结合。如上除去Aloc保护基。赖氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Aloc基团的脱保护。甘氨酸随后结合至赖氨酸的ε-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-硝基苯甲酸通过在THF中DIC的方法作为原位产生的HOBt酯而结合。
所有结合持续至少2小时。如之前所述，所有的酰基化作用通过在80℃进行的茚三酮试验验证。合成完成后异肽-树脂用DMF(3×15ml，每次1min)、DCM(3×15ml，每次1min)、二乙醚(3×15ml，每次1min)洗涤并且在真空中干燥。异肽随后如上所述从树脂裂解并且冻干。该流程用于底下进一步举例说明的所有异肽。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于99％纯度的40mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+352.07，计算值MH+352.24)证实。
H-Gly-异-Lys(4-甲氧基苯甲酰基)-OH(化合物4)的合成赖氨酸作为Fmoc-Lys(Aloc)-OH结合而甘氨酸作为Boc衍生物结合。如上除去Aloc保护基。赖氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Aloc基团的脱保护。甘氨酸随后结合至赖氨酸的ε-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲氧基苯酸通过在DMF中DIC的方法作为原位产生的HOBt酯而结合。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于98％纯度的25mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+337.16，计算值MH+337.27)证实。
H-Gly-异-D-Lys(4-甲氧苯甲酰基)-OH(化合物18)的合成赖氨酸作为Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH结合而甘氨酸作为Boc衍生物结合。如上除去Aloc保护基。赖氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Aloc基团的脱保护。甘氨酸随后结合至赖氨酸的ε-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲氧基苯酸通过在DMF中DIC的方法作为原位产生的HOBt酯而结合。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于99％纯度的35mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+337.13，计算值MH+337.21)证实。
H-Gly-异-D-Lys(4-硝基苯甲酰基)-OH(化合物19)的合成赖氨酸作为Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH结合而甘氨酸作为Boc衍生物结合。如上除去Aloc保护基。赖氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Aloc基团的脱保护。甘氨酸随后结合至赖氨酸的ε-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-硝基苯甲酸通过在THF中DIC的方法作为原位产生的HOBt酯而结合。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于99％纯度的31mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+352.07，计算值MH+352.24)证实。
H-异-Asn(NH((4-甲氧基苯甲基))-Ala-OH(化合物57)的合成丙氨酸作为Fmoc-Ala-OH结合而天冬氨酸作为Boc-Asp-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。天冬氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲氧苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的天冬酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于98％纯度的20mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+323.16，计算值MH+323.25)证实。
H-异-Asn(NH((4-硝基苯甲基))-Ala-OH(化合物58)的合成丙氨酸作为Fmoc-Ala-OH结合而天冬氨酸作为Boc-Asp-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。天冬氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-硝基苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的天冬酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于98％纯度的56mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+338.12，计算值MH+338.22)证实。
H-异-Asn(NH((4-甲氧基苯甲基))-D-Ala-OH(化合物72)的合成丙氨酸作为Fmoc-D-Ala-OH结合而天冬氨酸作为Boc-Asp-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。天冬氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲氧苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的天冬酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于99％纯度的16mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+323.16，计算值MH+323.24)证实。
H-异-Asn(NH((4-硝基苯甲基))-D-Ala-OH(化合物73)的合成丙氨酸作为Fmoc-D-Ala-OH结合而天冬氨酸作为Boc-Asp-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。天冬氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-硝基苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的天冬酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于99％纯度的31mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+338.12，计算值MH+338.22)证实。
H-异-Gln(NH((4-甲氧基苯甲基))-Ala-OH(化合物101)的合成丙氨酸作为Fmoc-Ala-OH结合而谷氨酰胺作为Boc-Glu-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。谷氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲氧苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的谷氨酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于99％纯度的27mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+337.13，计算值MH+337.25)证实。
H-异-Gln(NH((4-硝基苯甲基))-Ala-OH(化合物102)的合成丙氨酸作为Fmoc-Ala-OH结合而谷氨酰胺作为Boc-Glu-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。谷氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-硝基苯甲胺通过在THF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的谷氨酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于98％纯度的22mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+352.15，计算值MH+352.2)证实。
H-异-Gln(NH((4-甲基苯甲基))-Ala-OH(化合物107)的合成丙氨酸作为Fmoc-Ala-OH结合而谷氨酰胺作为Boc-Glu-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。谷氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲基苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的谷氨酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集异肽产物并且通过ES-MS证实异肽的均一性。
H-异-Gln(NH((4-甲氧基苯甲基))-D-Ala-OH(化合物116)的合成丙氨酸作为Fmoc-D-Ala-OH结合而谷氨酰胺作为Boc-Glu-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。谷氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-甲氧苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的谷氨酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于98％纯度的11mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+337.22，计算值MH+337.28)证实。
H-异-Gln(NH((4-硝基苯甲基))-D-Ala-OH(化合物117)的合成丙氨酸作为Fmoc-D-Ala-OH结合而谷氨酰胺作为Boc-Glu-OFm衍生物结合。如上除去Fmoc保护基。丙氨酸作为对称的酸酐结合至固相支持物，随后为Fmoc基团的脱保护。谷氨酸随后经侧链羧酸结合至丙氨酸的α-氨基。随后除去Fmoc基团并且接着4-硝基苯甲胺通过在DMF中DIC和HOBt的方法结合至衍生的谷氨酰胺的α-羧酸。
如上所述利用制备的HPLC纯化后，收集具有大于96％纯度的24mg异肽产物。异肽的均一性通过ES-MS(测定值MH+352.12，计算值MH+352.22)证实。
实施例2.异肽对钙诱导的心律失常的作用异肽的抗-心律失常作用在根据Lynch等.，J.Cardiovasc.Pharmacol.(1981)，349-60模型的钙-诱导的心律失常模型中检测。雄性NMRI小鼠(25-30克；Bomholdtgaard，Ll.Skendsved，Denmark)用安定麻醉组合物(Hynorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和fuanisone 10mg/ml)和5mg/ml的咪达唑仑麻醉。Hynorm和咪达唑仑的商品化溶液1∶1稀释于蒸馏水中，并且一份Hynorm与一份稀释的咪达唑仑混合。麻醉通过该溶液以50-75μl/10克小鼠剂量的s.c.给药而产生。
静脉内插管插入尾部静脉。引导II ECG信号通过位于右前肢和左后肢的不锈钢ECG电极连续记录。接地电极位于右后肢。信号经HugoSachs电子模型689ECG模块放大(×5.000-10.000)和过滤(0.1-150Hz)。模拟信号经12-比特的数据采集板(数据转换模型DT321)数字化并且利用用于Windows NT的Notocord HEM3.1软件在1000Hz采样。10-分钟的平衡时间后，异肽试样以1nmol/kg剂量注射入尾部静脉并且三分钟后开始CaCl2的静脉内输液(30mg/ml，0.1ml/min-100mg/kg/min，氯化钙-2-水合物，Riedel-de Haen，Germany)。
在每天检测用介质(0.1％牛白蛋白的磷酸盐缓冲盐)预处理的小鼠作为未治疗动物对照水平的衡量。所有实验中注射体积为100μl。至心律失常发作的时间延迟确定为从CaCl2输液开始至第一个传导阻断事件(定义为SA的间歇故障或以迟延的P-波激活(SA阻断)或以无伴随的QRS综合波(AV阻断)的P-波为特征的AV传导)的时间。
结果所检测的肽化合物的应答％在底下表2中给出。应答根据(tarr(检测化合物)-tarr(介质))×100/tarr(介质)而评估。
表2
结论本发明肽显示抗心律失常作用。
定义除非另外说明，下列定义提供用于专用名词，其用于下列文字说明中。
整个说明书和权利要求中使用用于天然氨基酸的三-字母代码以及公认的用于其他的α-氨基酸，如Sarcosin(Sar)的三字母代码。其中没有指定L或D型，可理解的是所述的氨基酸可以是L或D型。
异肽的″功能类似物或衍生物或经修饰型″指具有十分类似于内源性AAP或其功能类似物(例如，如AAP10或HP5)的结构构象和/或结合特性的，或结合至由AAP结合的受体以提供维持或正常化间隙连接功能的一种或多种有益作用(即，当间隙连接通讯削弱时增强或当间隙连接通讯过度刺激或不受控制时抑制)的任何化学体或化合物。优选，所述类似物或衍生物还能结合至异肽载体hPepT1或其结构类似物。如整个说明书和权利要求中所用的，术语″异肽″包含异肽或如上定义的所述异肽的功能类似物或衍生物。术语″异肽的功能类似物″进一步包含肽模拟物或类肽。
术语″异肽模拟物″指具有异肽和非异肽性质的化合物。肽模拟物产生的背后目的为产生可替换异肽主链的支架。假定异肽中的二级酰胺键负责不稳定性和通过细胞膜的可能不良的异肽输运特性。氨基酸侧链在合适的轨道的适当放置被看作是在异肽肽模拟物中以获得生物活性的关键设计策略。主链的改进包括减少的酰胺键和烷基化酰胺键以及同配键如硫胺键、CH2-CH2、CH＝CH的利用。术语″类肽″指可由类肽结构式和亲本异肽间拓扑相似性表征的化合物。因此，类肽可以是由氨基酸的异肽-样链组成的化合物，其如真实的异肽中那样在主链氮原子上而不是α-碳上带有侧链。肽模拟物和类肽可包括具有经修饰的侧链，如Nal、Dab和Dapa的氨基酸单元，或其可包括D-氨基酸。EI Tayar，N等.(Amino Acids(1995)8125-139)所述的异肽和肽模拟物结构的各种修饰包括在此处的定义中。
术语″卤素″指F、Cl、Br和I，其中F和I是优选的。
术语″烷基″指源自通过氢原子从任何碳原子除去的链烷的单价基团CnH2n+1-。通过氢原子从直链链烷的末端碳原子除去产生的基团形成标准烷基(n-烷基)基团的亚类H[CH2]n-。基团RCH2-、R2CH-(R不等于H)和R3C-(R不等于H)分别为伯、仲、叔烷基基团。C(1-22)烷基指具有1至22个碳原子的任何烷基并且包括C(1-6)烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基和己基以及其所有可能的异构体。
短语″低级烷基″指具有小于约6个碳原子的直链或支链烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基。
术语″烯基″指包含一个或多个碳-碳双键的直的或分枝的或环状的烃类基团。C(2-22)烯基指具有1至22个碳原子的任何烯基基团并且包括C(2-6)烯基、乙烯基、烯丙基、1-丁烯基等等。
术语″芳烷基″指芳基C(1-22)烷基，并且贯穿整个说明书的术语″芳基″指苯基或萘基。
短语″疏水基团″指任选取代的芳烃碳环，优选6或12-元的芳烃碳环。短语“任选取代″指6或12-元芳烃碳环用至少一种低级烷基、烷氧基、羟基、羧基、胺、硫醇、酰肼、酰胺、卤化物、羟基、醚、胺、腈、亚胺、硝基、硫化物、亚砜、砜、硫醇、醛、酮、羧基、酯、酰胺基；包括其硒和硫的衍生物的取代。还包括在″任选取代″定义中的为硫化物、亚砜、砜和有或无硒基基团的硫醇衍生物。在其中芳烃碳环被取代的实施方案中，所述取代通常数目小于约10处取代，更优选同样的1至5处，且对于许多发明应用约1或2处取代是优选的。优选的烷氧基包括甲氧基、乙氧基和丙氧基。举例说明的疏水基团包括未被取代的苯甲基、苯基和萘基。
短语″氢键基团″指(非共价的)氢键的供体或受体。在其中氢键基团为供体的实施方案中，其通常包括至少一个结合至氢原子的负电原子。所述负电原子的实例包括，但不限于氮、氧气、卤化物(例如，Cl、F、Br等等)和硫。举例说明的氢键供体包括羟基、胺、硫醇、酰肼和酰胺。在其中第一个氢键基团为受体的实施方案中，其优选包括至少一个如上述的那些负电原子，其中该原子包括未结合的电子对。所述对常常称为″孤对″。优选氢键受体的实例包括，但不限于卤化物、羟基、醚、胺、腈、亚胺、硝基、醛、酮、羧基、酯、酰胺基；和其硒基衍生物。预想的还有合适的硫化物、亚砜、砜和包括其硒基衍生物的硫醇氢键受体。
术语″细胞间通讯调节剂″、″间隙连接促进剂″、″促进间隙连接通讯的化合物″和″间隙连接开启者″等等，所有的指促进或维持或正常化GJIC的化合物，而不管该作用后的具体机理。更具体地说，术语″间隙连接开启者″可指正常化(即，提高)能流过细胞外和细胞间隙之间间隙连接的分子交换，和/或可正常提高GJIC的物质。
术语″激动剂″指可与其为AAP、AAP10、HP5异肽或其功能类似物靶标的组织、细胞或细胞组分相互作用，以引起和AAP、AAP10、HP5异肽或其功能类似物在组织、细胞或细胞组分中基本相同的生理学反应的异肽。在一个方面，生理反应为一种或多种以下反应收缩、松弛、分泌、酶活化等等。优选，异肽结合至组织、细胞或细胞组分。在一个方面，异肽结合至组织、细胞细胞组分上的受体，其结合至AAP、AAP10、HP5或其功能类似物。
如此处使用的″抗心律失常异肽激动剂″为包括抗心律失常活性的异肽，其与AAP、AAP10、HP5异肽或其功能类似物的抗心律失常活性基本相同或更高。“更高”指相比AAP、AAP10、HP5异肽或其功能类似物，在较低浓度的异肽或较短时期的时间中观测到的抗心律失常活性。
术语″拮抗剂″指抑制或拮抗将组织、细胞或细胞组分与AAP、AAP10、HP5异肽或其功能类似物接触后在组织、细胞或细胞组分中观测到的一种或多种生理学反应的异肽。在一个方面，生理反应为一种或多种的收缩、松弛、分泌、酶活化等等。优选，异肽结合至组织、细胞或细胞组分。在一个方面，异肽结合至组织、细胞或细胞组分上的受体，其结合至AAP、AAP10、HP5或其功能类似物和/或其抑制一种或多种AAP、AAP10、HP5、其功能类似物结合至该受体。
如此处使用的，″正常化″指生理反应的变化使得应答变得和在正常的病人中观测到的没什么不同。因此，取决于所包含的病状，正常化可包含应答的增强或降低。
本发明异肽的″IC50″指由抗心律失常异肽如AAP、AAP10、HP5或其功能类似物介导的应答或活性50％抑制所需的异肽浓度。在一个方面，为AAP、AAP10、HP5或其功能类似物拮抗剂的异肽为具有小于约10-6M，且优选小于约10-8M的IC50的异肽。
本发明异肽的″EC50″指对于AAP、AAP10、HP5或其功能类似物所观测到的50％最大作用所需异肽的血浆浓度/AUC。在一个方面，为AAP、AAP10、HP5或其功能类似物激动剂的异肽为具有小于约10-6M，且优选小于约10-8M的EC50的异肽。
如此处使用的，″口服有效性”指口服给药的药物进入血流的吸收速率和程度。
本申请中使用的缩写进一步在底下定义。
此处引用的所有参考文献在此整体引入作为参考。
在不背离本发明和此处权利要求的精神和范围下，此处所述那些的改变、改进和其他实施将是本领域技术人员所能想到的。
权利要求
1.由通式(I)表示的异肽 其中，如果a为1则b为0；如果a为0则b为1；x和y独立地为1-7；R1为H或CH3R2为选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸的侧链；R3选自H、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、RO、RS、RSO、RSO2、COR、CSR、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、OCOR和SCOR，其中R＝烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基；并且R4和R5独立地为疏水基团。
2.根据权利要求1的异肽，其中R1为H。
3.根据权利要求1或权利要求2的异肽，其中R2为选自甘氨酸和丙氨酸的氨基酸的侧链。
4.根据权利要求1至3任一项的异肽，其中R3为H或NH2。
5.根据权利要求1-4任一项的异肽，其中R4和R5独立地包括芳烃碳环。
6.根据权利要求5的异肽，其中的芳烃环包括6-或12元环或其取代的形式。
7.根据权利要求6的异肽，其中的环用至少一种如下基团取代低级烷基、烷氧基、羟基、羧基、胺、硫醇、酰肼、酰胺、卤化物、羟基、醚、胺、腈、亚胺、硝基、硫化物、亚砜、砜、硫醇、醛、酮、羧基、酯、酰胺基；硒基、硫基及其衍生物。
8.根据权利要求6的异肽，其中的芳环用至少一种如下基团所取代低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基。
9.根据权利要求6的异肽，其中的环用至少一种如下基团所取代烷氧基和硝基。
10.根据权利要求6的异肽，其中的环包括约1至5处取代。
11.根据权利要求6的异肽，其中的环包括约1至2处取代。
12.根据权利要求5的异肽，其中的芳烃碳环选自苯甲基、苯基和萘基。
13.根据权利要求12的异肽，其中的芳烃碳环为苯甲基。
14.权利要求1-13任一项的异肽，其中R1为H；R2为氨基酸甘氨酸或丙氨酸的侧链；R3为H或NH2；R4和R5包括用硝基或甲氧基的至少一种取代的苯甲基。
15.由以下通式II表示的异肽 其中，如果a为1则b为0；如果a为0则b为1；x和y独立地为1-7；z为1-6；q为0-6；p为0-1R1为H或CH3R2为选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸的侧链；R3选自H、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、RO、RS、RSO、RSO2、COR、CSR、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、OCOR和SCOR，其中R＝烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基；并且R6和R7独立地选自H、烷基、烯基、芳基、芳烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硫烷氧基、硫代芳氧基、硫代芳烷氧基、+S(CH3)2、SO3H、SO2R、NH2、NHR、NR2、+NR3、OH、SH、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CH2OH、NCO、NCOR、NHOH、NHNH2、NHNRH、CH2OCOR、CH2OCSR、COR、CSR、CSOR、CF3和CCl3，并且其中R为烷基、烯基、芳基、芳烷基或环烷基。
16.根据权利要求15的异肽，其中R1为H。
17.根据权利要求15或权利要求16的异肽，其中R2为选自甘氨酸和丙氨酸的氨基酸的侧链。
18.根据权利要求15-17任一项的异肽，其中R3为H或NH2。
19.根据权利要求15-18任一项的异肽，其中R6和R7独立地选自H、烷基、卤素、CN、NO2、烷氧基和CF3。
20.根据权利要求19的异肽，其中R6和R7独立地选自H、NO2和烷氧基。
21.权利要求15-20任一项的异肽，其中R1为H；R2为氨基酸甘氨酸或丙氨酸的侧链；R3为H或NH2；R6和R7独立地选自H、NO2和甲氧基。
22.根据权利要求1至21任一项的异肽，其中异肽包括游离的N-末端、游离的C-末端或游离的N-和C-末端。
23.根据权利要求1或权利要求15的异肽，其中的疏水基团为包括在4-位有取代基的6-元芳烃碳环。
24.根据权利要求23的异肽，其中的取代基选自甲基、乙基、叔-丁基、c-己基、苯基、正-丁基、正-己基、正-辛基、乙氧基、叔-丁氧基、苯氧基、丁氧基、苯甲氧基、正-己氧基和正-辛氧基。
25.根据权利要求23的异肽，其中的取代基选自烷氧基和硝基。
26.根据权利要求23的异肽，其中R1为H，R2为选自甘氨酸或丙氨酸的氨基酸的侧链；R3为H或NH2；6-元芳烃碳环为苯甲基；并且4-位的取代基为硝基或烷氧基。
27.根据权利要求9、20、25或26任一项的异肽，其中的烷氧基为甲氧基。
28.由以下通式表示的异肽H-第一个氨基酸部分-第二个氨基酸部分-OH，其中第一个氨基酸部分包括选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的氨基酸；第二个氨基酸部分包括选自赖氨酸、丙氨酸和肌氨酸的氨基酸；第一个或第二个氨基酸部分包括6-元芳烃碳环。
29.根据权利要求28的异肽，其中第一个氨基酸部分包括氨基酸甘氨酸或谷氨酰胺并且第二个氨基酸部分包括氨基酸赖氨酸或丙氨酸。
30.根据权利要求28或权利要求29的异肽，其中第一个氨基酸部分包括芳烃碳环，氨基酸为谷氨酰胺。
31.根据权利要求30的异肽，其中第二个氨基酸部分包括氨基酸丙氨酸。
32.根据权利要求28或权利要求29的异肽，其中第二个氨基酸部分包括芳烃碳环，氨基酸为赖氨酸。
33.根据权利要求32的异肽，其中第一个氨基酸部分包括氨基酸甘氨酸。
34.根据权利要求28至33任一项的异肽，其中的芳烃碳环为苯甲基或苯甲酰基。
35.根据权利要求28至34任一项的异肽，其中的芳烃碳环用低级烷基、烷氧基、卤化物、腈和硝基的至少一种取代。
36.根据权利要求35的异肽，其中的芳烃碳环用烷氧基和硝基的至少一种取代。
37.根据权利要求28至36任一项的异肽，其中的芳烃碳环在4-位被取代。
38.根据权利要求1-37任一项的异肽，其中的异肽为抗心律失常药物。
39.根据权利要求1-38任一项的异肽，其中的异肽结合至hPepT1转运蛋白或其生物学活性片段。
40.根据权利要求1-39任一项的异肽，其中的异肽在体外血浆稳定性测定法中具有超过约30分钟的半衰期。
41.根据权利要求1-39任一项的异肽，其中的异肽在体外血浆稳定性测定法中具有超过约48小时的半衰期。
42.根据权利要求1-41的异肽，其中的异肽结合至其为抗心律失常肽作用位点的组织、细胞或细胞组分。
43.根据权利要求42的异肽，其中的异肽为组织、细胞或细胞组分的功能调节剂。
44.根据权利要求42的异肽，其中的异肽拮抗抗心律失常肽的功能。
45.根据权利要求42的异肽，其中的异肽激动抗心律失常肽的功能。
46.根据权利要求42的异肽，其中的异肽为抗心律失常肽受体的调节剂。
47.根据权利要求42的异肽，其中的异肽在标准的钙-诱导的心律失常测定法中提高了到达AV阻断的时间。
48.根据前述权利要求任一项的异肽，其中的异肽选自表1中所示的异肽。
49.根据前述权利要求任一项的异肽，其中的异肽选自表2中所示的异肽。
50.用于调节细胞群中间隙连接通讯的方法，包括将权利要求1-49任一项限定的有效量的异肽给药至细胞群，由此调节细胞间的间隙连接通讯。
51.根据权利要求50的方法，其中的异肽为如权利要求49中所限定的异肽。
52.根据权利要求50或权利要求51的方法，其中的给药在体内进行。
53.预防和/或治疗涉及削弱的间隙连接通讯的病理病症的方法，包括将权利要求1至49任一项限定的治疗有效量的异肽给药至所需的个体。
54.根据权利要求53的方法，其中的异肽为如权利要求48中所限定。
55.根据权利要求53的方法，其中的给药为肠胃外给药。
56.根据权利要求53的方法，其中的给药为口服。
57.根据权利要求53的方法，其中的个体为人。
58.根据权利要求53的方法，其中的病理病症选自心血管疾病、气管表皮炎症、肺泡组织的病症、膀胱失禁、受损的听力、内皮损伤、糖尿病性视网膜病，糖尿病性神经病变、CNS，即中枢神经系统的局部缺血、脊髓的局部缺血、脑、脑干、脊髓、牙组织病症、肾脏疾病、骨髓移植的失败、创伤、勃起障碍、神经性疼痛、亚慢性和慢性炎症、癌症、移植失败；由活性氧和/或自由基和/或氧化氮的过量引起的病症。
59.如权利要求1至49任一项所限定的异肽在制备用于涉及削弱的间隙连接通讯的病理病症预防和/或治疗的药物中的应用，所述预防和/或治疗包括将治疗有效量的所述异肽给药至所需的个体。
60.根据权利要求59的应用，其中的异肽为如权利要求49中所限定的异肽。
61.根据权利要求59的应用，其中的给药为肠胃外给药。
62.根据权利要求59的应用，其中的给药为口服。
63.根据权利要求59的应用，其中的个体为人。
64.根据权利要求59的应用，其中的病理病症选自心血管疾病、气管表皮炎症、肺泡组织的病症、膀胱失禁、受损的听力、内皮损伤、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病变、CNS，即中枢神经系统的局部缺血、脊髓的局部缺血、脑、脑干、脊髓、牙组织病症、肾脏疾病、骨髓移植的失败、创伤、勃起障碍、神经性疼痛、亚慢性和慢性炎症、癌症、移植失败；由活性氧类和/或自由基和/或氧化氮的过量引起的病症。
65.药物组合物，包括权利要求1-49任一项所限定的异肽和药物载体。
66.根据权利要求65的药物组合物，其中的组合物可经肠胃外给药。
67.根据权利要求65的药物组合物，其中的组合物可经口服给药。
全文摘要
本发明涉及能调节胞内间隙连接通讯的异肽。本发明进一步涉及利用该异肽维持或增强所述通讯的方法。在一个方面，异肽为抗心律失常异肽，其靶向由AAP、AAP10、HP5和/或其功能类似物靶向的相同细胞，即异肽能通过激动或拮抗AAP、AAP10、HP5和/或其功能类似物的功能而调节这些细胞的功能。
文档编号A61K38/04GK1976945SQ200480038801
公开日2007年6月6日 申请日期2004年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者比耶内·迪埃·拉森 申请人:惠氏公司